脆性X綜合征診斷與治療新進展.ppt

1、脆性X綜合征診斷與治療新進展,脆性X綜合征( fragile X syndrome ,FXS)是引起先天性智力低下的常見疾病，新生兒發(fā)生率為0.40.67，占X連鎖智力低下病人的1/21/3。男性發(fā)病率約為1/4000，女性發(fā)病率約為1/60001/8000，前突變的攜帶者在男性中約為1/800，而在女性中則高達1/1001/200。,FXS發(fā)病率僅次于先天愚型，占智力低下的2%,估計20IQ水平3055之間的男性患有該病。給家庭和社會帶來沉重的負擔。同時FXS具有家族遺傳性且臨床表現(xiàn)復雜。為臨床診斷和治療帶來了極大的困難。,FXS是一種單基因遺傳性疾病 ，是由于Xq2.7.3的脆X智力低下1

2、 (fragile X mental retardation 1 ,FMR1)基因突變導致其5端(CGG)n三核苷酸重復序列異常擴增，當擴增達到一定數(shù)目后便會出現(xiàn)該基因異常甲基化,使FMR1基因的轉(zhuǎn)錄功能降低,導致其編碼的脆X智力低下蛋白(fragile X mental retardation protein ,FMRP) 減少,引起相應的癥狀。,FXS臨床癥狀常表現(xiàn)為不同程度的智力低下和發(fā)育延遲，男性患者平均IQ在中度以下，20%男性患者IQ水平在30-50之間。女性患者受累較男性為輕，智力低下常不嚴重，在輕度至臨界范圍。青春期前的男性患者表現(xiàn)多樣：逃避行為，逃避注視、孤僻癥、過度興奮、注

3、意力不集中或多動癥、動作刻板、睡眠紊亂、語言發(fā)育也常受影響，多有輕度交流障礙；,軀體特征在不同年齡、不同個體中差異較大，成年男性患者可有特殊面容：臉型狹長、大耳朵、眉弓及下頜突出，上述表現(xiàn)可隨年齡的增加而愈加明顯。但有時即使是受累嚴重的典型未成年男性患者其面部特征也可表現(xiàn)輕微，往往難以引起人們的注意。,1 FXS臨床診斷方法新進展,FXS 是由于FMR-1基因5端(CGG) n 重復系列大量擴展的結(jié)果，如果(CGG) n重復上升到230 至1000 次之間，就會產(chǎn)生FXS。目前對于脆性X綜合征的診斷主要依賴于實驗室檢查。,根據(jù)2005年最新ACMG指南對于以下幾種臨床情況應進行分子生物學檢測：

4、 智力缺陷, 發(fā)育遲緩, 性格孤僻, 行為體征疑為脆性X綜合征者； 具有不明原因的智力障礙者； 具有脆性X綜合征家族史者； 具有脆性X綜合征或不明原因智力缺陷家族史，生育前進行遺傳咨詢者； 脆性X綜合征攜帶者母親的胎兒； 卵胞刺激素升高并伴有卵巢早衰的婦女，特別是具有不明原因智力缺陷家族史者； 未明原因的新發(fā)震顫/小腦性共濟失調(diào)患者，特別是伴有不明原因的智力缺陷家族史者。,FXS實驗室診斷方法有細胞遺傳學、Southern印跡雜交、聚合酶鏈反應（PCR）、 RT-PCR和免疫組化分析,11細胞遺傳學檢測,該方法至盡今已發(fā)展成熟。診斷的重要指標：培養(yǎng)中期細胞染色體Xq2.7顯示脆性位點大于4%為

5、陽性。甲氨蝶呤或5-氟脫氧尿苷可誘導出脆性位點提高顯現(xiàn)率，與原位雜交熒光技術(shù)結(jié)合可分析檢測數(shù)量和結(jié)構(gòu)的異常并提高圖譜分辨率至10萬bp。fra(X)并不是在所有的中期細胞中都能找到，標本來源于外周淋巴細胞、羊水、絨毛或臍血。一般智力低下男性患者fra(X)的表達率為10%30%。年齡較大、表型正常的女性攜帶者可不表達，表達常低于5%。故不用于對表型正常的女性攜帶者的診斷。該法費時費力、檢出率低于50%，且只能對男性患者及部分女性患者做出診斷，不能檢出不全顯性患者及女性雜合子，對于男性患者也易產(chǎn)生假陰性。所以應用較局限。,12 Southern印跡雜交法,FXS5端的（CGG）n的異常擴增及Cp

6、G島異常甲基化使其上的特異性酶切位點消失，需用限制性核酸內(nèi)切酶識別、結(jié)合并切割特異性序列，產(chǎn)生不同長度的核酸片段，用于診斷。根據(jù)待測片段的大小選擇合適內(nèi)切酶。全突變使用HindIII或EcoRI可得到很強的雜交信號，不完全突變需使用PstI方可產(chǎn)生清晰的高分辨條帶。,目前認為應用較遠側(cè)探針（StB12.3）對雙酶解（如EcoRI/EagI）DNA樣本進行雜交，可檢出全部前突變和全突變等位基因及嵌合體狀態(tài)，同時可了解甲基化狀態(tài)，是最可靠的診斷方法。Southern印跡雜交法缺點為：需要DNA樣品多、需要同位素標記、操作復雜、費用大、耗時長、不易推廣；若酶解不完全會產(chǎn)生雜交帶，可產(chǎn)生錯誤診斷；較難

7、鑒別(CGG)n大的正常個體和小的前突變個體；有較大的漏診率和約5 %的誤診率。,13聚合酶鏈反應技術(shù),為目前快速、準確檢測（CGG）n重復的方法，傳統(tǒng)的聚合酶鏈反應 (Polymerase Chain Reaction,PCR)技術(shù)可以檢測正常個體及小片段的前突變等位基因的（CGG）n重復數(shù)。對于較長片段的前突變及全突變患者，由于高的GC含量，序列內(nèi)部易于形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)不易擴增，可利用甲基化敏感性聚合酶鏈反應（methylation sensitive Polymerase Chain Reaction ;ms-PCR），引入特異性的引物使擴增不出來的等位基因產(chǎn)生smear條帶，通過不同的探針

8、標記引物，利用毛細管電泳法檢測PCR擴增產(chǎn)物，可以準確的檢測（CGG）n重復數(shù)。結(jié)合普通PCR及ms-PCR技術(shù)，可以鑒別正常個體、前突變、全突變男性及全突變女性。由于PCR技術(shù)優(yōu)先擴增較小片段的等位基因，因此對于呈嵌合型的患者，也會產(chǎn)生PCR擴增產(chǎn)物，易于產(chǎn)生假陰性。PCR技術(shù)是快速篩查脆性X綜合征的基因診斷方案。難以擴增出全突變的等位基因，因此限制了它對于脆性X綜合征患者臨床診斷方面的應用，PCR技術(shù)和Sothern blot技術(shù)的聯(lián)合應用，可以彌補相互之間的缺陷。,14 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應技術(shù),絕大多數(shù)FXS征男性患者無FMR1基因的表達，而女性患者的FMR1基因是雜合的，F(xiàn)MR1基因表

9、達降低，但可檢測到。所以RT-PCR在男性患者、缺失或點突變的個體是檢測不到擴增引物，而對于正常個體、前突變及女性可以獲得擴增條帶。Hmadcha A等用RT-PCR方法檢測該FMR1基因的表達。 Wu LQ等設(shè)計合成了2對特異性引物檢測位于X 染色體上的HPRT基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，通過巢式PCR技術(shù)對cDNA進行擴增、檢測。有助于FRAX患者的診斷及表型的預測，對于遺傳咨詢有較大的幫助，不能鑒別女性患者及檢測前突變狀態(tài)，從而應用有限。,15 FMRP免疫組化分析,應用此方法檢測FMRP的表達量?？稍\斷由于（CGG）n的擴增導致的脆性X綜合征患者，及檢出由于缺失、點突變導致FMR1基因不表達的患者

10、，同時簡便、經(jīng)濟、快速，適用于群體篩查，其敏感性100%，特異性97.5%。但由于女性患者體內(nèi)有一定比例的活性X染色體，且具有全突變的等位基因多位于失活的X染色體，大多數(shù)淋巴細胞的FMRP降低不明顯，易于形成假陰性，且由于前突變等位基因能正常轉(zhuǎn)錄，F(xiàn)MRP表達多在正常范圍內(nèi)，亦不適用于前突變攜帶者的篩查，因此僅適用于男性患者的診斷。Rife M等比較了PCR和FMRP免疫組化檢測在人群篩檢方面的差別，認為PCR是最合適、方便、省時的方法。但對于那些PCR檢測失敗的患者，推薦應用該方法。,16 產(chǎn)前診斷,2005年ACMG指南建議妊娠10-12周的FXS攜帶者婦女用絨毛膜絨毛標本，可顯示前突變。

11、CVS細胞不同于外周血細胞，它不存在甲基化的X染色體失活，全突變的FMR1基因5-UTR的三核苷酸（CGG）n重復序列甲基化也可有可無。利用FMR1基因甲基化和X染色體失活診斷全突變有失準確性。若CVS結(jié)果陽性，應于妊娠15周抽取羊水細胞排除全突變和嵌合體狀態(tài)。,2 FXS治療新進展,目前無有效的治療方法。近來在FXS的治療中最明顯的進步就是在動物實驗中認識到了FXS潛在的缺陷和發(fā)展了的可能的治療。,2、1 一般治療,葉酸可以“修復”FXS細胞傳代時的脆性位點,使FMR基因表達功能正常的FMRP,改善智力狀況。同時還可予維生素C、維生素E、微量元素鋅、硒等。智低者營養(yǎng)腦細胞,茴拉西坦、吡拉西坦

12、、胞二磷膽堿等可改善癥狀。癲癇可按發(fā)作類型正規(guī)抗癲癇治療。中醫(yī)中藥療法,應用加味六味地黃丸培補腎元,針灸推拿促進智力發(fā)育,改善小兒癡呆。治療效果與患兒年齡和原發(fā)神經(jīng)疾病有關(guān)。16歲智低和癡呆患兒年齡較大效果不佳,癲癇患兒服藥不規(guī)范控制不良。,2、2真對于FMRP表達減少的治療,2、2、1 針對FMR1的基因治療 FMR1突變導致FMRP減少引起FXS的發(fā)生，F(xiàn)MRP是一種 mRNA綁定蛋白，其在中樞mRNA 翻譯、轉(zhuǎn)運及靶向作用中起重要作用。FMRP負相調(diào)控mRNA翻譯為蛋白質(zhì).Rattazzi等提出基因治療的可能性，通過給Fmr1 KO小鼠注射一種小的、可擴散的帶有FMR1 cDNA基因的腺

13、伴隨病毒，此病毒包含 5啟動子區(qū)和 3 非翻譯區(qū)的基因，通過滲透作用通過血腦屏障，從而傳遞Fmr1 cDNA進入大腦。 Musumeci 等發(fā)現(xiàn)在Fmr1 KO小鼠予以人類FMR1基因和FMR1 cDNA治療，和野生型FMR1小鼠比較聽源性癲癇的易感性，由于聽源性癲癇具有年齡易感性，所以在不同的年齡檢測，發(fā)現(xiàn)聽源性癲癇在6 個月大的小鼠可以完全治愈 ，而在成年小鼠僅可部分治愈。,2、2、2 FMRP蛋白的添加治療,最近文獻報道：蛋白轉(zhuǎn)導領(lǐng)域能夠轉(zhuǎn)導大分子蛋白進入細胞甚至進入大腦。來自人免疫缺陷癥病毒的A蛋白：TatFMRP融合蛋白，利用腹腔注射可以傳遞大分子進入細胞并通過血-腦屏障。置入FXS

14、成纖維細胞和FmrKO小鼠的初級培養(yǎng)物神經(jīng)元，F(xiàn)MRP蛋白的攝取效率和水平在神經(jīng)元比期望的要低的多。,另外，F(xiàn)MRP蛋白是否有毒被質(zhì)疑 。同時運用免疫組織化學發(fā)現(xiàn)運用轉(zhuǎn)導蛋白介導的FMRP在成纖維細胞中攝取的效率和速率比預想的低，神經(jīng)元攝取率更低。同時FMRP的濃度也需要嚴格控制，超過生理水平或較高水平可能導致mRNAs的不適當?shù)姆g，F(xiàn)MRP轉(zhuǎn)基因的過度表達在FmrKO小鼠導致嚴重的行為異常甚至有害的作用。同時FMRP精確的表達需要技術(shù)的引入。,現(xiàn)在基因治療可能不是FXS治療最好的方法.人類脆性X染色體相關(guān)基因FMR基因包括FXR1基因和FXR2基因。分別定位于X .q27.3，3q28和1

15、7p13.1。它們分別翻譯蛋白FMRP, FXR1P和 FXR2P，這三種蛋白主要存在于細胞漿中在脊椎動物中表達廣泛，F(xiàn)MRP在大腦和睪丸中表達最高，F(xiàn)XR1P主要在于橫紋肌表達，但未發(fā)現(xiàn)FMRP和 FXR2P在橫紋肌中表達，至今還沒有發(fā)現(xiàn)FXR1和FXR2與任何病理缺陷相關(guān)。但由于由于FMR1基因突變導致其編碼的FMRP蛋白減少導致FXS，同時FXR1P和FXR2P是否會在由于FMR1突變導致的FXS中起到補償作用，至少部分補償，至今還是一個未知話題。,2、3 L型Ca2+通道阻滯劑的治療作用,FMRP蛋白與mRNAs的轉(zhuǎn)錄和翻譯有關(guān)，靶mRNAs水平在FXS腦區(qū)沒有改變，但是由靶mRNAs

16、轉(zhuǎn)錄的蛋白L-型Ca2+通道亞單位和 MAP1B在特殊腦區(qū)下調(diào)，提示FXS靶編碼蛋白的表達有缺陷。L-型Ca2+通道參加記憶突觸的形成。2003年Veng等發(fā)現(xiàn)Ca2+通過L-型電壓敏感Ca2+通道增加造成成年小鼠的海馬CA1 區(qū)的Ca2+增加，通過L-型Ca2+通道的Ca2+注入可能對記憶的形成有害。利用L-型電壓敏感Ca2+通道拮抗劑尼莫地平長期治療與年齡相關(guān)的操作記憶缺陷和海馬a蛋白的增高，尼莫地平可改善年齡相關(guān)的操作記憶缺陷和降低海馬a蛋白的表達。海馬CA1區(qū)與年齡相關(guān)的操作記憶減退及a蛋白的增加與記憶缺陷相關(guān)。其中年齡可能起到重要的作用在記憶減退的形成中。,2、4親代謝性谷氨酸鹽受體

17、5(metabotrop ic glutamate recep tor 5, mGluR5) 拮抗劑的應用,mGlu5受體主要在皮質(zhì)、髓紋、海馬、小腦表達。mGluR5激動劑能使實驗動物產(chǎn)生脆性X綜合征相似的病理改變和臨床癥狀。 mGluR5抑制劑能夠部分逆轉(zhuǎn)脆性X綜合征模型動物的異常行為。提示mGluR5信號的過度活動可能參與脆性X綜合征的發(fā)病。FMRP是一種mRNA結(jié)合蛋白,可作為翻譯抑制因子負性調(diào)節(jié)突觸后膜mRNA的翻譯和表達。因此推測FMRP缺乏和減少可能導致mGluR5激發(fā)的mRNA翻譯增多,參與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的蛋白過度表達及影響樹突棘的發(fā)育。,最近的研究表明在培養(yǎng)的普通大鼠海馬神經(jīng)元

18、中加入mGLUR5激動劑DHPG,樹突棘表現(xiàn)出類似FMR1 KO小鼠的形態(tài)異常。利用mGLUR5抑制劑：如2-甲基-6-苯基嘧啶（2-methyl-6-(phenylethynyl)pyridine MPEP）治療、較低濃度的MPEP和另外幾種不同的mGluR拮抗劑分別用于減低mGluR活性，可回復FXS模型的先天的求偶行為. Parnass 等報道MPEP可使樹突棘的形態(tài)在適當外界干預的條件下數(shù)分鐘內(nèi)就發(fā)生改變。MPEP可以改善FMR1 KO小鼠的激越癥狀：癲癇和焦慮。及孤獨癥。也許還可以改善認知障礙。,2、 5 糖原合成酶激酶-3（glycogen synthase kinase-3 GS

19、K3）抑制劑的應用,并用mGluR5拮抗劑和GSK3抑制劑沒有壘加作用。相反表現(xiàn)為它們的同步激活，用于抑制mGluR5的同時也導致了GSK3的抑制.推測GSK3可能是FXS病理學的一個基本的中間步驟。具有重要的治療可能性29。FMR1 KO小鼠GSK3活性的增高為FXS治療提供了可能的代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵部位。GSK3是一種普遍存在的絲氨酸-蘇氨酸激酶,在哺乳動物具有GSK3和GSK3兩種亞型，在許多細胞中GSK3對基因表達、細胞構(gòu)建和程序性死亡具有重要的調(diào)節(jié)作用。由于許多細胞功能受都GSK3的影響, 因此要求其活性需要精密的調(diào)節(jié)。GSK3活性最重要的調(diào)節(jié)機制為絲氨酸-21和絲氨酸-9的磷酸化,由此大大抑制GSK3的活性。,FMR1 KO小鼠的大腦的幾個區(qū)域發(fā)現(xiàn)重要的中樞代謝調(diào)節(jié)酶GSK3出現(xiàn)過度激活，GSK3抑制劑鋰鹽可以恢復FSX小鼠突變體表型。例如鋰鹽可以抑制聽原性癲癇的發(fā)作。鋰鹽為一種抗精神病藥，主要用于治療情感障礙，可以抑制GSK3，而對其他蛋白無影響。并且它的使用與年齡關(guān)系不大，即使出生后一個月開始用藥，一旦停藥癥狀就會復發(fā)。這與mGluR5拮抗劑MPEP不同。優(yōu)點在于人們對鋰鹽的應用史較長，積累的經(jīng)驗豐富，價格低廉，容易獲得。但鋰鹽容易導致肥胖，且孕婦和哺乳婦女應用可導致嬰兒