細(xì)胞工程-第十一章、動物組織與胚胎工程.ppt

1、第十一章、動物組織與胚胎工程,第一節(jié)、組織工程器官保存培養(yǎng)：維持器官的存活與功能組織培養(yǎng)：體外培養(yǎng)生成某些組織組織修復(fù)：通過培養(yǎng)組織、移植或原位地進行壞損組織的修復(fù)。,修復(fù)缺損器官的方法一般有自體移植、異體移植和組織代用器三種。,1、人體組織與器官的基本結(jié)構(gòu),人體組織由細(xì)胞及支撐細(xì)胞的細(xì)胞外間質(zhì)構(gòu)成extra-cellular matrix)細(xì)胞外間質(zhì)組成包括：collagen, glycoprotein, hyaluronic acid, proteoglycan, elastin, fibronectin, growth factors, cytokines etc.,2、組織工程的三要素

2、細(xì)胞、支架、信號,A、細(xì)胞必須能不斷進行細(xì)胞分裂，且必須能被調(diào)控分化成特定的組織細(xì)胞干細(xì)胞：胚胎干細(xì)胞、成體干細(xì)胞組織來源細(xì)胞自體或異體,Growth factor stimulation,B、組織生長支架需求：（1）、生物親和性（2）、生物可降解性（3）、三維內(nèi)部連通孔隙（4）、具備支架強度。,蛋白質(zhì)支架多糖支架磷酸鈣基生物材料硫酸鈣基生物材料,C、生長因子表皮生長因子：是對上皮細(xì)胞增殖有很強促進作用的53個氨基酸殘基的多肽。神經(jīng)生長因子：為神經(jīng)細(xì)胞特異性分泌的營養(yǎng)蛋白。肝細(xì)胞生長因子：為728個氨基酸殘基單鏈組成。骨形態(tài)發(fā)生蛋白：能誘導(dǎo)或刺激新骨的生成。,3、技術(shù)路線（1）體外得到工程化組

3、織、移植目前主要的方式（2）細(xì)胞與支架前體混合注射體內(nèi)，原位形成凝膠支架，提供新組織形成的空間,皮膚修復(fù),骨修復(fù),4、已取得成就第一個組織工程產(chǎn)品人工皮膚已于1997年3月經(jīng)美國FDA批準(zhǔn)上市。這種產(chǎn)品是器官基因公司培養(yǎng)出的，被稱為適移植的活性皮膚，它由新生兒的包皮細(xì)胞培植而成，呈層狀結(jié)構(gòu)，與正常人的皮膚極為相似，能分泌人體皮膚膠原、生長因子和結(jié)構(gòu)性蛋白，可與病人自身的皮膚很好地融合，不存在排異作用，就連病人自身的血管和色素也會逐漸轉(zhuǎn)移到適移植活性皮膚中去，愈后不留瘢痕。,2000年3月10日，Advanced Tissue Sciences公司宣布成功研制出促進心肌血管形成的產(chǎn)品。該產(chǎn)品應(yīng)用

4、后14天即開始形成新的血管。據(jù)悉，用來修復(fù)或取代受損的人體軟骨組織的組織工程產(chǎn)品人工軟骨也即將上市。,第二節(jié)、胚胎工程胚胎工程（embryo engineering）是指所有對配子和胚胎進行人為地干預(yù)，使其環(huán)境因素、發(fā)育模式或局部組織功能，發(fā)生量和質(zhì)的變化的綜合技術(shù)。 包括：胚胎移植、胚胎融合、胚胎分割、胚胎冷凍、胚胎性別鑒定、胚胎細(xì)胞核移植、轉(zhuǎn)基因操作等,一、 胚胎移植（embryo transfer),（一）、概念及應(yīng)用 胚胎移植（embryo transfer)也稱受精卵移植，是指一頭母畜（稱為“供體”）發(fā)情排卵并經(jīng)過配種后，在一定時間內(nèi)從其生殖道（輸卵管或子宮角）取出受精卵或胚胎，然后

5、把它們移植到另外一頭與供體同時發(fā)情排卵、但未經(jīng)配種的母畜（稱為“受體”）的輸卵管或子宮角。這個來自供體的胚胎能夠在受體的子宮著床，并繼續(xù)生長和發(fā)育，最后產(chǎn)下供體的后代。 “借劣質(zhì)動物之腹懷優(yōu)秀個體之胎”,胚胎移植成功的羊,2.胚胎移植的應(yīng)用范圍,在家畜改良方面的應(yīng)用 在特定品種擴繁上的應(yīng)用 在動物生物多樣性上的應(yīng)用 其它方面應(yīng)用：轉(zhuǎn)基因動物、性別控制、體外受精,2.1在家畜改良方面的應(yīng)用,人工授精技術(shù)可成幾十到幾百倍地提高了優(yōu)秀種公畜的配種效能。但對優(yōu)秀母畜來說，受其產(chǎn)仔數(shù)和世代間隔的限制，尤其是牛羊等繁殖力較低的畜種更是如此。 通過超數(shù)排卵和胚胎移植技術(shù)（multiple ovulation

6、 and embryo transfer: MOET)牛羊的生長性狀年遺傳進展可比正常繁殖提高80%和70%；產(chǎn)奶性狀提高33%。,2.2在特定品種擴繁上的應(yīng)用,牛羊等低繁殖力家畜，從引進到形成一個純種群體需要7-8個世代，15-20年。而采用MEOT法，一次就可獲得一個純種群體。 80年代初，美、澳、新從歐洲引進的大型肉牛品種均采用胚胎移植技術(shù)擴繁。 2000年前后，我國的波爾山羊也是采用胚胎移植進行擴繁的。,2.3在動物生物多樣性上的應(yīng)用,在保護動物遺傳資源，提高家畜生產(chǎn)性能，挽救瀕臨滅絕的野生動物方面，胚胎移植技術(shù)越越來發(fā)揮出重要作用。 冷凍能夠很好地保存瀕臨滅絕動物的胚胎或生殖細(xì)胞，但

7、該種動物雌性個體的減少，也是這種動物的胚胎或生殖細(xì)胞無法得到移植，科學(xué)家開始研究在該種動物的亞種或親緣種中試驗，并取得一些成功。如斑馬胚胎移植給馬，蒙古馬胚胎移植給驢，白肢野牛移植給荷斯坦牛。,2.4 其它方面應(yīng)用,胚胎移植是克隆技術(shù)的必須過程 體外受精必須借助胚胎移植實現(xiàn)“試管嬰兒的繼續(xù)發(fā)育 轉(zhuǎn)基因及動物生物反應(yīng)器的研究也必須借助胚胎移植,（二） 胚胎移植的生理基礎(chǔ)及原則,1.胚胎移植的生理學(xué)基礎(chǔ) 2.胚胎移植的基本原則,1.胚胎移植的生理學(xué)基礎(chǔ),成年母畜卵巢上存在數(shù)千到上萬個卵泡，在外源激素作用下，每個發(fā)情期的卵泡發(fā)育和排卵數(shù)可達十?dāng)?shù)個 每個發(fā)情周期生殖器官都有一個孕向發(fā)育 早期胚胎處于游

8、離狀態(tài) 胚胎發(fā)育不存在免疫問題 胚胎發(fā)育到一定階段會與子宮發(fā)生生理和組聯(lián)系 胚胎的遺傳性不受受體的影響,2. 胚胎移植的基本原則,胚胎移植前后所處的環(huán)境的同一性 供體和受體在分類學(xué)上的相同屬性 動物生理上的一致性：受體和供體在發(fā)情時間上的同期性 動物解剖位置上的一致性：空間環(huán)境的一致性 胚胎的發(fā)育期限：必須處于周期黃體期內(nèi) 胚胎的質(zhì)量：胚胎必須是正常的，并在處理過程中不受不良因素的影響,（三）、胚胎移植的技術(shù)程序,1.供體和受體的選擇 2. 超數(shù)排卵處理 3.供體母畜的配種 4.胚胎的收集 5.胚胎的檢查 6.胚胎的保存與培養(yǎng) 7.胚胎的移植 8.供體和受體的術(shù)后觀察,1.供體和受體的選擇,供

9、體應(yīng)具有相當(dāng)高的育種價值 供體生殖機能應(yīng)處于較高的狀態(tài)：產(chǎn)后60天以上，無生殖系統(tǒng)疾病，體質(zhì)強健 受體應(yīng)容易購買，繁殖性能好，對地方適應(yīng)性強，體型中上等，非優(yōu)良品種 受體健康狀況良好，已進入發(fā)情季節(jié) 供受體發(fā)情時間應(yīng)接近或一致,2. 超數(shù)排卵處理,利用促性腺激素處理，使得卵巢中有更多的卵泡發(fā)育，更多的卵被排出，這個過程就稱為超數(shù)排卵（superovulation） 意義：讓每個供體提供更多的胚胎 處理時間： 牛：預(yù)計自然發(fā)情時間的前4天，或發(fā)情周期的第16-17天 羊：發(fā)情周期的第12-15天，促性腺激素處理的第二天或第三天，注射PG,同期發(fā)情與超排程序,1）母牛發(fā)情后913天開始肌肉注射促卵

10、泡素(FSH)，每次劑量為50IU，每天兩次，每次間隔12h，連續(xù)注射4天，共8次。在首次注射促卵泡素(FSH)后的48h、60h和72h，分別肌肉注射氯前列烯醇0.2mg。經(jīng)觀察，母牛在首次用氯前列烯醇后的30-60h相繼出現(xiàn)發(fā)情。 2）在性周期第16天，肌肉注射孕馬血清(PMSG) 2500IU，在20-21天時靜脈注射絨毛膜促性腺激素(HCG)2000IU；或在性周期第8-14天，肌肉注射孕馬血清2000IU，48h后用前列腺素F2a 33mg，一次肌肉注射。,受體同期發(fā)情處理,1)前列腺素處理法：有溶黃體作用 在發(fā)情周期的第9天以后，注射PG2（牛2.4mg,羊1.2mg)。?？稍谧⑸?/p>

11、后6096小時內(nèi)發(fā)情。受體牛發(fā)情之日計為0天，68天內(nèi)進行胚胎移植。 2）孕激素處理法：抑制卵泡發(fā)育 牛：于處理的第一天，注射雌二醇2mg，同時埋植孕酮或放置孕酮（200mg)陰道海綿栓，處理912天，取出埋植或陰道栓后24天內(nèi)可發(fā)情。 羊：每日肌注孕酮1020mg，或經(jīng)陰道海綿栓給予孕酮5060mg，綿羊處理1214天，山羊處理1218天，在處理的最后一天或撤除海綿栓的前一天，給予PMSG200250IU，一般可在停止注射或撤除海綿栓后23天內(nèi)發(fā)情。,3.供體母畜的配種,必須用優(yōu)秀的種公畜進行多次配種，一般隔8-12小時進行一次配種，直到發(fā)情結(jié)束。 配種前應(yīng)對種公畜的精液進行質(zhì)量檢查。 可優(yōu)

12、秀種公畜不足時，可考慮首次采用本交，以后采用人工授精，也可以全部采用人工授精。,羊同期發(fā)情放栓,供體超排處理,供體配種,4.胚胎的收集,胚胎沖洗液的配制：杜氏磷酸緩沖液PBS，布林斯特液SOF合成輸卵管液 手術(shù)法收集胚胎 輸卵管沖胚：順向沖胚、逆向沖胚 子宮角沖胚 非手術(shù)法收集胚胎 二路法 三路法,較為適用的是含滅活犢血清磷酸緩沖液(pbs)。其成分：氯化鈉8g，氯化鉀2g，磷酸氫二鈉1.15g，磷酸二氫鉀0.2g，氯化鈣0.1g，氯化鎂0.1g，丙酮酸鈉32mg，葡萄糖1g，牛血清白蛋白4g，卡那霉素25mg，酚紅5mg，三蒸餾水1000ml。犢牛血清20%，pH7.2，-20保存。,移胚,

13、配種后3天的供卵巢,供體羊胚胎收集,收集到的沖洗液靜置，沖洗液分離。 揀胚：將胚胎移至培養(yǎng)液或保存液中。 胚胎鑒定：根據(jù)透明帶、胚胎細(xì)胞、發(fā)育階段及細(xì)胞在透明帶中的比例確定胚胎級別。,5.胚胎的檢查,6天收集的胚胎（未揀）,二細(xì)胞至四細(xì)胞胚胎,胚胎的降溫：使胚胎停止發(fā)育，延長其體外生存時間 體外培養(yǎng)：將胚胎置于體溫條件下，在培養(yǎng)液中，使其繼續(xù)發(fā)育 胚胎冷凍：通過一定的處理程序，將胚胎降溫冷凍后，保存于液氮中,6.胚胎的保存,保存的方法可以分為非冷凍保存和冷凍保存。 非冷凍保存是1948年，由M.C.Chang 等開創(chuàng)的，他們將兔2細(xì)胞胚胎，在同種血清中37保存48小時，移植后產(chǎn)仔。 非冷凍保存

14、主要有三種方法，即異種動物體內(nèi)保存法、卵和胚胎的37保存法和冷藏保存法。,異種動物體內(nèi)保存法,又稱為中間受體培養(yǎng)法，是指把一種動物的胚胎，移入另一種動物的輸卵管或子宮內(nèi)，短期保存后再取出的方法，但并不是所有的動物都能在另一種動物的輸卵管或子宮內(nèi)存活的。,瓊脂包埋移植法是指將胚胎移植到1的瓊脂液中，用口徑適宜的微吸管把胚胎連同少量瓊脂液一起吸入。當(dāng)瓊脂凝結(jié)后再將其壓出，胚胎就被封入圓柱形瓊脂小柱中，每個瓊脂小柱放35枚胚胎，再把這個瓊脂小柱封入較大的1.2瓊脂圓柱內(nèi)。然后，通過胚胎移植技術(shù)，將瓊脂柱移入中間受體輸卵管中。移植前，預(yù)先結(jié)扎輸卵管與子宮的接合部。 直接移植法是不經(jīng)瓊脂處理，直接移入預(yù)

15、先結(jié)扎過的受體輸卵管中。經(jīng)過短期培養(yǎng)后，將胚胎從輸卵管內(nèi)沖出 ，觀察發(fā)育情況。對發(fā)育良好者，移植入同期發(fā)情的同種動物受體內(nèi)，使其產(chǎn)仔。,37保存法,是指在37下，短時間保存卵和胚胎。 由于是在胚胎培養(yǎng)的條件下進行，因而應(yīng)當(dāng)考慮到保存時間和胚胎發(fā)育、卵老化等問題。 例如，兔和小鼠的46細(xì)胞胚胎，經(jīng)過96小時在37保存，已經(jīng)發(fā)育到胚泡階段。一般而言，經(jīng)過48小時體外保存，再移向受體，胎兒的發(fā)育率要下降50，保存時間越長發(fā)育率越下降。 就卵母細(xì)胞而言，排卵或由卵泡取出后，受精能力有一定限度，所以保存時間長，即或能受精，也可能出現(xiàn)胚胎發(fā)育異常。,冷藏保存法,低于室溫，但還達不到冷凍階段的溫度對胚胎進行

16、保存即為冷藏保存法，一般在010左右保存。 由于低溫，可以抑制物質(zhì)代謝的速度和細(xì)胞分裂的速度，因之可以延長保存時間 。,冷凍法,冷凍法是指196保存胚胎，在進行超低溫冷凍前，必須進行冷凍保護劑處理。一般說來，在80以上時，細(xì)胞則逐漸失去活力，到130以下，細(xì)胞內(nèi)的水分呈微細(xì)冰晶樣或玻璃樣結(jié)構(gòu)，細(xì)胞內(nèi)所有需要能量的反應(yīng)停止，細(xì)胞的活動也幾乎停止。 最早，小鼠中獲得成功。,冷凍過程中細(xì)胞受到的損害,在冷凍過程中，細(xì)胞會受到兩方面的損害。 快速冷凍時，細(xì)胞內(nèi)形成的冰晶，對細(xì)胞膜和內(nèi)部結(jié)構(gòu)產(chǎn)生機械性損害，這是指冷凍的物理損傷。 當(dāng)緩慢降溫時，細(xì)胞內(nèi)的水，有足夠的時間完全滲到外面，從冰點緩慢降到細(xì)胞完全

17、脫水，往往需要幾個小時或更長時間，細(xì)胞一直處于高濃度溶質(zhì)中。如不加抗冷凍劑，細(xì)胞也會受到損害，這是冷凍的化學(xué)損傷。,防止冷凍損傷,在冷凍液中，可以加入冷凍保護劑，如DMSO、丙二醇、乙二醇、丙三醇、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮等。 冷凍保護劑的加入，可保護細(xì)胞抵抗低溫對細(xì)胞產(chǎn)生的損害。在胚胎冷凍過程中，還需要在稍低于溶液冰點時，強行致冷，防止溶液過冷現(xiàn)象的發(fā)生，這種促使溶液結(jié)冰的方法稱為誘發(fā)結(jié)晶或植冰（seeding）。一般，在37之間誘發(fā)結(jié)晶。 現(xiàn)在，人們已經(jīng)使用玻璃化法冷凍胚胎獲得成功，在冷凍保存液中加入高濃度的冷凍保護劑，使溶液粘性增強，當(dāng)處于超低溫時，形成玻璃樣液體。,動物胚胎的一般保存程序,

18、動物胚胎的一般保存程序是將胚胎吸入含M2液的安瓿瓶中，冷卻到0，逐漸加入冷凍保護劑，封閉安瓿。然后，把封閉好的安瓿從0冰室，轉(zhuǎn)移到5-6的恒冷室中，用預(yù)先在液氮凹面冷卻的眼科鑷子尖部，接觸安瓿，玻璃上一出現(xiàn)霜，就立即移開鑷子，完成植冰過程，之后，慢速冷至40或70，再直接投入液氮中保存。,超低溫冷凍保存方法,慢速冷凍、慢速解凍法是最早建立起來的哺乳動物胚胎冷凍方法。 以低于1/分鐘的速度降低到40或70（小鼠）、60120(牛)、80（卵母細(xì)胞），再投入液氮。解凍速度也不超過25/分鐘。其優(yōu)點是脫水完全，細(xì)胞內(nèi)不易形成冰，但比較費時，冷凍保護劑對胚胎作用時間長。,快速冷凍、快速解凍法是指把胚胎

19、慢速降溫到3035，投入液氮。解凍可以在室溫或37水浴中進行。該方法能較好地克服胚胎脫水少細(xì)胞內(nèi)冰晶形成之間的矛盾，獲得較高的存活率。解凍后，用蔗糖洗脫。,一步冷凍法省去了洗脫冷凍保護劑，其主要特點是冷凍細(xì)管里的冷凍液和稀釋液是分開的。細(xì)管里裝有培養(yǎng)液、含胚胎的冷凍液、稀釋液。該法適用于冷凍胚胎運輸使用。 快速冷凍法將胚胎或卵母細(xì)胞在適當(dāng)?shù)睦鋬霰Ｗo劑混合液中作短暫處理后，直接投入液氮。 玻璃化法簡單、快速而有效，不需要冷凍儀，主要依靠溶液的玻璃化特性，將卵母細(xì)胞或胚胎同玻璃化液處理，然后直接投入液氮，解凍時快速進行。,手術(shù)法移植 非手術(shù)法移植,7.胚胎移植,受體移胚,供體和受體的抗炎處理 健康

20、狀況檢查 返情狀況檢查 妊娠檢查及妊娠確定,8.供體和受體的術(shù)后觀察及處理,胚胎移植產(chǎn)出的犢牛,一次移入三枚胚全部成活,受體母羊與所生羔羊,二、胚胎嵌合嵌合體（chimera）是指在同一個體中，由于基因型不同的細(xì)胞或組織互相接觸，且各自獨自并存的狀態(tài)發(fā)育早期，如卵裂球甚至受精卵所形成的嵌合體稱為原發(fā)性嵌合體，而把在發(fā)育的較晚期，如胚層已經(jīng)分化，或器官開始形成后，通過組織移植或嫁接等方法所形成的部分組織或器官的嵌合，稱為次生性嵌合體,胚胎嵌合方法聚合法第一種可以利用胚胎與胚胎聚合，即使用發(fā)生致密化后的胚胎，用酸性臺氏液（pH2.5）或0.5鏈霉蛋白酶除去透明帶，充分洗滌后，放入含有5g/ml植物

21、凝集素A（PHA）的聚合液滴中。讓一個胚胎垂直位于另一胚胎之上，借機械壓力和PHA的作用，更易聚合。若放到37時，效果更佳，聚合完畢后，洗除PHA，繼續(xù)培養(yǎng)，或進行胚胎移植。,第二種是利用卵裂球或細(xì)胞與胚胎聚合，將胚胎卵裂球解離或用其他游離的細(xì)胞，與胚胎聚合。當(dāng)用一個已經(jīng)除去透明帶的胚胎時，將卵裂球或細(xì)胞在胚胎的正上方慢慢釋放，使兩者直接接觸，借助PHA的作用使之聚合。當(dāng)用兩個無透明帶胚胎時，以類似“三明治”的方式，把細(xì)胞放到兩個胚胎之間，使之聚合。第三種利用兩種細(xì)胞間聚合。聚合時，各取數(shù)個細(xì)胞或卵裂球，放入空透明帶內(nèi)，用PHA使之聚合在一起，并用瓊脂包埋。通過中間受體培養(yǎng)一段時間后，觀察其發(fā)

22、育的情況。,囊胚注射法把某些種類細(xì)胞注射入囊胚的囊胚腔中，注射的細(xì)胞可以是卵裂球、內(nèi)細(xì)胞團細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞，甚至是已經(jīng)分化的細(xì)胞。若注入的細(xì)胞參與胚體的形成，那么就形成了嵌合體。注射時，選取健康、生長良好的細(xì)胞。如果是培養(yǎng)細(xì)胞，應(yīng)該保證其整二倍體性。將1012個細(xì)胞吸入到注射吸管的頂端。用固定吸管吸住內(nèi)細(xì)胞團與滋胚層交界處，讓內(nèi)細(xì)胞團位于囊胚的底部位置。調(diào)整注射吸管與固定吸管使處于同一焦點平面，選擇滋胚層細(xì)胞間的“間隙處”，將注射吸管插入囊胚腔。將細(xì)胞推入囊胚腔，使之落到內(nèi)細(xì)胞團之上。操作后的囊胚形態(tài)不規(guī)則，經(jīng)短期培養(yǎng)后，可以恢復(fù)正常狀態(tài)。,有色鼠與白色鼠胚胎融合,胚胎嵌合的鑒定兩種：色素分析

23、法和遺傳分析法色素分析法簡單、直觀，比較實用。一般選用膚色、毛色差異明顯的動物的胚胎作為供體胚，如用白鼠或黑鼠。幼鼠生下45天后，就可以分析其膚色或毛色，懷孕10天左右的小鼠胎兒，眼睛就有色素沉積?；蛘咴诔錾鷷r，檢查眼瞼色素情況，確定是否是嵌合體。,使用同工酶分析,首先分析動物特定的同工酶譜系，然后選擇具有不同圖譜的兩種或多種動物作為供體動物提供胚胎。 如果獲得的動物是嵌合體，那么同工酶譜中應(yīng)顯現(xiàn)與供體動物相對應(yīng)的特定譜帶，不同品種動物的同工酶均有表現(xiàn)。,現(xiàn)在比較常用的是磷酸葡萄糖異構(gòu)酶（GPI）分析，其原理是果糖6磷酸在GPI作用下，產(chǎn)生葡萄糖6磷酸，在6磷酸葡萄糖脫氫酶和NADP作用下，使

24、G6P成為6磷酸葡萄糖酸鹽，NADP還原為NADPH。經(jīng)GPI染液染色，可顯示出同工酶譜帶。 分析時，從嵌合動物中取不同組織器官，勻漿后制成電泳樣本，在醋酸纖維素板上點樣，電泳、染色處理。與標(biāo)準(zhǔn)的同工酶譜對照，鑒定是否是嵌合體。,胚胎嵌合的意義胚胎嵌合技術(shù)可以作為研究分析哺乳動物發(fā)生機制的重要手段，例如研究卵裂球分化潛力，研究性分化機制與性比，研究X染色體失活及其作用和研究胚胎細(xì)胞基因表達的機制；也可以對生理功能分析的應(yīng)用，例如對免疫功能、遺傳病的研究分析；還可以培育雜種個體，甚至是種間雜種；可以通過制作各種組合的嵌合體，培育新的毛皮動物；利用種間移植，分析胎兒和母體的相互關(guān)系。,三、胚胎分割,、胚胎分割的原理 根據(jù)卵裂球具有發(fā)育成為一個個體的全能性的特點，人們就考慮用這種實驗技術(shù)，生產(chǎn)同卵雙胎或多胎，以加速優(yōu)良種群的繁殖。 胚胎的分割在不同時期有不同的分離培養(yǎng)方法，如卵裂球分離培養(yǎng)法、致密