組織學與胚胎學的研究方法.ppt

1、組織胚胎學-人體發(fā)育和功能組織學,組胚教研室 王海濤,歡迎大家學習,組織學與胚胎學的早期研究和發(fā)展 現(xiàn)代組織學與胚胎學的研究和發(fā)展 我國組織學和胚胎學的研究和發(fā)展 組織學與胚胎學的研究方法,內(nèi)容提要,組織學(histology)：研究機體微細結(jié)構及其相關功能的科學 胚胎學(embryology)：研究個體發(fā)生發(fā)育及其有關機制的科學 基礎：細胞學 研究方法：顯微鏡觀察 研究水平：細胞、亞細胞 在發(fā)展歷程中，二者的研究內(nèi)容相互交叉和推進 組織胚胎學(histo-embryology)：人體發(fā)育和功能組織學,個體發(fā)生起始于受精卵。 受精卵經(jīng)分裂增殖和細胞分化，形成多種不同類型的細胞(cell) 。

2、機體的一種或幾種細胞聚集形成一定構型的組織(tissue)。組織由細胞和細胞間質(zhì)（細胞外基質(zhì)）組成。組織有多種類型，每種具有一定的形態(tài)結(jié)構特征和相關的功能。基本組織有四種：上皮組織、結(jié)締組織、肌組織和神經(jīng)組織。 幾種組織相互結(jié)合，組成器官和系統(tǒng),一、組織學與胚胎學的早期研究和發(fā)展,古代-15世紀解剖學組織學胚胎學的發(fā)展,古代 中醫(yī)書中即有解剖、臟腑的記載。 古希臘對胚胎學作出了重大貢獻（Hippocrates 和Aristotle）。 前2世紀，古羅馬醫(yī)生Galen著作中記錄了胃腸、子宮等器官的分層結(jié)構，關于胎兒的形成描述了羊膜、尿囊和胎盤結(jié)構。 中世紀（6-14世紀） 發(fā)展緩慢。 有些醫(yī)書中

3、可見解剖資料敘述。,近代解剖學組織學胚胎學的發(fā)展,16世紀 意大利da Vinci繪制700多幅解剖圖，大多數(shù)相當準確。 比利時醫(yī)生Vesalius是現(xiàn)代解剖學的奠基者，1543年發(fā)表人體的構造。 英國Harvey發(fā)現(xiàn)血液循環(huán)，觀察雞胚和哺乳動物胚胎發(fā)生，發(fā)表心血管運動論胚胎發(fā)生論，強調(diào)“一切動物皆起源于卵”，認為胚胎由子宮分泌,17世紀 顯微鏡發(fā)明，打開了新的觀察領域。 細胞發(fā)現(xiàn)。 脾、肺、腎、皮膚等一些器官結(jié)構被揭示。 卵泡發(fā)現(xiàn)。 兩棲類卵子人工受精實驗，提出兩性配子的結(jié)合是個體發(fā)生的前提 胚胎學流行“先成論”，認為胚胎是在生殖細胞中預先存在的，發(fā)育不過是繼續(xù)長大。,18世紀 德國人Wol

4、ff用顯微鏡直接觀察胚的發(fā)育，認為卵中沒有預先形成的物質(zhì)，也沒有組織和器官，否定“先成論”，主張胚胎是逐漸分化演變而成的“漸成論”。 清朝王清任1796年寫成醫(yī)林改錯。,19世紀 法國人Bichat發(fā)現(xiàn)組織(tissue)，1801年發(fā)表膜的研究，將其分為21種。 德國人Mayer于1819年提出histology。 德國人Von Bear提出貝爾定律。 德國Remark在Bear工作基礎上，提出三胚層學說。 達爾文1859年發(fā)表物種起源。 德國人Schleiden和Schwann創(chuàng)立細胞學說。 奧地利人Mendel于1865年創(chuàng)立細胞遺傳學說。 德國人Weismann于19世紀末提出機體細胞

5、有生殖細胞和體細胞之說，認為生殖細胞含有決定胚胎細胞分化為不同組織的“決定子”。,丹麥人Jahanngen于1909年將遺傳因子命名為“gene” 德國人Roux于1887年進行分割蛙卵分裂球試驗，開創(chuàng)了實驗胚胎學研究 His最早制作胚胎連續(xù)切片并進行三維重建，研究胚胎各系統(tǒng)和器官的發(fā)育 Golgi于1889年發(fā)明銀染技術，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)細胞內(nèi)的“內(nèi)網(wǎng)器”（高爾基體） Altman于1894年作活體細胞染色，在多種動物和植物細胞中看到線粒體 許多重要的細胞和組織結(jié)構在19世紀中、后期發(fā)現(xiàn)和命名,20世紀，是現(xiàn)代組織學和胚胎學蓬勃發(fā)展的時期，新技術和新儀器不斷涌現(xiàn)并應用于細胞學、組織學、胚胎學的研究,

6、二、現(xiàn)代組織學與胚胎學研究和發(fā)展,三、我國組織學與胚胎學研究和發(fā)展,開始于20世紀初 50年代起，我國組織學與胚胎學事業(yè)發(fā)展進入一個新的時期 近20多年是我國組織學與胚胎學事業(yè)蓬勃發(fā)展、快速進步的最佳時期,四、組織學與胚胎學的研究方法,一般光學顯微鏡術 幾種特殊顯微鏡的應用 組織化學和細胞化學術 免疫細胞化學術 原位雜交術 放射性核素示蹤術,細胞和細胞化學定量術 電子顯微鏡術 組織培養(yǎng)術 細胞融合術 顯微外科術,1、一般光學顯微鏡術,切片制備 石蠟切片：最常用 冷凍切片：常用于酶組織化學染色 涂片、磨片、鋪片、連續(xù)切片 染色 堿性染料：含氨基、二甲氨基等堿性助色團的染料 酸性染料：含有羧基、羥

7、基、磺基等酸性助色團的染料 嗜酸性、嗜堿性、中性 最常用的染色方法是蘇木精和伊紅染色法，簡稱HE染色法,2、幾種特殊顯微鏡的應用,熒光顯微鏡：用來觀察標本中的自發(fā)熒光物質(zhì)或以熒光素染色或標記的細胞和結(jié)構 相差顯微鏡：用于觀察組織培養(yǎng)中活細胞形態(tài)結(jié)構 暗視野顯微鏡：用于觀察因反應或分辨力不足的微小顆粒，可分辨0.004-0.2微米的微粒，適用于觀察細胞內(nèi)線粒體運動及標本中細菌等微粒的運動 共聚焦激光掃描顯微鏡：可對細胞的多種功能進行全自動、高效、快速微量定性和定量研究等,3、 histochemistry 和 cytochemistry,糖類：顯示多糖和蛋白多糖的常用方法是過碘酸希夫反應（PAS

8、反應），原理,多糖,醛,紫紅色沉淀,過碘酸,氧化,Schiff,試劑,PAS染色示肝糖元,PAS染色,脂類：包括脂肪和類脂。標本用甲醛固定，冷凍切片，脂類保存較好。常用蘇丹染料、油紅O，尼羅藍等溶于脂類的染料染色 酶：目前有100多種酶組織化學染色法，基本原理是利用酶對其相應底物的水解、氧化等作用，然后再使底物的反應產(chǎn)物與某種捕獲劑發(fā)生反應，形成沉淀或有色的最終產(chǎn)物，借此檢測該酶在組織切片或細胞內(nèi)的分布及活性強弱 核酸：顯示DNA的傳統(tǒng)方法是福爾根反應(Feulgen reaction)，切片先用稀鹽酸處理，使DNA分子中脫氧核糖與嘌呤之間的聯(lián)接鍵打開，形成醛基，再與希夫試劑作用。原理同PAS

9、反應，使細胞核DNA顯紫紅色,4、immunocytochemistry/immunohistochemistry,是應用免疫學原理，通過抗原與抗體的特異性結(jié)合，顯示組織內(nèi)和細胞內(nèi)的多肽、蛋白質(zhì)及膜表面抗原和受體等大分子物質(zhì)的存在與分布。這種檢測技術的特異性強、靈敏度高、應用廣泛，是生物學和醫(yī)學領域中的重要研究手段。通常需對已知抗原或抗體進行標記，用相應的顯色和觀察方法檢測目的抗體或抗原。常用的標記物有熒光素、鐵蛋白、辣根過氧化物酶等,熒光素標記顯示皮膚毛細血管內(nèi)皮細胞,免疫組織化學,免疫熒光技術,5、原位雜交技術(in situ hybridization),是一種核酸分子雜交技術，通過檢測

10、細胞內(nèi)mRNA和DNA序列片段，原位研究細胞合成某種多肽或蛋白質(zhì)的基因表達。基本原理是用已知堿基序列并具有標記物的RNA或DNA片段即核酸探針（nucleic acid probe），與組織切片或細胞內(nèi)的待測核酸進行雜交，通過標記物的顯示，在顯微鏡下觀察目的mRNA或DNA的存在與定位。用核酸雜交技術檢測細胞內(nèi)某一基因在染色體上的定位，稱染色體原位雜交。用核酸雜交技術檢測某一基因的轉(zhuǎn)錄物mRNA的細胞定位和轉(zhuǎn)錄狀況，稱細胞原位雜交,核酸探針：主要有三種 利用大腸桿菌重組帶有目的基因的質(zhì)粒DNA，制成互補DNA探針（cDNA） 應用限制性核酸內(nèi)切酶消化制成線性DNA模板，在體外轉(zhuǎn)錄獲得反義RNA

11、探針（cRNA） 依照待測核酸的核苷酸序列，應用DNA合成儀合成寡聚核苷酸探針,原位雜交示臍靜脈內(nèi)皮細胞呈心房鈉尿肽陽性,6、電子顯微鏡術,透射電鏡術Transmission electron microscopy，TEM,是用電子束穿透標本，經(jīng)過電磁場的會聚、放大后，在熒光屏上顯像，或?qū)⒂跋裢渡涞秸障嗟灼?由于電子束穿透力弱，故經(jīng)過固定的電鏡標本需制成超薄切片（5080 nm） ，并用重金屬鹽如檸檬酸鉛和醋酸鈾等染色,掃描電鏡術 Scanning electron microscopy，SEM,用于觀察細胞、組織和器官表面的立體細微結(jié)構 需將小塊組織經(jīng)固定、脫水、干燥后，在其表面噴鍍薄層碳膜

12、和金屬膜 圖像清晰，富有立體感,電鏡掃描圖,肺巨噬細胞吞噬大腸桿菌,電鏡掃描圖,電鏡圖（冷凍蝕刻）,7、組織培養(yǎng)技術(tissue culture),是將離體細胞或組織放置在適當?shù)沫h(huán)境條件下進行培養(yǎng)的一種技術方法，可用以檢測各種理化因子、細胞因子等對細胞增殖、分化、代謝、運動、吞噬、分泌等生命活動和細胞行為的影響，還可用細胞培養(yǎng)技術研究細胞癌變、逆轉(zhuǎn)的機制。,子宮內(nèi)膜上皮細胞,體外培養(yǎng)的大鼠肝細胞,8、細胞和細胞化學定量術,顯微分光光度定量術：應用顯微分光光度計測定組織化學和免疫組織化學染色標本的反應強弱，進行化學成分的定量分析 形態(tài)定量術：運用數(shù)學和統(tǒng)計學原理對組織和細胞進行二維和三維的形態(tài)測量研究。其中三維立體結(jié)構的研究又稱體視學 流式細胞術：應用流式細胞儀對單個細胞生物化學和生物物理特性進行快速定量測定,流式細胞術,應用流式細胞儀對單個細胞進行生物化學和生物物理特性的快速定量測定，可進行細胞周期各時相細胞的比例和細胞內(nèi)DNA、RNA、蛋白質(zhì)的含量分析，淋巴細胞亞群的分離和定量，血細胞增殖情況的分