第二章-離心機(jī)的原理與應(yīng)用.ppt

1、第二章 離心機(jī)的原理與應(yīng)用,離心分離技術(shù)是借助于離心機(jī)旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，根據(jù)物質(zhì)顆粒的沉降系數(shù)、質(zhì)量、密度及浮力等因子的不同，而使物質(zhì)分離的技術(shù) 一、離心機(jī)的種類與用途 離心機(jī)有多種多樣。 按用途有分析用、制備用及分析-制備兩用之分； 按結(jié)構(gòu)特點(diǎn)則有管式、吊籃式、轉(zhuǎn)鼓式和碟式等多種； 按離心機(jī)轉(zhuǎn)速的不同，可分為常速(低速)、高速和超速三種。,臺(tái)式高、超速離心機(jī) 0.6-10萬轉(zhuǎn)/分,離心機(jī),制備型,分析型,分析性超速離心機(jī),普通離心機(jī),冰凍離心機(jī),臺(tái)式（或地面式）普通離心機(jī),大容量冰凍離心機(jī) 小于0.6萬轉(zhuǎn)/分,高速冰凍離心機(jī) 0.6-2.5萬,超速冰凍離心機(jī) 2.5-8萬或更高,(分析性超

2、速離心主要用于檢測大分子物質(zhì)的沉降特征和結(jié)構(gòu)等),1常速離心機(jī),常速離心機(jī)又稱為低速離心機(jī)。 其最大轉(zhuǎn)速在6000 rmin以內(nèi)，相對離心力(RCF)在1104g以下 主要用于分離細(xì)胞、細(xì)胞碎片以及培養(yǎng)基殘?jiān)裙绦挝铮痛纸Y(jié)晶等較大顆粒。 低速離心機(jī)的分離形式、操作方式和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)多種多樣，可根據(jù)需要選擇使用。,高速離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為110425104 rmin。相對離心力達(dá)11041105g， 主要用于分離各種沉淀物、細(xì)胞碎片和較大的細(xì)胞器等。 為了防止高速離心過程中溫度升高而使酶等生物分子變性失活，有些高速離心機(jī)裝設(shè)了冷凍裝置，稱高速冷凍離心機(jī)。,2高速離心機(jī),3超速離心機(jī),超速離心機(jī)的轉(zhuǎn)速達(dá)2

3、.51048104 rmin，最大相對離心力達(dá)5105g甚至更高一些。超速離心機(jī)的精密度相當(dāng)高。 分離細(xì)胞器、病毒、蛋白質(zhì)、核酸、多糖等 為了防止樣品液濺出，一般附有離心管帽； 為防止溫度升高，均有冷凍裝置和溫度控制系統(tǒng)； 為了減少空氣阻力和摩擦，設(shè)置有真空系統(tǒng)。 此外還有一系列安全保護(hù)系統(tǒng)、制動(dòng)系統(tǒng)及各種指示儀表等。,二、離心分離方法的選擇,離心分離的方法可分為三類 1差速離心 采用不同的離心速度和離心時(shí)間，使沉降速度不同的顆粒分批分離的方法，稱為差速離心。 操作時(shí)，采用均勻的懸浮液進(jìn)行離心，選擇好離心力和離心時(shí)間，使大顆粒先沉降，取出上清液，在加大離心力的條件下再進(jìn)行離心，分離較小的顆粒。

4、 如此多次離心，使不同大小的顆粒分批分離。,差速離心所得到的沉降物含有較多雜質(zhì)，需經(jīng)過重新懸浮和再離心若干次，才能獲得較純的分離產(chǎn)物。 差速離心主要用于分離大小和密度差異較大的顆粒。操作簡單方便，但分離效果較差。,舉例：,2密度梯度離心 密度梯度離心是樣品在密度梯度介質(zhì)中進(jìn)行離心，使密度不同的組分得以分離的一種區(qū)帶分離方法。 密度梯度系統(tǒng)是在溶劑中加入一定的梯度介質(zhì)制成的。 梯度介質(zhì)應(yīng)有足夠大的溶解度，以形成所需的密度，不與分離組分反應(yīng)，而且不會(huì)引起分離組分的凝聚、變性或失活。,常用的有蔗糖、甘油等。使用最多的是蔗糖密度梯度系統(tǒng)，其梯度范圍是：蔗糖濃度560，密度1.021.30g/cm3。

5、密度梯度的制備可采用梯度混合器，也可將不同濃度的蔗糖溶液，小心地一層層加入離心管中，越靠管底，濃度越高，形成階梯梯度。,離心前，把樣品小心地鋪放在預(yù)先制備好的密度梯度溶液的表面。 離心后，不同大小、不同形狀、有一定的沉降系數(shù)差異的顆粒在密度梯度溶液中形成若干條界面清楚的不連續(xù)區(qū)帶。 各區(qū)帶內(nèi)的顆粒較均一，分離效果較好。 在密度梯度離心過程中，區(qū)帶的位置和寬度隨離心時(shí)間的不同而改變。 隨離心時(shí)間的加長，區(qū)帶會(huì)因顆粒擴(kuò)散而越來越寬。為此，適當(dāng)增大離心力而縮短離心時(shí)間，可以減少區(qū)帶擴(kuò)寬。,3等密度離心 將CsCl2、CsSO4等介質(zhì)溶液與樣品溶液混合，然后在選定的離心力作用下，經(jīng)足夠時(shí)間的離心，銫鹽

6、在離心場中沉降形成密度梯度 樣品中不同浮力密度的顆粒在各自的等密度點(diǎn)位置上形成區(qū)帶。 常用來分離提取核酸、亞細(xì)胞器和質(zhì)粒。,前述密度梯度離心法中，欲分離的顆粒未達(dá)到其等密度位置，故分離效果不如等密度離心法好。 應(yīng)當(dāng)注意的是，銫鹽濃度過高和離心力過大時(shí)，銫鹽會(huì)沉淀管底，嚴(yán)重時(shí)會(huì)造成事故，故等密度梯度離心需由專業(yè)人員經(jīng)嚴(yán)格計(jì)算確定銫鹽濃度和離心機(jī)轉(zhuǎn)速及離心時(shí)間。 此外，銫鹽對鋁合金轉(zhuǎn)子有很強(qiáng)的腐蝕性，故最好使用鈦合金轉(zhuǎn)子，轉(zhuǎn)子使用后要仔細(xì)清洗并干燥。,三、離心條件的確定,離心分離的效果好壞與諸多因素有關(guān)。除了上述的離心機(jī)種類、離心方法、離心介質(zhì)及密度梯度等以外 確定離心機(jī)的轉(zhuǎn)速和離心時(shí)間 還要注意

7、離心介質(zhì)溶液的pH值和溫度等條件。,1離心力 物質(zhì)顆粒在離心場中所受到的離心力(Fc)的大小，決定于顆粒的質(zhì)量(m)和離心加速度(c)：Fc=mc 離心加速度的大小取決于轉(zhuǎn)子的轉(zhuǎn)速和顆粒的旋轉(zhuǎn)半徑：c=2r 式中：轉(zhuǎn)子的角速度(rads)；r：旋轉(zhuǎn)半徑，即顆粒到旋轉(zhuǎn)軸中心的距離(cm)。,若轉(zhuǎn)速以慣用的每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)(rmin)來表示，則=2n/60 代入上式，得到：c =2r =42n2r /3600 式中 n：轉(zhuǎn)子每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)(rmin)。 在說明離心條件時(shí)，低速離心通常以轉(zhuǎn)子每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)表示，如4000 rmin。 而在高速離心時(shí)，特別是在超速離心時(shí)，往往用相對離心力來表示。如：65 000g

8、。,相對離心力是指顆粒所受的離心力與地心引力(重力)之比。即:RCF=Fc/Fg=42n2r /（3600980.6）g 將有關(guān)數(shù)字代入上式，化簡為： RCF=1.1210-5n2rg 式中 RCF：相對離心力(g)；n：轉(zhuǎn)子每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)(rmin)；r：旋轉(zhuǎn)半徑(cm)；g：重力加速度，9806 cms2,轉(zhuǎn)速與RFC的換算：便于進(jìn)行轉(zhuǎn)速和相對離心力之間的換算，人們在式的基礎(chǔ)上制作了三者關(guān)系的列線計(jì)算圖,半徑,相對離心力,轉(zhuǎn)速,方法：三點(diǎn)一線，左對左，右對右,2、轉(zhuǎn)子離心管及選擇 離心管 玻璃離心管質(zhì)雖硬、但脆，不能承受超離心的壓力。 超離心機(jī)離心管：塑料管及不銹鋼管。 注意離心管的平衡 離心

9、時(shí)樣品一般應(yīng)裝滿離心管，否則將可能因有氣泡而使管的外部受壓不均，造成離心管破裂，使轉(zhuǎn)子不平衡產(chǎn)生事故 離心管帽 超離心機(jī)所用離心管一般都附有管帽，離心時(shí)離心管需戴上管帽。,3、轉(zhuǎn)子及選擇 角轉(zhuǎn)子（Type）、水平轉(zhuǎn)子（sw）、垂直轉(zhuǎn)子（v）、區(qū)帶轉(zhuǎn)子（c）等 角轉(zhuǎn)子 指離心管腔與轉(zhuǎn)軸成一定傾角的轉(zhuǎn)子 角度越大，沉降越結(jié)實(shí)，分離效果越好 角度越小，顆粒沉降距離短，沉降速度快，但分離效果差。,顆粒在角轉(zhuǎn)子中沉降時(shí)，先沿離心力方向撞向離心管，然后再沿管壁滑向管底因此管的一側(cè)會(huì)出現(xiàn)顆粒沉積，稱為“壁效應(yīng)”。 最適合差速離心，強(qiáng)度大、方便但加速或減速時(shí)，對樣品有攪動(dòng)。, 水平轉(zhuǎn)子 旋轉(zhuǎn)時(shí)隨著轉(zhuǎn)子的轉(zhuǎn)動(dòng)從

10、垂直懸吊上升到水平位置（約200800rpm）時(shí)。 顆粒在水平轉(zhuǎn)子中的沉降是沿管子方向的，,梯度離心中顆粒沉降區(qū)帶橫過離心管，離心后區(qū)帶不必重新定位 但只有處于樣品區(qū)帶中心的顆粒才直接向管底沉降， 其它顆粒則撞向壁的兩側(cè)，產(chǎn)生“壁效應(yīng)”，但受振動(dòng)和變速攪亂后對流現(xiàn)象小得多。,四、 離心機(jī)的使用 離心法是分離沉淀的一種方法。 它是利用離心機(jī)轉(zhuǎn)動(dòng)產(chǎn)生的離心力，使比重較大的物質(zhì)沉積在管底，以達(dá)到與液體分離的目的。 因液體在沉淀的上部，故稱清亮的液體部分為上清液。,（一）電動(dòng)離心機(jī)的使用方法： 1.將欲離心的液體，置于離心管或小試管內(nèi)。并檢查離心管或小試管的大小是否與離心機(jī)的套管相匹配。 2.取出離心

11、機(jī)的全部套管，并檢查套管底部是否鋪有軟墊，有無玻璃碎片或漏孔（有玻璃碎片必須取出，漏孔應(yīng)該用蠟封?。?。 檢查合格后，將盛有離心液的兩個(gè)試管分別放入套管中，然后連套管一起分置于粗天平的兩側(cè)，通過往離心管與套管之間滴加水來調(diào)節(jié)兩邊的重量使之達(dá)到平衡。,3.將已平衡的兩只裝有離心管的套管，分別放入離心機(jī)相互對應(yīng)的兩插孔內(nèi)。 蓋上離心機(jī)蓋。打開電源開關(guān)。逐檔扭動(dòng)旋鈕，緩慢增加離心機(jī)轉(zhuǎn)速，直至所需數(shù)值。 達(dá)到離心所需時(shí)間后，將轉(zhuǎn)速旋鈕逐步回零，關(guān)閉電源，讓離心機(jī)自然停止轉(zhuǎn)動(dòng)后（不可人為制動(dòng)），取出離心管。,Eppendorf管放置、重量的平衡,離心機(jī),（二）離心機(jī)使用要點(diǎn),工作轉(zhuǎn)速在允許范圍內(nèi) 嚴(yán)格平衡，每只離心管內(nèi)的溶液量應(yīng)相同，對稱放置。 加蓋，防止離心管飛出傷人。 發(fā)現(xiàn)異常立即關(guān)機(jī) 每次離心后要想清楚是留什么、棄什么。,J-30I,高速冷凍離心機(jī),實(shí)例1：,用 途,1. 細(xì)菌，蛋白沉淀 - 核酸提取 - 細(xì)胞/亞細(xì)胞組份