細菌培養(yǎng)的基本技術(shù)

1、細菌培養(yǎng)的基本技術(shù),實驗原理 根據(jù)某種細菌的營養(yǎng)需要而選擇多種原料配制而成的培養(yǎng)基，不僅含有這種細菌生長繁殖所需要的各種營養(yǎng)物質(zhì)，還要有適宜的pH。本實驗所用的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，應用較廣泛，適于芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌等多種細菌的培養(yǎng)。,配制好的培養(yǎng)基必須經(jīng)過滅菌。滅菌是指殺死一定環(huán)境中所有微生物的細胞、芽孢和孢子。對不同的材料，應當采取不同的滅菌方法。培養(yǎng)基一般采用高壓蒸汽滅菌法，就是將待滅菌的培養(yǎng)基放入密閉的高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)，通過加熱使鍋內(nèi)的水沸騰并產(chǎn)生水蒸汽。當水蒸汽將鍋內(nèi)的冷空氣排盡以后，關(guān)閉排氣閥并繼續(xù)加熱，這時鍋內(nèi)的壓力就會升高，最終使菌體蛋白質(zhì)凝固變性，從而達到滅菌的目的。接種

2、環(huán)是用火焰燒灼滅菌的。,將某種細菌接種在徹底滅菌的培養(yǎng)基上，經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)后，就能夠得到生長良好的細菌群體，它們在培養(yǎng)基上會呈現(xiàn)出一定的形態(tài)特征。,目的要求 1通過對牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配 制，了解配制培養(yǎng)基的一般步驟和方法。 2了解滅菌的基本原理，以及實驗室中常用的滅菌方法。 3初步學會細菌培養(yǎng)的基本技術(shù)。,材料用具 芽孢桿菌或金黃色葡萄球菌、牛肉膏、蛋白胨、瓊脂。 天平、角匙、200mL燒杯、試管、漏斗、量筒、玻璃棒、滴管、膠管、彈簧夾、鐵架臺、酒精燈、石棉網(wǎng)、三角架、火柴、紗布、棉花、牛皮紙、線繩、標簽、接種環(huán)、精密pH試紙(或pH計)、金屬小筐、高壓蒸汽滅菌鍋、恒溫箱。 NaCl、

3、1mol/L的NaOH溶液、體積分數(shù)為75的酒精溶液、蒸餾水。,方法步驟 一、培養(yǎng)基的配制 1稱量 用天平稱取0.5g牛肉膏、1g蛋白胨、0.5gNaCl、2g瓊脂。將稱好的牛肉膏、蛋白胨和NaCl放入燒杯。 2溶化 向上述燒杯中加入蒸餾水100 mL，用玻璃棒攪勻后，放到酒精燈上加熱。當牛肉膏和蛋白胨溶化后，加入瓊脂，并繼續(xù)用微火加熱。在瓊脂溶化的過程中，要控制火力的大小，并且不斷攪拌，以免培養(yǎng)基溢出或燒焦。待瓊脂完全溶化后，補加蒸餾水至100mL。,3調(diào)pH 用滴管逐滴滴入1mol/L的NaOH溶液，邊滴邊攪拌，并隨時用pH試紙測pH，直到pH為7.47.6為止。 4培養(yǎng)基的分裝 按右圖所

4、示，將培養(yǎng)基趁熱分裝到潔凈的試管中，培養(yǎng)基的高度約為試管高度的1/5。注意：分裝時不要將培養(yǎng)基沾在管口和試管上段，以免引起污染。,5加棉塞 培養(yǎng)基分裝完畢以后，在管口上加一個棉塞。棉塞能防止雜菌污染，保證通氣良好。加棉塞時，應使棉塞長度的2/3在試管口內(nèi)，如下圖所示。,例：在葉綠體色素提取和分離與利用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)金黃色葡萄球菌二個實驗中，裝色素濾液的試管和接種培養(yǎng)基的試管均要用到棉塞。下列有關(guān)和所用棉塞的特點及其作用的說法，正確的是（ ） A、二者用的都是脫脂棉，可以防止水分吸附 B、二者的都不是脫脂棉，有利于水分的吸附 C、所用的棉塞應該比更緊，以防雜菌污染 D、所用的棉塞應該比更緊，以

5、防濾液蒸發(fā),D,6包扎 每10支試管用線繩捆成一捆，并且在管口外面包上一層牛皮紙，然后，用線繩扎好。在每捆試管外掛上標簽，注明培養(yǎng)基名稱、配制日期和制作者姓名,二、滅菌 1打開高壓蒸汽滅菌鍋，將里面的滅菌桶取出，向鍋內(nèi)加水(最好用開水)，水面與底架平齊為宜。高壓蒸汽滅菌鍋的構(gòu)造如右下圖所示。,2將扎好的試管管口向上豎放在滅菌 桶內(nèi)，再將滅菌桶放回滅菌鍋。注 意：滅菌桶內(nèi)的物品不能放得太 擠，否則會影響滅菌效果。,3加蓋，并將排氣軟管插入滅菌桶的排氣 槽內(nèi)。以兩兩對稱的方式，同時旋緊相 對的兩個緊固螺栓，以防漏氣。,4排出鍋內(nèi)的冷空氣。接通電源，當壓力 上升到49kPa時，打開排氣閥放氣，當壓

6、力降到0時，關(guān)閉排氣閥。重復上述放氣 過程一次，以徹底排出鍋內(nèi)的冷空氣。,5當鍋內(nèi)的壓力上升到98kPa時，控制火 力大小，使壓力維持在98kPa左右 20min，切斷電源。,6當壓力降至0以后，打開排氣閥，10min 以后，旋松緊固螺栓，取出試管。最后， 將滅菌鍋里的水排放干凈。,三、擱置斜面 當培養(yǎng)基冷卻至50左右時，將試管帶棉塞的一端擱在一根木棒上。擱置的長度要合適，使培養(yǎng)基形成的斜面的長度不超過試管總長的一半。,四、接種 1用肥皂將雙手洗凈，擦干，再用 酒精(體積分數(shù)為75%)棉球擦拭 雙手。,2當手上的酒精揮發(fā)完畢后，點燃 酒精燈。注意：一定要等手上的 酒精揮發(fā)完畢后，再點燃酒精 燈

7、，否則，容易將手燒傷。,3接種，操作程序見下圖。注意：整個實驗操作過程都要非常小心，不要碰翻酒精燈，以免燒傷。,（1）用左手大姆指、食指和無名指夾住菌種試管和待接種和斜面試管，右手擰松棉塞、不取下。,（2）右手拿接種環(huán)，在火焰上燒灼滅菌，特別是箍處。,（3）火焰邊取下兩個棉塞，不能放下；燒灼管口一周。,（4）將接種環(huán)伸入試管內(nèi)，冷卻后，輕輕挑取少量菌體，立即將接種環(huán)抽出。,（6）抽出接種環(huán)后，燒管口，塞棉塞，接種環(huán)滅菌。,（5）火焰旁將沾有菌種的接種環(huán)迅速伸到斜面培養(yǎng)基的底部，由里向外畫蛇形細線，線要畫得細些。,例：B圖是否正確？ 如不正確糾正方法是,不正確。接種管宜放在菌種管上面,4熄滅酒精

8、燈。實驗后的帶菌培 養(yǎng)基，如果用的是致病菌，必 須經(jīng)高壓蒸汽滅菌鍋滅菌后方 能倒掉；如果是非致病菌，也 要經(jīng)加熱后再倒掉。,5接種完畢，將所接菌種、接種日 期、接種者姓名填寫在標簽上。,五、培養(yǎng) 將接種后的試管放入恒溫箱內(nèi)，在25下培養(yǎng)57d，或在37下培養(yǎng)24h。,結(jié)論 斜面培養(yǎng)基上的細菌生長狀況如何？將觀察到的結(jié)果和得出的結(jié)論填寫在 實驗報告上。,討論 1在高壓蒸汽滅菌開始以前，為什 么要將滅菌鍋內(nèi)的冷空氣排盡？,在高壓蒸汽滅菌以前，如果高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)的冷空氣沒有排盡，當壓力上升到 98 kPa時，鍋內(nèi)的溫度就不會上升到應有的高度，導致滅菌不徹底。,2滅菌完畢以后，如果壓力未降到0就打開

9、排氣閥，會出現(xiàn)什么現(xiàn)象？為什么？,如果壓力未降到零就打開排氣閥，試管內(nèi)的培養(yǎng)基就會沖出管口。這是因為高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)外壓力不平衡的緣故,3接種操作為什么一定要在火焰 旁邊進行？,空氣中存在有大量的微生物，而接種燈的火焰旁能形成一個無菌區(qū)域，在這里操作，可以避免雜菌污染,練習： 1、培養(yǎng)細菌需要根據(jù)某種細菌的_ 配制特定的_.其中_ 培養(yǎng)基應用廣泛. 2、為使培養(yǎng)基呈固體狀態(tài)，需要在配制好的各營養(yǎng) 成分的液體加入_,溶化冷卻即可. 3、調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值,用濃度為1mol/L的_ 或_溶液進行調(diào)節(jié).,營養(yǎng)需要,培養(yǎng)基,牛肉膏蛋白胨,瓊脂,HCl,NaOH,4、對培養(yǎng)基進行滅菌就是要利用高溫殺死_

10、 _.壓力要達到 _KPa,維持_分鐘. 5、擱置斜面時培養(yǎng)基不能溫度_否 則培養(yǎng)基會變成_應趁熱將試管放置成 斜面形,使管內(nèi)培養(yǎng)基形成的斜面長度不超過試管 總長的_.,培養(yǎng)基中的一切微生物,98,20,太低,固體,1/2,6、微生物接種時各項操作必須在_條件 下進行.因此必須在_中操作.接種環(huán)境 在_上用灼燒去滅菌,雙手用_% 的酒精消毒. 7、接種時將滅菌的接種環(huán)挑取少許_,迅 速插入培養(yǎng)基試管里,在斜面上由_向 _連連續(xù)劃幾道_線,然后將試管 口在火焰上灼燒,塞上_.,無菌,無菌箱,酒精燈,75,菌體,里,外,蛇形細,棉塞,7、接種后的試管要放入_箱中在_0 下培養(yǎng)_天,即可見斜面上出現(xiàn)

11、 _. 8、接種后塞上棉塞的作用是_. 且棉塞要塞進試管的深度為棉塞總長的_,恒溫,37,1,菌落,防止雜菌污染、保證通氣良好,2/3,25,5-7,例1、根據(jù)下面“枯草桿菌的培養(yǎng)和觀察”的實驗步驟，回答問題 1、實驗前一周，取少許新鮮的干稻草切成碎段，放入錐形瓶中，加水（水 ：草=10 ：1）并煮沸30分鐘后，即用棉塞塞住瓶口，放在不見光的溫暖處，或恒溫箱中。3-5天后，觀察到液體混濁，表面出現(xiàn)一層白色薄膜。 2、用玻璃棒挑少量薄膜，涂在載玻片上，蓋上蓋玻片，在高倍鏡下可以觀察到許多不活動的枯草桿菌群體。,枯草桿菌的芽孢可耐高溫而不致被殺死，而在煮沸的情況下其它菌類會因高溫使蛋白質(zhì)變性而死亡

12、。,問：在煮沸的新鮮干稻草液中為什么會出現(xiàn)枯草桿菌？,例2、以下是關(guān)于食品的腐敗和食品的保存的實驗步驟； 1、取標有A-F的六只錐形瓶，瓶內(nèi)各放 入30mL肉湯澄清液 2、在A瓶中加入3角匙食鹽；B瓶中加入 15mL食醋；用棉塞塞 住瓶口，A、B瓶 都放在恒溫箱中，溫度為30-370C 3、C、D、E、F瓶中不加任何物質(zhì)，都放 置于空氣中暴露1h，然后用棉塞住它們 的瓶口。,4、將C瓶放在30-370C恒溫箱中，D瓶 放在室溫下，E瓶放在40C左右的冰 箱冷藏室內(nèi)，F(xiàn)放在-100C的冷凍室 內(nèi)。 5、一周后觀察，記錄實驗結(jié)果。 請你根據(jù)生物學原理對六瓶中食品的變化情況作一預測，并簡述理由。,答

13、：A、B、F、肉湯不會腐??；因A瓶高濃度鹽抑制微生物的生長和繁殖；B瓶高濃度的有機酸也能抑制微生物的生長和繁殖；F低溫抑制了微生物的生長和繁殖； E肉湯在短時間內(nèi)基本不會變質(zhì)；但可能有少許低溫型微生物能生長繁殖； C、D兩瓶肉湯都會腐敗；因有適合微生物生長繁殖的溫度、營養(yǎng)物質(zhì)等條件。,例3：在錐形瓶中裝入一定量液體培養(yǎng)基，接入N0個乳酸菌之后密封，放在250C溫箱中連續(xù)培養(yǎng)若干小時，其間每30分鐘測定一次菌數(shù)，測得數(shù)量變化曲線如圖。請分析回答。,（1）乳酸菌以_方式生殖,這代表 _類生物普遍具有的生殖方式.,分裂生殖,原核,(2)用N表示總菌數(shù),N0表示初始菌 數(shù),t表示增殖世代數(shù),乳酸菌數(shù)量增 長的數(shù)字表達式為N=N02t.當在理想 條件下,乳酸菌每30分鐘繁殖一代, 按上式算,當N0=100