流式細胞技術(shù)和流式細胞儀.ppt

1、第十一章 流式細胞技術(shù)與流式細胞儀,本章內(nèi)容提要,概述,流式細胞儀的定義,流式細胞術(shù)的定義,生物學(xué)顆粒的內(nèi)容,流式細胞儀的發(fā)展史,概述,流式細胞儀的定義:流式細胞儀是以激光為光源，集流體力學(xué)技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測量技術(shù)、計算機技術(shù)以及細胞熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體的新型高科技儀器。,概述,流式細胞術(shù)的定義:應(yīng)用流式細胞儀對于處在快速直線流動狀態(tài)中的細胞或生物顆粒進行快速的、多參數(shù)的定量分析和分選的技術(shù)稱為流式細胞術(shù)。,概述,生物學(xué)顆粒包括大的免疫復(fù)合物、DNA、RNA、蛋白質(zhì)、病毒顆粒、脂質(zhì)體、細胞器、細菌、霉菌、染色體、真核細胞、雜交細胞、聚集細胞等，所檢測的生物顆粒的理化性質(zhì)包

2、括細胞大小、細胞形態(tài)、胞漿顆粒化程度、DNA含量、總蛋白質(zhì)含量、細胞膜完整性和酶活性等。,概述,1934年：Moldavan,1967年：Van Dilla 和Los Alamos,1965年：Kamentsky,1969年：Fulwyler利用Sweet,80年代,90年代,概述,1934年Moldavan 使懸浮的血紅細胞從一個毛細玻璃管中流過，每個通過的細胞可被一個光電裝置記錄下來，這可謂流式細胞儀的最初模型。,概述,1965年Kamentsky用紫外吸收和可見光散射兩個參數(shù)同時測量未染色的細胞，給出了細胞中核酸的含量和細胞大小，奠定了多參數(shù)流式細胞測量的基礎(chǔ)。,概述,1967年Van

3、Dilla 和Los Alamos采用了Crosland-Taylor設(shè)計的層流流動室和氬離子激光器開發(fā)出了液流束、照明光軸，檢測系統(tǒng)三者互相垂直的流式細胞儀，成為目前各種流式細胞測量儀的基礎(chǔ)。,概述,1969年Fulwyler利用Sweet的靜電墨水噴射液滴偏轉(zhuǎn)技術(shù)，建立了流式細胞分選術(shù)。Ehrlich和Wheeless利用飛點掃描技術(shù)和縫掃描技術(shù)使零分辨率的流式細胞儀變成了低分辨率的流式細胞儀。,概述,80年代以來，流式細胞儀的數(shù)據(jù)采集、存儲、顯示、分析日趨完善，隨著樣品制備方法的增多，新的熒光染料和細胞標記物的出現(xiàn)，流式細胞儀的應(yīng)用范圍逐漸擴大。,概述,進入90年代，標本制備儀和自動進樣

4、器的問世，以及適合臨床應(yīng)用的單克隆抗體的增加，使流式細胞儀不僅出現(xiàn)在大專院校和科研單位，它也逐漸進入醫(yī)院的中心實驗室和檢驗科。,第一節(jié) 流式細胞儀的工作原理,第一節(jié) 流式細胞儀的工作原理,一、生物學(xué)顆粒分析原理,二、細胞分選原理,第一節(jié) 流式細胞儀的工作原理,1.樣品的進入流動室：將懸浮分散的單細胞懸液，經(jīng)特異熒光染料染色后，放人樣品管。在氣體壓力的作用下，懸浮在樣品管中的單細胞懸液形成樣品流垂直進入流式細胞儀的流動室，沿流動室的軸心向下流動。,第一節(jié) 流式細胞儀的工作原理,2.鞘液的作用：流動室軸心至外壁的鞘液也向下流動，形成包繞細胞懸液的鞘液流，鞘液和樣品流在噴嘴附近組成一個圓柱流束，自噴

5、嘴的圓形孔噴出，與水平方向的激光束垂直相交，相交點稱為測量區(qū)。,第一節(jié) 流式細胞儀的工作原理,3.信號的產(chǎn)生與接收：染色的細胞在測量區(qū)受激光照射后發(fā)出熒光，同時產(chǎn)生光散射。這些信號分別被光電倍增管和光電二極管接收，經(jīng)過計算機儲存、計算、分析這些數(shù)字化信息，就可得細胞的大小和核酸含量等指標。,第一節(jié) 流式細胞儀的工作原理,當某類細胞的特性與要分選的細胞相同時，流式細胞儀就會在這類細胞形成液滴時給含有這類細胞的液滴充以特定的電荷，帶有電荷的液滴向下落入偏轉(zhuǎn)板間的靜電場時，依所帶電荷的符號分別向左偏轉(zhuǎn)或向右偏轉(zhuǎn)，落入指定的收集器內(nèi)。,第二節(jié) 流式細胞儀的分類和基本結(jié)構(gòu),一、流式細胞儀的分類,（一）流

6、動室與液流驅(qū)動系統(tǒng),（二）激光光源與光束成形系統(tǒng),（三）光學(xué)系統(tǒng),（四）信號檢測與分析,（五）細胞分選器,二、流式細胞儀的基本結(jié)構(gòu),第二節(jié) 流式細胞儀的分類和基本結(jié)構(gòu),一、流式細胞儀的分類 流式細胞儀根據(jù)功能不同可分為臨床型和科研型。 臨床型只有分析功能，沒有分選功能，操作簡便，易學(xué)易掌握。 科研型既有分析功能又有分選功能，可快速將所感興趣的細胞分選出來。,第二節(jié) 流式細胞儀的分類和基本結(jié)構(gòu),一、流式細胞儀的分類 流式細胞儀根據(jù)其結(jié)構(gòu)不同又可分為一般流式細胞儀和狹縫掃描流式細胞儀。 前者的光斑直徑大于被檢細胞體積，只能提供細胞內(nèi)某種生物化學(xué)成分的參數(shù)。,狹縫掃描流式細胞儀被檢細胞直徑大于激光光

7、斑直徑，可計算出細胞直徑大小、核直徑大小、核漿比例等一系列的形態(tài)學(xué)信息的定量資料。,第二節(jié) 流式細胞儀的分類與結(jié)構(gòu),狹縫掃描流式細胞儀,被檢細胞直 徑大于激光光斑 直徑，細胞通過 光束時各部分被 依次掃描。,第二節(jié) 流式細胞儀的分類和基本結(jié)構(gòu),二、流式細胞儀的基本結(jié)構(gòu) （一）流動室與液流驅(qū)動系統(tǒng) 流動室由石英玻璃制成，并在石英玻璃中央開一個孔，供細胞單個流過，檢測區(qū)在該孔的中心，流動室內(nèi)充滿了鞘液,鞘液的作用是將樣品流環(huán)包。 樣品流在鞘流的環(huán)包下形成聚焦，保證每個細胞通過激光照射區(qū)的時間相等，從而得到準確的細胞熒光信息。,第二節(jié) 流式細胞儀的分類和基本結(jié)構(gòu),由右圖可知，空 氣泵產(chǎn)生壓縮空氣，

8、通過鞘流壓力調(diào)節(jié)器 加在鞘液上一恒定的 壓力，這樣鞘液以勻 速運動流過流動室， 在整個系統(tǒng)運行中流 速是不變的。,第二節(jié) 流式細胞儀的分類和基本結(jié)構(gòu),由于激光焦點處能 量分布為正態(tài)分布（見 圖），中心處能量最高。 因此，當樣本速率選擇 高速時，處在樣本流不 同位置的細胞或顆粒， 受激光照射的能量不一 樣，從而被激發(fā)出的熒 光強度也不相同。,第二節(jié) 流式細胞儀的分類和基本結(jié)構(gòu),（二）激光光源與光束成形系統(tǒng) 激光是一種相干光源，它能提供單波 長、高強度及穩(wěn)定性高的光照。由于細胞 的快速流動，每個細胞經(jīng)過光照區(qū)的時間 僅為1s左右，且細胞所攜帶熒光物質(zhì)被 激發(fā)出的熒光信號強弱，與被照射的時間 和激發(fā)

9、光的強度有關(guān)，因此細胞必須達到 足夠的光照強度。,第二節(jié) 流式細胞儀的分類和基本結(jié)構(gòu),（三）光學(xué)系統(tǒng) FCM的光學(xué)系統(tǒng)是由若干組透鏡、濾光片和 小孔組成。 濾光片主要分為： 1.長通濾光片 長通濾光片使特定波長以 上的光通過。 2.短通濾光片 特定波長以下的光通過。 3.帶通濾光片 帶通濾光片允許一定波長 范圍內(nèi)的光通過,第二節(jié) 流式細胞儀的分類和基本結(jié)構(gòu),（四）信號檢測與分析 當細胞攜帶熒光素標記物，通過激光 照射區(qū)時，細胞內(nèi)不同物質(zhì)產(chǎn)生不同波長 的熒光信號。這些信號以細胞為中心，向 空間360度立體角發(fā)射，產(chǎn)生散射光和熒光 信號。,第二節(jié) 流式細胞儀的分類和基本結(jié)構(gòu),（四）信號檢測與分析

10、1.散射光信號 散射光分為前向角散 射和側(cè)向角散射，散射光不依賴任何細胞 樣品的制備技術(shù)(如染色)，稱為細胞的物 理參數(shù)（或稱固有參數(shù)）。 （1）前向角散射 前向角散射與被測細胞 的大小有關(guān) （2）側(cè)向角散射 側(cè)向散射光 可提供細胞內(nèi)精細結(jié)構(gòu)和顆粒性質(zhì)的信息。,第二節(jié) 流式細胞儀的分類和基本結(jié)構(gòu),（四）信號檢測與分析 2.熒光信號 當激光光束與細胞正交 時，一般會產(chǎn)生兩種熒光信號。一種是細 胞自身在激光照射下發(fā)出微弱的熒光信號， 稱為細胞自發(fā)熒光；另一種是經(jīng)過特異熒 光素標記細胞后，受激發(fā)照射得到的熒光 信號，通過對這類熒光信號的檢測和定量 分析能了解所研究細胞的性質(zhì)和數(shù)量。,第二節(jié) 流式細胞

11、儀的分類和基本結(jié)構(gòu),（四）信號檢測與分析 2.熒光信號 （1）熒光信號線性測量和對數(shù)測量 線性放大器的輸出與輸入是線性關(guān)系，細 胞DNA含量、RNA含量、總蛋白質(zhì)含量等的 測量一般選用線性放大測量。在細胞膜表 面抗原等的熒光檢測時通常使用對數(shù)放大 器。,第二節(jié) 流式細胞儀的分類和基本結(jié)構(gòu),（四）信號檢測與分析 2.熒光信號 （2）熒光信號的面積和寬度 熒光信號的面積是采用對熒光光通量進 行積分測量，一般對DNA倍體測量時采用 面積，這是因為熒光脈沖的面積比熒光 脈沖的高度更能準確反映DNA的含量。 熒光信號的寬度常用來區(qū)分雙連體細胞。,第二節(jié) 流式細胞儀的分類和基本結(jié)構(gòu),（四）信號檢測與分析

12、2.熒光信號 （3）光譜重疊的校正 當細胞攜帶兩種熒光受激光激發(fā)而發(fā) 射兩種不同波長的熒光時，理論上可選擇 濾片使每種熒光僅被相應(yīng)的檢測器檢測， 但由于目前所使用的各種熒光染料都是寬 發(fā)射譜性質(zhì)，雖然它們之間發(fā)射峰值各不 相同，但發(fā)射譜范圍有一定的重疊。,第二節(jié) 流式細胞儀的分類和基本結(jié)構(gòu),從右圖中可以看 出，陰影為探測器檢 測光譜的范圍，F(xiàn)ITC 探測器會探測到少量 的PE光譜，而PE探測 器則檢測到較多的 FITC光譜。,第二節(jié) 流式細胞儀的分類和基本結(jié)構(gòu),圖中點A通過透鏡f 成像在A處，而點B通 過透鏡f成像在B處。 在光電倍增管前放上一 小孔，作為空間濾波器， 排除其它雜散光信號， 從

13、而確保了A點光源進不 了B點處，B點光源也 進不了A點處。,第二節(jié) 流式細胞儀的分類和基本結(jié)構(gòu),（五）細胞分選器 1小水滴的形成 壓電晶體帶動流動室振動，液流形成水滴。 噴嘴的振動頻率即每秒鐘產(chǎn)生水滴的 數(shù)目。當噴嘴直徑為50m時，信號頻率 為40kHz，則每秒鐘產(chǎn)生4萬個水滴。若每 秒鐘流出的細胞是1000個，則平均每40個 水滴中只有一個水滴是有細胞的，其他皆 為空白。,第二節(jié) 流式細胞儀的分類和基本結(jié)構(gòu),（五）細胞分選器 2邏輯電路 為了分選細胞，需要細胞在經(jīng)過測量 區(qū)時判斷出哪個細胞滿足了分選的條件， 并產(chǎn)生一個邏輯信號，此信號驅(qū)動充電脈 沖發(fā)生器，使之產(chǎn)生充電脈沖。,第二節(jié) 流式細胞

14、儀的分類和基本結(jié)構(gòu),（五）細胞分選器 3水滴的充電與偏轉(zhuǎn) 當水滴從流束上將要斷開時給整個流 束充電，則水滴從流束上斷開后便帶有同 極性的多余表面電荷。下落的水滴通過一 對平行板電極形成的靜電場時，帶正電荷 的水滴向帶負電的電極板偏轉(zhuǎn)，這樣就可 用容器收集水滴。,第二節(jié) 流式細胞儀的分類和基本結(jié)構(gòu),（六）FCM測量數(shù)據(jù)的存貯、顯示與分析 目前FCM數(shù)據(jù)的存貯的方式均采用列表 排隊(List Mode)方式。目前FCM所采用的 都是多參數(shù)指標，熒光標記物參數(shù)數(shù)量在 逐漸增多。采用List Mode方式可大量節(jié) 約內(nèi)存和磁盤容量。,第三節(jié) 流式細胞儀的主要性能指標,一、熒光測量靈敏度,二、儀器的分辨

15、率,三、前向角散射光檢測靈敏度,四、FCM分析速度,五、FCM分選指標,第三節(jié) 流式細胞儀的主要性能指標,一、熒光測量靈敏度 靈敏度的高低是衡量儀器檢測微弱 熒光信號的重要指標。一般以能檢測到 單個微球上最少標有FITC或PE熒光分子 數(shù)目來表示，現(xiàn)在的FCM均可達到檢測小 于100個熒光分子的指標。,第三節(jié) 流式細胞儀的主要性能指標,二、儀器的分辨率 分辨率是衡量儀器測量精度的指標， 通常用變異系數(shù)CV(Coefficient of Variation)值表示： (是分布的標準誤差，是分布的平均值),第三節(jié) 流式細胞儀的主要性能指標,三、前向角散射光檢測靈敏度 前向角散射光檢測靈敏度是指能夠

16、檢 測到的最小顆粒大小，一般目前商品化的 FCM可以測量到0.20.5左右。,第三節(jié) 流式細胞儀的主要性能指標,四、FCM分析速度 分析速度以每秒分析的細胞數(shù)來表示。 當細胞流過光束的速度超過FCM儀器響應(yīng)速 度時，細胞產(chǎn)生的熒光信號就會丟失，這 段時間稱為儀器的死時間。 死時間越短，儀器處理數(shù)據(jù)越快，一 般可達到3000個/秒6000個/秒左右。大 型機已達到每秒幾萬個細胞。,第三節(jié) 流式細胞儀的主要性能指標,五、FCM分選指標 分選指標主要包括分選速度、分選純 度和分選收獲率。 分選速度指每秒可提取所要細胞的個數(shù)。 分選純度指要分選的目的細胞占分選出 細胞的百分比。 分選收獲率指被分出的細

17、胞與原來溶液 中該細胞的百分比。,第四節(jié) 流式細胞儀應(yīng)用的技術(shù)要求,流式細胞分析儀器是一項集多學(xué)科 知識綜合應(yīng)用的復(fù)雜儀器，除了對儀器 各方面性能指標有嚴格的要求以外，在 實驗設(shè)計與樣品處理方面也需要有豐富 的基礎(chǔ)理論及操作經(jīng)驗。,一、檢測樣品制備的重要性,二、常用的熒光染料與標記染色,三、FCM操作技術(shù)的質(zhì)量控制,第一課件網(wǎng) ,第四節(jié) 流式細胞儀應(yīng)用的技術(shù)要求,一、檢測樣品制備的重要性 因為流式細胞儀測量的是每個細胞 所產(chǎn)生的散射光和熒光信號，如果兩個 或多個細胞間粘連重疊或細胞碎片過多， 都會影響信號的收集及所收集信號的真 實性，所以制備單細胞懸液是進行流式 細胞儀分析最關(guān)鍵的第一步。,第

18、四節(jié) 流式細胞儀應(yīng)用的技術(shù)要求,二、常用的熒光染料與標記染色 散射光信號是激光照在細胞上所產(chǎn)生 的前向光和側(cè)向光信號。熒光信號來自于 細胞的自發(fā)熒光或被分析細胞經(jīng)特異性熒 光標記染色后通過激光束激發(fā)后所產(chǎn)生的。 因此，被分析細胞在制備成單細胞懸液后， 經(jīng)過與熒光染料染色后才能上機進行檢測。,第四節(jié) 流式細胞儀應(yīng)用的技術(shù)要求,三、流式細胞儀操作技術(shù)的質(zhì)量控制 在臨床檢測中，應(yīng)對各個工作環(huán)節(jié)和 儀器性能進行嚴格的質(zhì)量控制和規(guī)范化操 作，以保證各項檢測數(shù)據(jù)和指標的可靠性。,1光路與流路校正,2PMT校準,3絕對計數(shù)的校準,第四節(jié) 流式細胞儀應(yīng)用的技術(shù)要求,1光路與流路校正 主要目的在于確保激光光路與

19、樣品流 處于正交狀態(tài)，使儀器檢測時的變異減少 到最小，從而控制儀器的CV值。在流路校 正物中，有標準大小的熒光微球，其物理 性質(zhì)、生物學(xué)特性和化學(xué)特性均經(jīng)過標定。,第四節(jié) 流式細胞儀應(yīng)用的技術(shù)要求,2PMT校準 流式細胞儀在使用過程中，光電倍 增管隨時間的增加，其放大功率會有所 改變，對樣品檢測的靈敏度會產(chǎn)生影響。 為保證樣品檢測時儀器處于最佳工作狀 態(tài)，采用質(zhì)控品進行PMT校準，必要時 進行電壓補償。,第四節(jié) 流式細胞儀應(yīng)用的技術(shù)要求,3絕對計數(shù)的校準 為保證儀器在計數(shù)時的準確性，儀 器應(yīng)采用絕對計數(shù)標準品建立絕對計數(shù) 標準。該標準品是經(jīng)標定的，如以計算 1000個細胞為1ml，作為設(shè)定標準

20、。 在樣本測定時，以此為標準進行絕對計 數(shù)，從而獲得絕對計數(shù)的標準值。,第五節(jié) FCM的維護及常見故障的排除,一、儀器的維護 1.激光電源的波動范圍應(yīng)小于10%。 2.冷卻水須用過濾器，并保證壓力和流量。 3.室溫在1824，相對濕度小于85%。 4.安裝單獨的可靠的地線。 5.儀器操作必須有經(jīng)過培訓(xùn)的人員操作。 6.樣品和鞘液管道每周應(yīng)用漂白粉液清洗。,第五節(jié) FCM的維護及常見故障的排除,二、常見故障及排除,第五節(jié) FCM的維護及常見故障的排除,二、常見故障及排除,第五節(jié) FCM的維護及常見故障的排除,二、常見故障及排除,第五節(jié) FCM的維護及常見故障的排除,二、常見故障及排除,第六節(jié) 流

21、式細胞儀的臨床應(yīng)用,第六節(jié) 流式細胞儀的臨床應(yīng)用,一、流式細胞儀在免疫學(xué)中的應(yīng)用 流式細胞術(shù)廣泛地應(yīng)用于免疫理論研 究及其臨床實踐，所以有人稱之為現(xiàn)代免 疫技術(shù)基石之一。尤其同單克隆抗體的結(jié) 合應(yīng)用，在淋巴細胞及其亞群分析、淋巴 細胞功能分析、免疫分型、分選、腫瘤細 胞的免疫檢測、研究細胞周期等方面都起 著相當重要的作用。,第六節(jié) 流式細胞儀的臨床應(yīng)用,二、流式細胞儀在血液學(xué)中的應(yīng)用 血液病多為腫瘤性、免疫性和遺傳性 疾病，惡性血液病約占其總數(shù)一半以上。 FCM在血液細胞的分類、分型，造血細胞 分化的研究，血細胞中各種酶的定量分析， 如過氧化物酶、非特異性酯酶等方面應(yīng)用 廣泛。,第六節(jié) 流式細

22、胞儀的臨床應(yīng)用,三、流式細胞儀在細胞生物學(xué)中的應(yīng)用 細胞生物學(xué)研究中，應(yīng)用最頻繁也最 普通的是細胞周期分析，研究細胞周期或 DNA倍體與細胞表面受體及抗原表達的關(guān)系， 包括細胞周期各時相的百分比和細胞周期 動力學(xué)參數(shù)的測定等內(nèi)容。對同一細胞的 參數(shù)測定技術(shù)則導(dǎo)致了對細胞周期的一些 新發(fā)現(xiàn)，典型的方法是吖啶橙雙染色技術(shù)。,第六節(jié) 流式細胞儀的臨床應(yīng)用,四、流式細胞儀在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用 近年來熒光細胞化學(xué)技術(shù)的發(fā)展，以 及熒光探針標記的單克隆抗體，為流式細 胞技術(shù)研究各種腫瘤抗原、腫瘤蛋白、致 癌基因開辟了新途徑，極大地提高了腫瘤 學(xué)的研究水平，并為流式細胞技術(shù)在腫瘤 學(xué)的研究中開辟了更廣闊的應(yīng)用前

23、景。,第六節(jié) 流式細胞儀的臨床應(yīng)用,五、流式細胞儀在AIDS病檢測中的分析 流式細胞術(shù)用于AIDS免疫功能的檢測 是最重要的檢測手段，采用三參數(shù)熒光標 記計數(shù)可對T淋巴細胞及亞群進行分析， 并通過動態(tài)監(jiān)測T細胞亞群可以對HIV感染 者或AIDS發(fā)病者進行區(qū)別。,第六節(jié) 流式細胞儀的臨床應(yīng)用,六、FCM對自身免疫性疾病HLA抗原的分析 利用FCM可以進行HLA-B27HLA-B7 雙標記抗體檢測HLA-B27陽性細胞，同時 又可排出交叉反應(yīng)。通常5897的 強直性脊柱炎患者可檢出這種抗原，而 正常人僅27可檢出這種抗原。FCM 檢測HLA-B27快速、特異、敏感，為強制 性脊柱炎的臨床診斷提供了有力的幫助。,第六節(jié) 流式細胞儀的臨床應(yīng)用,七、流式細胞儀在藥物學(xué)方面的應(yīng)用 流式細胞儀在檢測藥物在細胞中的分 布，研究藥物的作用機制方面應(yīng)用廣泛。 亦可用于篩選新藥，如化療藥物對腫瘤細 胞的凋亡機制，可通過測DNA凋亡峰， Bcl-2凋亡調(diào)節(jié)蛋白等進行觀察。,本章小結(jié),本章簡要介紹了流式細胞術(shù)和流式細胞儀的基本概念。 論述了流式細胞儀的基本原理、流式細胞儀的分類和基本結(jié)構(gòu)、主要性能指標、操