生化反應(yīng)曲線資料.ppt

1、生化反應(yīng)曲線,生化分析基本原理,生化反應(yīng)曲線,內(nèi)容概況,羅氏生化分析系統(tǒng)產(chǎn)品線,Cobas 6000 (c501) 600T/H,Modular D 2400T/H,Modular P 800T/H,Cobas c311 300T/H,Cobas c111 180T/H,Cobas 8000 2000T/H,cobas 8000 模塊化組合分析系統(tǒng) 智能、高效、強(qiáng)勁,物質(zhì)對(duì)光吸收的基本定律 Lambert- Beer定律,LambertBeer定律表達(dá)為: 當(dāng)一束平行的單色光通過(guò)含有均勻吸光物質(zhì)的溶液時(shí),溶液的吸光度(A)與溶液的濃度(C)和光透過(guò)液層厚度(L)的乘積成正比。物質(zhì)對(duì)光吸收的吸光

2、系數(shù)（e）為常數(shù)。 其數(shù)學(xué)表達(dá)式：A = e*C*L,I,入射光,透射光,I0,=,=,-光吸收的基本定律,=,light detector,根據(jù)Lambert- Beer定律來(lái)計(jì)算待測(cè)物濃度 如若吸光系數(shù) ( )未知，我們就需要采用定標(biāo)曲線 來(lái)計(jì)算待測(cè)物的濃度。,Concx = Absx x Concs Abss Concx = 待測(cè)樣本濃度 Concs = 標(biāo)準(zhǔn)品濃度 Absx = 樣本吸光度 Abss = 標(biāo)準(zhǔn)品吸光度,此值為定值,Lambert-Beer 定律 適合于任何均勻非散射的介質(zhì),生化比色分析,特定蛋白透射比濁分析,Lambert-Beer 定律,分光光度法定量分析的依據(jù),Ro

3、che Hitachi Photometer,當(dāng)相應(yīng)的比色杯每一次通過(guò)光路系統(tǒng)時(shí)，光路系統(tǒng)會(huì)測(cè)量并記錄下相應(yīng)的吸光度 光路系統(tǒng)可以測(cè)量后分光后12個(gè)波長(zhǎng)的相應(yīng)吸光度。 12 有效波長(zhǎng): 340, 376, 415, 450, 480, 505, 546, 570, 600, 660, 700, 800nm 多數(shù)檢測(cè)項(xiàng)目都使用雙波長(zhǎng)檢測(cè)方法。（可去除干擾物對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響）,Reaction sequence,儀器讀數(shù)的原理,不同儀器每個(gè)循環(huán)周期的時(shí)間間隔 Modular P 18秒 Cobas c702 16秒 Cobas C501 8秒 Modular D 12秒 C311 12秒,反應(yīng)轉(zhuǎn)盤

4、不停的周期旋轉(zhuǎn),當(dāng)相應(yīng)的比色杯通過(guò)光路系統(tǒng)時(shí)，光路系統(tǒng)會(huì)測(cè)量并記錄下相應(yīng)的吸光度,在不同的時(shí)間點(diǎn)加入相應(yīng)的反應(yīng)試劑,Reaction sequence,Instrument cycle,Endpoint and rate (kinetic) assays,自動(dòng)生化分析常用的方法有:,終點(diǎn)法（End Point Assays）：一般在整個(gè)反應(yīng)完成后再來(lái)檢測(cè)吸光度 速率法（Rate assays） ：一般在反應(yīng)的過(guò)程中監(jiān)測(cè)吸光度的變化情況,終點(diǎn)分析法,時(shí)間,吸光度,A 1,t,S+R1,基于 被測(cè)物質(zhì)在反應(yīng)過(guò)程中到達(dá)反應(yīng)終點(diǎn)或平衡點(diǎn)，根據(jù)該點(diǎn)吸光度的大小求出被測(cè)物濃度，稱為終點(diǎn)法。,終點(diǎn)法的計(jì)算：

5、 從時(shí)間-吸光度曲線來(lái)看，到達(dá)反應(yīng)終點(diǎn)時(shí)，吸光度將不再變化。在達(dá)到終點(diǎn)時(shí)任取一點(diǎn)進(jìn)行測(cè)定，此時(shí)底物和產(chǎn)物的量都不再變化。,吸光度,A 1,S+R1,吸光度,兩點(diǎn)終點(diǎn)法（2-point end） 一點(diǎn)終點(diǎn)法 （1-point end） 一點(diǎn)終點(diǎn)單試劑（1-point endpoint assay one reagent） 一點(diǎn)終點(diǎn)雙試劑（1-point endpoint assay two reagents） 三點(diǎn)終點(diǎn)法（3-point end）,終點(diǎn)分析法（Endpoint assays）,兩點(diǎn)終點(diǎn)法,在被測(cè)物反應(yīng)或指示反應(yīng)尚未開(kāi)始時(shí)，選擇第一個(gè)吸光度，在反應(yīng)到達(dá)終點(diǎn)或平衡時(shí)選擇第二個(gè)吸光度，

6、此兩點(diǎn)吸光度之差用于計(jì)算結(jié)果。,去除了樣本的本底 采用兩個(gè)測(cè)量點(diǎn) 針對(duì)兩個(gè)或多個(gè)試劑的項(xiàng)目 第一個(gè)讀數(shù)點(diǎn)一般選在添加最后一個(gè)試劑之前 第二個(gè)讀數(shù)點(diǎn)一般選在加入最后一個(gè)試劑之后且已經(jīng)達(dá)到了反應(yīng)終點(diǎn),兩點(diǎn)終點(diǎn)法的特點(diǎn),Endpoint assays,兩點(diǎn)終點(diǎn)法的反應(yīng)曲線Cobas c702,Endpoint assays,Sample+R1,Mp1 abs before addition of R3,Mp2 abs at reaction end,兩點(diǎn)讀數(shù)的時(shí)間點(diǎn): 第19點(diǎn)測(cè)量包含了樣本和試劑1的本底 sample + reagent 1 第 38點(diǎn)在加入所有試劑后，反應(yīng)達(dá)到終點(diǎn) sample

7、+ reagent 1+ reagent 2,兩點(diǎn)終點(diǎn)法的應(yīng)用參數(shù) Cobas c702,2Point Endpoint assay application settings,RF-II C4 C3 ASL CRPL IGG IGA IGM,兩點(diǎn)終點(diǎn)法分析項(xiàng)目舉例,Endpoint assays,一點(diǎn)終點(diǎn)法,A單試劑一點(diǎn)終點(diǎn)法 例如:CHOL/TG.,在反應(yīng)到達(dá)終點(diǎn)，即在時(shí)間-吸光度曲線上吸光度不再改變時(shí)選擇一個(gè)終點(diǎn)吸光度值，用于計(jì)算結(jié)果。,B雙試劑一點(diǎn)終點(diǎn)法 Mg(雙試劑),單試劑一點(diǎn)終點(diǎn)法的特點(diǎn)（1-point endpoint assay one reagent） 不包含樣本的本底 僅進(jìn)

8、行一個(gè)點(diǎn)的測(cè)量 檢測(cè)項(xiàng)目舉例：甘油三酯（TG）,Endpoint assays,單試劑一點(diǎn)終點(diǎn)法的反應(yīng)曲線1-point endpoint assay one reagents,Endpoint assays,不包含樣本的本底 僅進(jìn)行一點(diǎn)測(cè)量 應(yīng)用項(xiàng)目舉例： Magnesium 不采用兩點(diǎn)終點(diǎn)法主要是樣本和R1體積相加仍180uL(最小反應(yīng)體積，無(wú)法測(cè)量）,雙試劑一點(diǎn)終點(diǎn)法的特點(diǎn)（1-point endpoint assay two reagents）,1st entry: 方法類型 2nd entry:總分析時(shí)間 3rd - 6th entry:測(cè)量點(diǎn),一點(diǎn)終點(diǎn)法應(yīng)用參數(shù)（1 Point E

9、ndpoint assay）,Utility - Application - Analyze,TRIGL CHO,一點(diǎn)終點(diǎn)法分析項(xiàng)目舉例,Endpoint assays,例如,多項(xiàng)同測(cè)組合試劑盒,CHO與TG同一測(cè)定,即雙終點(diǎn)法,在一個(gè)通道內(nèi)一次進(jìn)行兩項(xiàng)反應(yīng)相關(guān)的終點(diǎn)法測(cè)定.,三點(diǎn)終點(diǎn)法,上升 increasing 或 下降decreasing,終點(diǎn)法反應(yīng)的方向（Reaction Direction）,速率法,吸光度,t,t2,t1,t3,t4,A1,A2,A3,S+R,時(shí)間,A 1,利用線性反應(yīng)期，計(jì)算出單位時(shí)間的吸光度變化A/min，來(lái)計(jì)算酶的活性。,單位時(shí)間的吸光度變化量是一致的,在酶促

10、反應(yīng)過(guò)程中,在反應(yīng)速度恒定期(線性反應(yīng)期)來(lái)連續(xù)觀察和記錄一定 反應(yīng)時(shí)間內(nèi)底物或代謝產(chǎn)物變化速度的化學(xué)方法.,速率A法 （Rate A） 兩點(diǎn)速率法（2-point Rate）,速率法（Endpoint assays）,速率A法,A 單試劑速率法 例如:ACPAFU,B 雙試劑速率法 例如:ALTASTCK,在較長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間區(qū)段內(nèi),每隔一定時(shí)間讀取一次吸光度值,至少讀取4點(diǎn),得到3個(gè)A,求出單位時(shí)間的反應(yīng)速率 A/min . 通過(guò)最小二乘法（least squares method）,Rate A assay Modular P,Reag. at R3 timing,Rate assays,G

11、OT/ASTGGT GPT/ ALT Lipase ALPGLDH AmylaseLDH CHE CKMB,速率A 法-分析項(xiàng)目舉例,Rate assays,2點(diǎn)速率法,2點(diǎn)速率法,尿素氮,指在時(shí)間-吸光度曲線上選擇兩個(gè)測(cè)光點(diǎn)，此兩點(diǎn)既非反應(yīng)初始吸光度亦 非終點(diǎn)吸光度，這兩點(diǎn)的單位時(shí)間吸光度差值用于結(jié)果計(jì)算。,2-point Rate assay,Rate assays,Enzyme,采用一種或多種試劑 檢測(cè)兩個(gè)測(cè)量點(diǎn)檢測(cè)固定的間隔時(shí)間內(nèi)兩點(diǎn)的吸光度變化。 換算成 Abs/min參與計(jì)算 在加入最后最后一個(gè)試劑之后進(jìn)行吸光度檢測(cè)。,兩點(diǎn)速率法的特點(diǎn)2-point Rate assay,Rate

12、 assays,2-point Rate assay Modular P,Rate assays,Ammonia Acid phosphataseNon-prostatic phosphatase Urinary/CSF protein Bicarbonate Urea,Rate assays,2點(diǎn)速率 法-分析項(xiàng)目舉例,Reaction Direction,上升decreasing 或 下降increasing,生化反應(yīng)曲線,Thank you for your attention,Roche Diagnostics (Shanghai) Limited Shanghai 200031 China,This presentation is our intellectual property. Without our written consent, it shall neither be copied in any manner, nor used for manufacturing, nor communicated to third parties.,COBAS and LIFE NEEDS ANSWERS ar