ELISA質(zhì)量控制

1、.,1,酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測法的質(zhì)量控制,.,2,酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）：幾乎所有的可溶性抗原-抗體系統(tǒng)均可用以檢測，它的最小可測值達(dá)ng甚至pg水平，達(dá)到10-810-12g 。其基本方法是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體 ( 聚苯乙烯微量反應(yīng)板 ) 表面，使酶標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行，用洗滌法將液相中的游離成分洗除。常用的 ELISA 法有雙抗體夾心法和間接法，前者用于檢測大分子抗原，后者用于測定特異抗體。 因其方法學(xué)相對簡便，靈敏度高，特異性好，經(jīng)濟(jì)安全等特點而在臨床上廣泛應(yīng)用，但是由于其操作步驟復(fù)雜，一般包括試劑準(zhǔn)備，樣本收集，加樣，溫育，洗滌，顯色，比色，結(jié)果判定等，

2、其中任何一項操作不當(dāng)都會對檢測結(jié)果產(chǎn)生很大影響。因此，必須加強ELISA檢測的全面質(zhì)量控制，保證其結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。,.,3,影響抗原抗體反應(yīng)的原因,一、反應(yīng)物自身因素 不同來源的抗體，反應(yīng)性各有差異，抗體的濃度、特異性和親和力都影響抗原抗體反應(yīng)，為提高試驗的可靠性，應(yīng)選擇高特異性、高親和力的抗體作為診斷試劑。等價帶的寬窄也影響抗原抗體復(fù)合物的形成，單克隆抗體不適用于沉淀反應(yīng)。 抗原的理化性狀、分子量、抗原決定簇的種類及數(shù)目均可影響反應(yīng)結(jié)果。顆粒性抗原出現(xiàn)凝集反應(yīng)，可溶性抗原出現(xiàn)沉淀反應(yīng)，單價抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合不出現(xiàn)沉淀現(xiàn)象。,.,4,影響抗原抗體反應(yīng)的原因,二、環(huán)境條件 (一)電解質(zhì) 抗原與抗

3、體發(fā)生結(jié)合后，由親水膠體變?yōu)槭杷z體的過程中須有電解質(zhì)參與才能進(jìn)一步使抗原抗體復(fù)合物表面失去電荷，水化層破壞，復(fù)合物相互靠攏聚集形成大塊的凝集或沉淀。若無電解質(zhì)參加，則不出現(xiàn)可見反應(yīng)。為了促使沉淀物或凝集物的形成，常用0.85%氯化鈉或各種緩沖液作抗原及抗體的稀釋液及反應(yīng)液。但電解質(zhì)的濃度不宜過高，否則會出現(xiàn)鹽析現(xiàn)象。,.,5,影響抗原抗體反應(yīng)的原因,(二)酸堿度 蛋白質(zhì)具有兩性電離性質(zhì)，因此每種蛋白質(zhì)都有固定的等電點。抗原抗體反應(yīng)必須在合適的pH環(huán)境中進(jìn)行，pH過高或過低都將影響抗原與抗體的理化性質(zhì)抗原抗體反應(yīng)一般在pH為69進(jìn)行。 (三)溫度 抗原抗體反應(yīng)必須在合適的溫度中進(jìn)行，一般以15

4、40為宜，最適宜反應(yīng)溫度為37。某些特殊的抗原抗體反應(yīng)，對溫度有一些特殊的要求，例如冷凝集素在4左右與紅細(xì)胞結(jié)合最好，20以上反而解離。 此外，適當(dāng)振蕩和攪拌也能促進(jìn)抗原抗體分子的接觸，加速反應(yīng)，其作用與反應(yīng)物粒子大小成正比。,.,6,PBS 磷酸鹽緩沖液,一般的有活性的生物制劑都要用它來稀釋,原因就是它具有鹽平衡、可調(diào)整的適宜pH緩沖作用,蒸餾水不具有鹽平衡作用,可以破壞生物蛋白的結(jié)構(gòu)及生物特性；生理鹽水不具有調(diào)整pH的作用,對完整的、具有活性的物質(zhì)不能保證其在最適條件下參與生物反應(yīng),所以使用PBS是首選.PBS也不是萬能的,有的生物活性物質(zhì)需要的條件比PBS還要高,就需要在平衡緩沖液中加入

5、更多的成分,維持最佳的條件保證生物活性物質(zhì)保持其最完整的特性.,.,7,1 試劑,優(yōu)質(zhì)的試劑是保證檢驗質(zhì)量的基礎(chǔ)。近年來，國家采用批檢的形式對ELISA試劑嚴(yán)格把關(guān)，但不同廠家的試劑在使用效果上仍存在差異，試劑質(zhì)量在很大程度上決定了檢測水平，因此在使用之前必須對試劑進(jìn)行嚴(yán)格評估。選擇質(zhì)量好的試劑，在了解某種試劑的組成基礎(chǔ)上選擇多家試劑盒進(jìn)行比較，應(yīng)選擇靈敏度高，特異性好，精密度（CV）好（批內(nèi)CV 值小于15 %），穩(wěn)定性和安全性好，且簡便經(jīng)濟(jì)的試劑。從4冰箱取出的試劑必須放置室溫2030 min 后再啟用，否則水化層的形成可能影響試劑的原始濃度及試劑中溶質(zhì)分子的均勻分布。未用完的試劑和質(zhì)控品

6、應(yīng)密封并及時放回冰箱保存。根據(jù)蛋白質(zhì)在冷凍過程中出現(xiàn)蛋白分子分布改變的特點，試劑正式啟用前應(yīng)充分混勻。所用蒸餾水、去離子水和自行配制的緩沖液等，都必須調(diào)整其pH 值和離子強度等。不同批次的試劑在制作過程中很難保證質(zhì)量完全一致，因此必須選擇和訂購長批號的試劑，并保證保存條件，嚴(yán)格執(zhí)行這一標(biāo)準(zhǔn)可以避免試劑批號改變而重建質(zhì)控體系及重新評估試劑的復(fù)雜過程，并且能夠保證結(jié)果的穩(wěn)定性。,.,8,2 標(biāo)本,患者標(biāo)本中有可能含有干擾試驗的免疫物質(zhì)，導(dǎo)致假陽性或假陰性的結(jié)果，干擾因素一般可分為兩類，即內(nèi)源性和外源性干擾因素。內(nèi)源性干擾因素一般包括類風(fēng)濕因子、補體、高濃度的非特異性免疫球蛋白、異嗜性抗體及某些自身

7、抗體等，避免內(nèi)源性干擾因素主要通過選擇合適的試劑；外源性干擾因素包括標(biāo)本溶血、標(biāo)本被細(xì)菌污染、標(biāo)本貯存時間過長及標(biāo)本凝固等， ELISA 的靈敏度1ng/ml,避免污染，與生化分杯。標(biāo)本在低溫下保存時間過長，IgG可聚合成多聚體，在間接法ELISA測定中會導(dǎo)致本底加深，甚至出現(xiàn)假陽性結(jié)果。通常血清標(biāo)本可在28保存5天，冷凍保存時間會更長。血清標(biāo)本應(yīng)充分離心，否則可因纖維蛋白原非特異吸附于微孔而造成假陽性結(jié)果。冷凍保存標(biāo)本避免反復(fù)凍融，標(biāo)本的反復(fù)凍融會因其所產(chǎn)生的機械剪切力對標(biāo)本中的蛋白等分子產(chǎn)生破壞作用，使抗體效價下降從而引起假陰性結(jié)果。標(biāo)本的采集及分離要注意盡量避免細(xì)菌的污染。此外，標(biāo)本在凍

8、存時會因蛋白質(zhì)局部濃縮分布不均，因此重新溶解的標(biāo)本必須混勻，但不要劇烈振蕩和反復(fù)顛倒。,.,9,3 操作因素,3.1 加樣 加樣器是一種比較精密的工具，其在長時間使用時會因機械磨損或推動桿內(nèi)附著的血痂等原因造成加樣不準(zhǔn)，因此必須定期對加液器進(jìn)行維護(hù)和校準(zhǔn)。每次加不同的標(biāo)本均需更換吸嘴，以免發(fā)生交叉污染；加樣速度不可太快，以免將標(biāo)本加在孔壁上部，并注意不要濺出或產(chǎn)生氣泡，加樣時還應(yīng)注意操作時差對結(jié)果的影響，尤其對競爭法檢測結(jié)果影響更大。因此建議在加酶結(jié)合物和底物時用多道加液器，或者雙人同時加樣以減少操作時差對結(jié)果的影響，另外有些項目在檢測前需要稀釋以減少非特異性反應(yīng)。稀釋的方式非常重要，最佳方式

9、是采用振蕩器混勻，不可隨意改變混勻方式。,.,10,3.2 溫育,3.2.1溫育的溫度：育常采用的溫度有43 、37、室溫或4等。37是實驗室中常用的溫育溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的最適反應(yīng)溫度。抗原抗體反應(yīng)一般在37經(jīng)12 h 產(chǎn)物的生成可達(dá)頂峰，為加速反應(yīng)，可在一定范圍內(nèi)提高反應(yīng)的溫度并在反應(yīng)過程中連續(xù)振蕩來增加抗原抗體接觸的概率?？乖贵w反應(yīng)在4更為徹底，形成的產(chǎn)物更多、更穩(wěn)定，但因所需時間太長，在ELISA檢測中一般不予采用。,.,11,3.2 溫育,3.2.2溫育的方式：溫育方式常采用溫箱法、微波輻射法和水浴法。其中水浴法能較好解決因受熱不均衡所致的周圍孔與中央孔結(jié)果的吸光度差異（

10、即“邊緣效應(yīng)”）。可將ELISA板置于水浴箱中，板底應(yīng)貼著水面，使溫度迅速平衡，為避免蒸發(fā)，可用塑料貼封紙覆蓋板孔。若用溫箱，ELISA板應(yīng)放在濕盒內(nèi)，濕盒要選用傳熱性良好的材料（如金屬等），在盒底墊濕的紗布，最后將ELISA板放在濕紗布上。溫育過程中每塊反應(yīng)板不能重疊放置，防止溫度擴(kuò)散的不均勻性。,.,12,3.3 洗滌,洗滌是ELISA不同于均相免疫學(xué)檢測技術(shù)的一大特征，洗滌在整個ELISA反應(yīng)過程中雖不是一個反應(yīng)步驟，卻非常關(guān)鍵。其目的是去除反應(yīng)體系中與反應(yīng)無關(guān)的成分，包括未結(jié)合的酶結(jié)合物以及反應(yīng)過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。洗滌液通常為含有一定濃度Tween 20 的緩沖液，

11、Tween 20 是一種非離子去垢劑，既含親水基團(tuán)，又含疏水基團(tuán)，在洗滌中的作用機制是借助其疏水基團(tuán)與經(jīng)疏水性相互作用被動吸附于聚苯乙烯固相上蛋白分子的疏水基團(tuán)形成疏水鍵，從而削弱蛋白分子與固相的吸附。同時在其親水基團(tuán)與液相中水分子的結(jié)合作用下，促進(jìn)蛋白質(zhì)分子脫離固相而進(jìn)入液相，最終被洗脫，。必須注意非離子去垢劑的使用濃度，最常用的洗滌液是含0.05 %Tween20，pH為中性的磷酸鹽緩沖液，如果洗滌液中的Tween20 超過0.2% ，可使包被于固相上的抗原抗體解吸附而影響實驗的測定下限。洗滌可采用洗板機或手工洗滌兩種方式，手工洗板則分為浸泡式和流水沖洗式洗滌。無論洗板方式如何，在向板內(nèi)注

12、液時應(yīng)當(dāng)避免氣泡殘留孔內(nèi)，否則會因洗滌液難以進(jìn)入孔中而影響洗滌效果。在采用洗板機洗板時，要保證洗板機上的每個吸液針都能一致地插入板孔底部將洗液完全吸凈，要求洗板后殘液小于2 L ，即人工扣板墊紙不濕，浸泡時間超過45 s。,.,13,3.4 顯色,大多數(shù)情況下ELISA商品多選用HRP 和堿性磷酸酶（ALP）。HRP可催化的底物為過氧化氫，參加反應(yīng)的顯色供氫體有鄰苯二胺（OPD）、鄰聯(lián)甲苯胺（OT）及四甲基聯(lián)苯胺（TMB）等。其中OPD 難溶于水，見光易變質(zhì)，使用前配制，反應(yīng)過程須避光且OPD有一定毒性。TMB 的反應(yīng)產(chǎn)物為藍(lán)色，目視對比鮮明，其性質(zhì)穩(wěn)定，對人體無毒。若選用各類酸性終止液，則會

13、使藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。TMB作底物時的產(chǎn)物檢測波長為450 nm ，ALP 作為標(biāo)記物，其底物一般采用對硝基苯磷酸酯（pNPP），產(chǎn)物為黃色的對硝基酚，吸收波長是405 nm。為了保證結(jié)果的穩(wěn)定性，必須要嚴(yán)格按照試劑盒說明書中規(guī)定的溫度和時間操作，不可隨意改變溫度和時間。,.,14,3.5 比色,ELISA 顯色結(jié)果必須通過酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測，不可由肉眼判斷結(jié)果，因為不同個體的色覺存在差異，尤其是對于乙型肝炎病毒e抗體、乙型肝炎病毒核心抗體這樣的檢測項目，肉眼難以判斷。酶標(biāo)儀應(yīng)采用雙波長進(jìn)行測定，包括對顏色產(chǎn)物敏感和不敏感的2個吸收峰波長，用非敏感波長清除由于容器上的劃痕、指印、背景等造成的干擾。TM

14、B最大吸收波長為450 nm ，非敏感波長為630 nm ，一般不設(shè)空白孔，否則會出現(xiàn)吸光度值為負(fù)值的現(xiàn)象。加入終止液后應(yīng)盡快比色，否則樣本吸光度值會逐漸下降，顯色越深下降越快，應(yīng)在2-30 min 內(nèi)比色。嚴(yán)格按照說明書操作,.,15,3.6 應(yīng)加強檢測儀器的質(zhì)量控制,如定量移液器要定期校準(zhǔn)；洗板機要及時傾倒廢液罐，補充洗滌液，開機后運行沖洗程序（雙蒸水），檢查系統(tǒng)液路系統(tǒng)（有無漏水），檢查吸液和注液速度，關(guān)機運行沖洗程序（雙蒸水），清洗吸針及水箱，儀器外觀清潔；酶標(biāo)儀要定期檢查濾光片是否合格，光源是否穩(wěn)定，機械系統(tǒng)是否有故障，保持外觀清潔，并定期請廠家工程師進(jìn)行保養(yǎng)維修；水浴箱及存放試劑的

15、冰箱要每天監(jiān)測溫度，并有記錄等。,.,16,4 結(jié)果的判定與報告,4.1 結(jié)果的判定 嚴(yán)格依據(jù)試劑盒提供的陽性判定值（C.O）進(jìn)行結(jié)果判定。廠商提供試劑的同時，說明書上列出的C.O值是建立在一系列科學(xué)試驗及統(tǒng)計研究的基礎(chǔ)上，不應(yīng)隨意更改，注意說明書版本更新、換廠家。 定量測定需要制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算結(jié)果。定性試劑禁止用于定量檢測,.,17,4 結(jié)果的判定與報告,.,18,4.2 灰區(qū)的設(shè)置,通常情況下ELISA結(jié)果報告方式為“陰性”或“陽性”，在二者之間有一條明確的分界線，也就是所謂的陽性判定值即C.O值，對于樣本的吸光度值（A）高于C.O值就判斷為陽性，相反則判斷為陰性，然而在實際

16、工作中經(jīng)常會出現(xiàn)樣本A 值位于C.O 值附近的人群，即ELISA 檢測的“灰區(qū)”。在國內(nèi)的傳染性病原體抗原和抗體檢測的ELISA試劑盒中均未涉及到“灰區(qū)”的設(shè)置，僅僅依靠C.O值來決定感染的有無，尤其是對醫(yī)鬧群體的篩查具有較大風(fēng)險。我們在實際工作中發(fā)現(xiàn)，結(jié)果處于C.O值附近的患者重復(fù)性很差，也是容易引起醫(yī)療糾紛的人群。因此對于檢測結(jié)果位于“灰區(qū)”的患者可采用確認(rèn)試驗或追蹤檢測方法加以確診。 “灰區(qū)”是現(xiàn)實事物對人類主觀認(rèn)識的回應(yīng),.,19,4.3 標(biāo)本的復(fù)查,ELISA 手工操作過程復(fù)雜，影響因素較多，即使室內(nèi)質(zhì)控在控，也可能因孔間差異而造成結(jié)果差異，因此制定復(fù)查制度及加大復(fù)查力度可保證結(jié)果的

17、準(zhǔn)確性，比如對乙肝“兩對半”處于“灰區(qū)”的標(biāo)本及少見模式的檢測結(jié)果進(jìn)行復(fù)查。在實際工作中嚴(yán)格執(zhí)行復(fù)查制度。 動態(tài)變化的事物，部分人總是假想為一成不變的,.,20,5 質(zhì)量控制,5.1 室內(nèi)質(zhì)量控制（IQC） 要保證檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確可靠，必須做好IQC，首先要保證實驗室的環(huán)境、儀器設(shè)備與硬件設(shè)施必須處于良好的狀態(tài)，其次要對試劑及測定方法過程進(jìn)行理想化，另外實驗室技術(shù)人員必須經(jīng)過良好的培訓(xùn)。ELISA 定性試驗的臨床意義在于是否檢出病原體，與檢出量無關(guān)。因此質(zhì)量控制要保證試驗的靈敏度，目前國內(nèi)實驗室定性試驗的質(zhì)控規(guī)則還沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，較多單位采用“即刻法”，結(jié)合LeveyJennings 質(zhì)控圖的方

18、法。在每塊反應(yīng)板中除了試劑盒附帶的陰陽性對照外，還要選擇至少2個室內(nèi)質(zhì)控品，其中一個為弱陽性的質(zhì)控品接近C.O值，S/C.O值應(yīng)該為24之間，另一個為陰性質(zhì)控品。認(rèn)真分析每次IQC失控的原因，定期對各項檢測的均值、變異系數(shù)等進(jìn)行比對分析，及時發(fā)現(xiàn)試劑盒檢出能力的變化，采取適當(dāng)?shù)拇胧﹣硖岣邫z測的可靠性。,.,21,5.2 室間質(zhì)量評價（EQA）,EQA 是一種回顧性評價，主要是控制實驗室結(jié)果的準(zhǔn)確性。其要點是保證同一患者的標(biāo)本一樣對待室間質(zhì)評物，必須強調(diào)的是EQA結(jié)果必須同IQC一并分析，找出原因，改進(jìn)工作中的不足，同時指導(dǎo)實驗室選擇合適的試劑盒。 綜上所述，ELISA檢測操作步驟復(fù)雜，可能會影響測定結(jié)果的因素較多，分布在測定操作的各個步驟中，因此必須加強各環(huán)節(jié)的質(zhì)