動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)和核移植技術(shù).ppt

1、動(dòng)物細(xì)胞工程常用的技術(shù) 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)：其他動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)的基礎(chǔ)。 動(dòng)物細(xì)胞核移植 動(dòng)物細(xì)胞融合 生產(chǎn)單克隆抗體等,應(yīng)用：燒傷病人皮膚移植?？苟狙澹贵w的獲得）,用培養(yǎng)的人細(xì)胞構(gòu)建的人造皮膚,一動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng),概念：動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)就是從動(dòng)物有機(jī)體中取出相關(guān)的組織,將它分散成單個(gè)細(xì)胞,然后,放在適宜的培養(yǎng)基中,讓這些細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖.,原理：細(xì)胞增殖,培養(yǎng)基：液體,動(dòng)物體細(xì)胞大都生活在液體的環(huán)境,相關(guān)概念 選材： 動(dòng)物胚胎或幼齡動(dòng)物的組織、器官，它們細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，分裂旺盛，分化程度低，容易培養(yǎng)。 分散成單個(gè)細(xì)胞（消化）：在進(jìn)行動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，用胰蛋白酶或膠原蛋白酶分散細(xì)胞，說(shuō)明細(xì)胞間的物質(zhì)主要是蛋

2、白質(zhì)。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)適宜的PH為7.27.4，此環(huán)境下胃蛋白酶（2.0）沒(méi)有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性較高。,補(bǔ)充：胰蛋白酶除了可以消化細(xì)胞間的蛋白質(zhì)外，長(zhǎng)時(shí)間的作用也會(huì)消化細(xì)胞膜蛋白。 動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)特性： 細(xì)胞貼壁：懸液中分散的細(xì)胞很快就貼附在瓶壁上，稱為細(xì)胞貼壁。 要求：培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿的內(nèi)表面光滑、無(wú)毒、易于貼附。 細(xì)胞的接觸抑制：當(dāng)貼壁細(xì)胞分裂生長(zhǎng)到表面相互接觸時(shí)，細(xì)胞就會(huì)停止分裂增殖，這種現(xiàn)象稱為細(xì)胞的接觸抑制。,原代培養(yǎng)：將動(dòng)物組織消化后的初次培養(yǎng)。從機(jī)體取出后立即培養(yǎng)的細(xì)胞為原代細(xì)胞。培養(yǎng)的第1代細(xì)胞與傳10代以內(nèi)的細(xì)胞稱為原代細(xì)胞培養(yǎng)。 傳代培養(yǎng)：將原代細(xì)胞從培養(yǎng)瓶中

3、取出，配制成細(xì)胞懸浮液，分裝到兩個(gè)或兩個(gè)以上的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，稱為傳代培養(yǎng)。 補(bǔ)充：原代培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)，繁殖一定時(shí)間后，會(huì)出現(xiàn)接觸抑制現(xiàn)象，細(xì)胞就會(huì)停止分裂增殖，因此需要重新用胰蛋白質(zhì)酶等處理，進(jìn)行分瓶擴(kuò)大培養(yǎng)，即傳代培養(yǎng)。,動(dòng)物胚胎或幼齡動(dòng)物的組織、器官,胰蛋白酶處理分散成單個(gè)細(xì)胞,10代細(xì)胞,原代培養(yǎng),無(wú)限傳代,部分細(xì)胞的細(xì)胞核型可能發(fā)生變化,遺傳物質(zhì)未改變，保持正常的二倍體核型,細(xì)胞株：傳代細(xì)胞一般傳至10代左右細(xì)胞生長(zhǎng)停滯，大部分細(xì)胞衰老死亡，少數(shù)細(xì)胞存活到40-50代，這種傳代細(xì)胞為細(xì)胞株。 細(xì)胞系：細(xì)胞株傳代至50代后又出現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)停滯狀態(tài)，只有部分細(xì)胞由于遺傳物質(zhì)的改變，使其在

4、培養(yǎng)條件下可以無(wú)限制傳代，這種傳代細(xì)胞為細(xì)胞系。 細(xì)胞株和細(xì)胞系的區(qū)別： 細(xì)胞系的遺傳物質(zhì)改變，具有癌細(xì)胞的特點(diǎn)，失去接觸抑制，容易傳代培養(yǎng)。,動(dòng)物胚胎或幼齡動(dòng)物的組織、器官,胰蛋白酶,單個(gè)細(xì)胞,加培養(yǎng)液,制成,細(xì)胞懸浮液,細(xì)胞株,細(xì)胞系,細(xì)胞增殖,無(wú)限傳代,去掉組織間蛋白,過(guò)程：,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)不能 最終培養(yǎng)成生物體,補(bǔ)充：1為何細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中貼壁生長(zhǎng)？ 細(xì)胞有接觸抑制的現(xiàn)象。 2為何要定期用胰蛋白酶使細(xì)胞從瓶壁上 脫離下來(lái)，為何要攪拌？ 分散成單個(gè)細(xì)胞便于從培養(yǎng)液中獲得營(yíng)養(yǎng)， 排出代謝廢物，利于繼續(xù)培養(yǎng) 3比較動(dòng)物和植物組織培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基的成分。都有糖、氨基酸、促生長(zhǎng)因子、無(wú)機(jī)鹽、微量元素

5、等 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液中還需加入動(dòng)物血清、血漿等天然成分。,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的條件 1無(wú)菌、無(wú)毒的環(huán)境 （對(duì)培養(yǎng)液和所有培養(yǎng)用具進(jìn)行無(wú)菌處理，添加一定量的抗生素，以防止培養(yǎng)過(guò)程中的污染，定期更換培養(yǎng)液，以清除代謝產(chǎn)物，防止細(xì)胞代謝產(chǎn)物積累對(duì)細(xì)胞自身造成危害。）,2營(yíng)養(yǎng) 細(xì)胞體外培養(yǎng)所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與體內(nèi)基本相同。（葡萄糖、氨基酸、促生長(zhǎng)因子、無(wú)機(jī)鹽、微量元素、維生素、動(dòng)物血清等。） 合成培養(yǎng)基：按營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)種類(lèi)及數(shù)量嚴(yán)格配制而成的培養(yǎng)基。 天然培養(yǎng)基：由于科學(xué)家對(duì)細(xì)胞所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)還沒(méi)有完全搞清楚，因此，需加入血清，血漿等一些天然成分。,補(bǔ)充：為什么對(duì)動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)通常要添加血清？ 血清中含有蛋白質(zhì)、氨

6、基酸、葡萄糖、激素等多種營(yíng)養(yǎng)； 還含有多種未知的促細(xì)胞生長(zhǎng)因子、促貼附因子及其他活性物質(zhì)，能促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和貼附。因此，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，一般需添加10%20%的血清。,3溫度和PH 36.50.5度, 7.2-7.4 4氣體環(huán)境： O2和CO2（95%空氣和5% CO2 ）,細(xì)胞的全能性,細(xì)胞株、細(xì)胞系,植物體,培養(yǎng)結(jié)果,獲得細(xì)胞或細(xì)胞產(chǎn)物,快速繁殖、培育無(wú)病毒植株等,培養(yǎng)目的,葡萄糖、動(dòng)物血清,蔗糖、植物激素,培養(yǎng)基特有成分,液體培養(yǎng)基,固體培養(yǎng)基,培養(yǎng)基性質(zhì),細(xì)胞增殖,原理,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng),植物組織培養(yǎng),比較項(xiàng)目,植物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的比較,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用 大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)生物制品（病毒

7、疫苗、干擾素、單克隆抗體） 作為基因工程中的受體細(xì)胞 培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞可以用于檢測(cè)有毒物質(zhì)，判斷某種物質(zhì)的毒性 用于生理、病理、藥理等方面的研究，為治療和預(yù)防疾病提供理論依據(jù),二動(dòng)物體細(xì)胞核移植技術(shù)和克隆動(dòng)物 動(dòng)物細(xì)胞與植物細(xì)胞不同，動(dòng)物細(xì)胞的全能性會(huì)隨著動(dòng)物細(xì)胞分化程度的更高而逐漸受到限制，分化潛能逐漸變?nèi)?。因此，目前還不能用類(lèi)似植物組織培養(yǎng)的方法獲得完整的動(dòng)物個(gè)體，用動(dòng)物體細(xì)胞克隆動(dòng)物，實(shí)際是通過(guò)核移植來(lái)實(shí)現(xiàn)。動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞核具有全能性。,概念：將動(dòng)物的一個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核，移入一個(gè)已經(jīng)去掉細(xì)胞核的卵母細(xì)胞中，使其重組并發(fā)育成一個(gè)新的胚胎，這個(gè)新的胚胎最終發(fā)育成動(dòng)物個(gè)體。 用核移植的方法得到的動(dòng)

8、物稱為克隆動(dòng)物。 類(lèi)型：胚胎細(xì)胞核移植，體細(xì)胞核移植。其中胚胎細(xì)胞分化程度低，恢復(fù)全能性容易，核移植更容易成功。 受體細(xì)胞：M期的卵母細(xì)胞 原理：動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞核的全能性。,誘導(dǎo)方法：物理或化學(xué)方法激活受體細(xì)胞，完成細(xì)胞分裂和發(fā)育進(jìn)程。,取供體細(xì)胞,取卵母細(xì)胞,供體細(xì)胞培養(yǎng),培養(yǎng)到 M中期,卵母細(xì)胞去核,供體細(xì)胞注入去核的卵母細(xì)胞,供體核進(jìn)入受體卵母細(xì)胞,重組胚胎,代孕母牛,生出與供體遺傳物質(zhì)基本相同的個(gè)體,過(guò)程：,1、在畜牧業(yè)中可以加速家畜遺傳改良的進(jìn)程,2、保護(hù)瀕危物種,3、醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域生產(chǎn)醫(yī)用蛋白質(zhì)及組織器官的移植,4、了解胚胎發(fā)育和衰老過(guò)程；追蹤研究疾病的發(fā)展過(guò)程和治療疾病,體細(xì)胞核移

9、植技術(shù)的應(yīng)用前景及克隆動(dòng)物的研究意義：,體細(xì)胞核移植技術(shù)存在的問(wèn)題： 1許多克隆動(dòng)物表現(xiàn)出遺傳和生理缺陷，如體型過(guò)大，異常肥胖，發(fā)育困難，免疫失調(diào)等。 2成功率非常低 3克隆動(dòng)物食品的安全性問(wèn)題。,討論： 1在體細(xì)胞的細(xì)胞核移植到受體卵母細(xì)胞之前，為什么必須先去掉受體卵母細(xì)胞的核？ 為使核移植的胚胎或動(dòng)物的遺傳物質(zhì)全部來(lái)自有重要利用價(jià)值的動(dòng)物提供的體細(xì)胞，在供體細(xì)胞的細(xì)胞核移至受體細(xì)胞之前，必須將受體細(xì)胞的遺傳物質(zhì)去掉或?qū)⑵淦茐摹?2用于核移植的供體細(xì)胞一般都選用傳代10代以內(nèi)的細(xì)胞，想一想，這是為什么？ 培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞一般當(dāng)傳代至1050代左右時(shí)，部分細(xì)胞核型可能會(huì)發(fā)生變化，其細(xì)胞遺傳物質(zhì)可

10、能會(huì)發(fā)生突變，而10代以內(nèi)的細(xì)胞一般能保持正常的二倍體核型。因此，在體細(xì)胞核移植中，為了保證供體細(xì)胞正常的遺傳基礎(chǔ)，通常采用傳代10代以內(nèi)的細(xì)胞。,3你認(rèn)為用上述體細(xì)胞核移植方法生產(chǎn)的克隆動(dòng)物，是對(duì)體細(xì)胞供體動(dòng)物進(jìn)行了100%的復(fù)制嗎？為什么？ 絕大部分DNA來(lái)自于供體細(xì)胞核，但其核外還有少量的DNA，即線粒體中的DNA是來(lái)自于受體卵母細(xì)胞。 此外，即便動(dòng)物的遺傳基礎(chǔ)完全相同，但動(dòng)物的一些行為、習(xí)性的形成與所處環(huán)境有很大關(guān)系，核供體動(dòng)物生活的環(huán)境與克隆動(dòng)物所生活的環(huán)境不會(huì)完全相同，其形成的行為、習(xí)性也不可能和核供體動(dòng)物完全相同，從這一角度看，克隆動(dòng)物不會(huì)是核供體動(dòng)物100%的復(fù)制。,思考與探究

11、 2動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)要經(jīng)過(guò)脫分化的過(guò)程嗎？為什么？ 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)不需經(jīng)過(guò)脫分化過(guò)程。因高度分化的動(dòng)物細(xì)胞發(fā)育潛能變窄，失去了發(fā)育成完整個(gè)體的能力，所以，動(dòng)物細(xì)胞也就沒(méi)有類(lèi)似植物組織或細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)的脫分化過(guò)程了。要想使培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞定向分化，通常采用定向誘導(dǎo)動(dòng)物干細(xì)胞，使其分化成所需要的組織或器官。,31997年，美國(guó)威斯康星州的一個(gè)奶牛場(chǎng)有一頭名叫盧辛達(dá)（Lucinda）的奶牛，年產(chǎn)奶量為30.8 t，創(chuàng)造了世界奶牛產(chǎn)奶量最高新紀(jì)錄。目前世界各國(guó)高產(chǎn)奶牛場(chǎng)奶牛，年平均產(chǎn)奶量一般為十幾噸，而我國(guó)奶牛產(chǎn)奶量年平均水平僅為34 t。 （1）能利用體細(xì)胞核移植技術(shù)克隆高產(chǎn)奶牛盧辛達(dá)嗎？請(qǐng)說(shuō)明理由。,可以。盧

12、辛達(dá)的產(chǎn)奶量很高，有高產(chǎn)奶的遺傳基礎(chǔ)，利用盧辛達(dá)的體細(xì)胞克隆的奶牛其遺傳物質(zhì)基本上全部來(lái)自該奶牛，其克隆牛具有高產(chǎn)的遺傳基礎(chǔ)，如果精心培育和飼養(yǎng)，有可能在世界范圍內(nèi)推廣，克隆牛再與高產(chǎn)的公牛自然繁殖，可得到很多高產(chǎn)的后代，從而加快奶牛改良進(jìn)程。 該克隆牛不能無(wú)限制地推廣，其數(shù)量不宜過(guò)多，尤其是在小范圍內(nèi)不能無(wú)限的繁殖，以避免奶牛群出現(xiàn)近親繁殖而引起種質(zhì)衰退。,（2）如果將克隆高產(chǎn)奶牛盧辛達(dá)的任務(wù)交給你，你將如何對(duì)它進(jìn)行克?。?從盧辛達(dá)耳朵（也可用別的組織、器官，耳朵在活體上容易?。┥霞羧∫恍K組織，在體外培養(yǎng)獲得該組織（如軟骨組織）的細(xì)胞。從屠宰場(chǎng)取廢棄的牛卵巢，抽取卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)成熟。用顯

13、微針去除卵母細(xì)胞的核，再將耳細(xì)胞注入卵母細(xì)胞，用電刺激方法使卵母細(xì)胞與體細(xì)胞融合，這時(shí)供體核就進(jìn)入了受體卵母細(xì)胞，再用電刺激或化學(xué)物質(zhì)激活注入了體細(xì)胞核的卵母細(xì)胞，使其完成減數(shù)分裂和發(fā)育過(guò)程。核移植胚胎在體外短時(shí)間培養(yǎng)后，挑選正常卵裂的胚胎植入經(jīng)同期發(fā)情處理的受體母牛體內(nèi)。,4體細(xì)胞核移植技術(shù)在研究和應(yīng)用上還存在什么問(wèn)題？請(qǐng)你查閱資料，了解這方面的前沿動(dòng)態(tài)。 研究方面：克隆動(dòng)物基因組重新編程的機(jī)制尚不清楚，克隆技術(shù)效率低，克隆動(dòng)物畸形率高、死亡率高、易出現(xiàn)早衰等問(wèn)題。這些問(wèn)題尚在研究中。 應(yīng)用上：生產(chǎn)克隆動(dòng)物費(fèi)用昂貴，距大規(guī)模應(yīng)用還有一定距離。,1.下列哪項(xiàng)屬于克?。?） A將雞的某個(gè)DNA片

14、段整合到小鼠的DNA分子中 B將抗藥菌的某基因引入草履蟲(chóng)的細(xì)胞內(nèi) C將鼠骨髓瘤細(xì)胞與經(jīng)過(guò)免疫的脾細(xì)胞融合成雜交瘤 細(xì)胞 D將某腫瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)繁殖成一個(gè)細(xì)胞系,D,2.（多選）美國(guó)杜克大學(xué)醫(yī)療中心的一個(gè)研究小組利用 成年豬的動(dòng)脈血管細(xì)胞和模擬胚胎環(huán)境的新型生物反應(yīng) 器,成功地在實(shí)驗(yàn)室里培育出新的動(dòng)脈血管，這種血管的 外形和功能都與真的血管一樣,這一研究成果是生物組織 培養(yǎng)領(lǐng)域的重大進(jìn)展。下列關(guān)于以上技術(shù)的敘述中，正 確的是（ ） A屬于“克隆” B可能要利用去核卵細(xì)胞 C關(guān)鍵是激發(fā)血管細(xì)胞的全能性 D關(guān)鍵是激發(fā)血管細(xì)胞發(fā)育成血管的潛能,ABD,3 .從母羊甲的體細(xì)胞中取出細(xì)胞核，注入到母羊乙去掉 核的卵細(xì)胞中，融合后的細(xì)胞經(jīng)卵裂形成早期胚胎，再植 入到另一只母羊丙的子宮內(nèi)，出生小羊的大多數(shù)性狀 （ ） A、難以預(yù)測(cè) B、像甲 C、像乙 D、像丙 4.生物技術(shù)的發(fā)展速度很快，已滅絕生物的“復(fù)生”將不再 是神話。如果世界上最后一只野驢剛死亡，以下較易成功 “復(fù)生”野驢的方法是 （ ） A將野驢的體細(xì)胞取出，利用組織培養(yǎng)技術(shù)，經(jīng)脫分 化、再分化，培育成新個(gè)體 B將野驢的體細(xì)