蛋白定量與純度分析.ppt

1、生物大分子活性物質(zhì)定量與純度分析 1 蛋白質(zhì)定量測定 2粘多糖的定量 3核酸含量的測定 比色法測定 菲林試劑法 孚爾根染色法 紫外法測定 蒽酮法 定磷法 氮元素法測定 旋光法 二苯胺法 重量法測定 地衣酚法 紫外吸收,2 蛋白質(zhì)純度分析 光譜法分析 層析法分析 電泳法分析 N末端法分析 生物活性法分析,.,第一節(jié) 蛋白質(zhì)定量分析 1概況 1.1蛋白含量 蛋白質(zhì)定量分析通常是指測定蛋白質(zhì)溶液中的蛋白質(zhì)的量或蛋白質(zhì)粉劑中蛋白質(zhì)的量。在進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測定時(shí)，首先根據(jù)蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)的特性和實(shí)驗(yàn)室的現(xiàn)有條件來確定測定方法。蛋白質(zhì)含量測定方法有很多，大致可以分為四類， 重量法 定氮法 比色法 氨基酸

2、推算法等,采用的測定方法不同得到的測定結(jié)果有差異。每-種方法有它獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，但是也有它的局限性。 在上述幾種測定方法中測定的數(shù)據(jù)最準(zhǔn)確的，最可靠的屬于定氮法和氨基酸推算法。這兩種測定方法都是通過測定分子中的氮元素或分子結(jié)構(gòu)來確定蛋白質(zhì)含量的。因此，測得的數(shù)據(jù)相對(duì)比較準(zhǔn)確，但是它的實(shí)驗(yàn)步驟比較多，操作比較繁瑣。其他的測定方法相對(duì)簡單一些，是實(shí)驗(yàn)室常用的技術(shù)，靈敏度相對(duì)低一些。 測定蛋白質(zhì)含量通常要采用兩種以上的方法，要根據(jù)蛋白質(zhì)的某些特性選擇不同的方法進(jìn)行測定。將多種方法測得的結(jié)果綜合考慮。,1.2 蛋白質(zhì)濃度測定 蛋白質(zhì)定量分析的方法很多，采用的定量分析方法不同其測定的基本原理也同；得到的結(jié)果

3、有一定的差異。每一種測定方法有它的優(yōu)點(diǎn)，也有它的不足之處。在實(shí)際工作中要根據(jù)蛋白質(zhì)的特性采取相應(yīng)的方法。在諸多分析方法中使用的最多的是比色法。下面分別簡單介紹各種定量分析的基本原理和方法。,1.3測定基本條件 待測溶液在一定的波長照射下會(huì)產(chǎn)生光吸收，在一定的濃度范圍內(nèi)光吸收值的大小與溶液濃度成正比。因此只要測出待測溶液的光吸收值和基準(zhǔn)溶液的光吸收值。便可知道待測溶液的濃度，推算出蛋白質(zhì)的含量。比色分析要考慮以下幾個(gè)條件： (1)溶液 在蛋白質(zhì)的定量分析中，大部分都足采用比色法，而比色法的溶液可分兩大類，即一類是有色溶液，另一類是無色溶液。,1.,a.有色溶液 這是根據(jù)蛋白質(zhì)與某些化中試劑反應(yīng)生

4、成的一類有色溶液，該溶液能與單色光具有互補(bǔ)作用，生成互補(bǔ)色。利用光的互補(bǔ)原理進(jìn)行比色測定。有色溶液包括以下二種 本色溶液：蛋白質(zhì)分子中含有變色基團(tuán)或顯色基團(tuán)，在溶液中會(huì)產(chǎn)生顏色，如血紅蛋白，血藍(lán)蛋白，鐵蛋白，細(xì)胞色素C等。 顯色溶液：蛋白質(zhì)與某些化學(xué)試劑反應(yīng)產(chǎn)生顏色，如雙縮脲，福林酚，茚三酮等試劑。 染色溶液：蛋白質(zhì)與某些燃料結(jié)合，被染上顏色，如考馬斯亮藍(lán)，氨基黑等染料。,b.無色溶液 根據(jù)蛋白質(zhì)分子中含有芳香族氨基酸，在280nm處有最大吸收峰，肽鍵在215nm處有最大吸收峰，利用最大吸收峰的特性進(jìn)行比色測定。,(2)單色光 單色光的互補(bǔ)性：有色溶液與相應(yīng)的單色光生成新的互補(bǔ)色,(4)朗伯-

5、比耳定律(Lambert-Beer) 朗伯-比耳定律(Lambert-Beer)，也稱之為光吸收定律。比色測定要完全遵循朗伯-比耳定律。是指在一定的濃度范圍，溶液的濃度與光吸收值成正比。用公式表示為： 光吸收值(A) =lg(1/T)= KCL T為透射比，K為常數(shù)，C為溶液濃度，L為光程（吸收層厚度） 朗伯-比耳定律同時(shí)反映了溶液厚度L和濃度C對(duì)光吸收的關(guān)系，測定的光吸收值隨光的波長、溶液濃度和溶液的性質(zhì)不同而變化。,2測定方法： 2.1比色測定 2.1.1雙縮脲法： (1)原理 蛋白質(zhì)分子中含有肽鍵(CO-NH-)，因此，具有雙縮脲反應(yīng)的特性。在堿性溶液中蛋白質(zhì)與Cu2+形成紫紅色的絡(luò)合物

6、，絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正。所以它是蛋白質(zhì)和肽類物質(zhì)的特異性測定方法。但此法測定靈敏度不高，一般測試濃度在1-10mg之間，尤其適合于肽類物質(zhì)的測定。,(2)方法： 將蛋白溶液和雙縮脲試劑顯色反應(yīng)，然后在540nm處比色測定，以牛血清清蛋白或者以被測蛋白標(biāo)準(zhǔn)品為基準(zhǔn)液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 (3)影響因素： 干擾雙縮脲測定的因素包括： 在性質(zhì)上類似于氨基酸的化合物，如有機(jī)胺類 肽的緩沖劑，如Tris緩沖劑，可使Cu2+還原，出現(xiàn)紅色沉淀物，干擾測定。,2.1.2福林-酚(Lowry)法： (1)原理： 福林-酚法測定蛋白質(zhì)是在雙縮脲法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。是在堿性溶液中蛋白質(zhì)與Cu2+形成紫紅色

7、的絡(luò)合物，然后該絡(luò)合物再與還原磷鉬酸-磷鎢酸試劑反應(yīng)產(chǎn)生深藍(lán)色溶液。此法適合于蛋白類的定量分析，靈敏度較高，測試范圍在25-250g之間，但專一性不強(qiáng)。 (2)方法： 將蛋白溶液利福林-酚試劑生成顏色反應(yīng)，然后在640nm處比色測定，以牛血清清蛋白或者以被測蛋白標(biāo)準(zhǔn)品為基準(zhǔn)液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 (3)影響因素： 干擾此測定的因素包括：在性質(zhì)上類似于氨基酸或肽的緩沖劑。如呈色反應(yīng)，Cu2+容易被還原，出現(xiàn)紅色沉淀物，干擾測定。,2.1.3考馬斯亮藍(lán)法： (1)原理： 考馬斯亮藍(lán)G250是一種甲基取代的二苯基甲烷，分子中含有多個(gè)磺酸基的染料，在465nm處有最大光吸收值?？捡R斯亮藍(lán)G250的磺酸基能與

8、蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物，引起該染料的最大光吸收值的位置發(fā)生位移，移至595nm處出現(xiàn)最大光吸收值。由于蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物具有很強(qiáng)的光吸收，可大大提高測定蛋白質(zhì)的靈敏度，對(duì)蛋白類的定量分析，最低測試量在1g以上。,(2)方法： 將蛋白溶液和考馬斯亮藍(lán)G-250試劑反應(yīng)生成深藍(lán)色，然后在595nm處比色測定。以牛血清清蛋白或者以被測蛋白標(biāo)準(zhǔn)品為基準(zhǔn)液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 (3)影響因素： 某些去污劑如Triton-100，SDS等對(duì)測定均有一定的干擾。,2.2紫外光吸收法： 2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線法 (1)原理： 蛋白質(zhì)分子中含有芳香族氨基酸(苯丙氨酸，酪氨酸，組氨酸的等)，在280nm處有最大吸收峰。蛋白質(zhì)

9、在最大吸收峰max波長處的吸光值的強(qiáng)弱與蛋白的濃度成正比。這種方法適合于蛋白質(zhì)分子中含有較多芳香族氨基酸的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量分析，對(duì)某些含芳香族氨基酸較少的蛋白質(zhì)，測定靈敏度較低，如膠原蛋白。,(2)方法： 在實(shí)際工作中紫外光吸收法最常用的一種蛋白質(zhì)方法，它是以配制一系列不同濃度的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液以不含被測蛋白的溶液為參比溶液，在同樣條件下測定標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，將測得的數(shù)據(jù)繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后在同樣條件下測定未知樣品的吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得未知樣品的濃度。此法測量比較準(zhǔn)確，但使用的標(biāo)準(zhǔn)曲線隔一段時(shí)間進(jìn)行校正。,2.2.2消光系數(shù)法： (1)原理： 蛋白質(zhì)分子中含有芳香族氨基酸，在280nm處的特定

10、吸光值。蛋白質(zhì)分子中所含氨基酸數(shù)量不同，它們?cè)?80nm處吸光值的強(qiáng)弱就有差異。因此，每一種純的單一蛋白質(zhì)在280nm處有一個(gè)特定的消光系數(shù)。如果已知某個(gè)蛋白質(zhì)的消光系數(shù)，只要在280nm處測定出該蛋白吸光值就可以計(jì)算出其相應(yīng)的含量。計(jì)算公式如下：,測得吸光值 N 1000 測得吸光值 N 10 蛋白質(zhì)濃度(mg/m1) = - = - 消光系數(shù) 100 消光系數(shù) 式中的N為稀釋倍數(shù)，10是常數(shù)，是指在標(biāo)定消光系數(shù)時(shí)，蛋白溶液的濃度為100ml溶液中含有1000mg蛋白質(zhì)，在計(jì)算公式中約分得到常數(shù)10。,例如：胰蛋白酶的消光系數(shù)是13.5。將胰蛋白酶溶液稀釋100倍，測得的光吸收值是0.27，

11、通過上述公式計(jì)算其濃度。 0.2710010 蛋白質(zhì)濃度(mg/m1) = - = 20 13.5,(2)方法： 將待測蛋白稀釋成一定濃度在280nm處測定吸光值(測得的吸光值處落在0.1-1.0范圍內(nèi))。 (3)影響因素： 在蛋白質(zhì)的混合溶液中或在280nm有干擾物質(zhì)存在時(shí)，對(duì)該溶液測定均有較大的影響。不具有普遍性。測試靈敏度所不同。,2.2.3 F因子測定法 (1)原理： 由于蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，因此，蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)。最大吸收峰的波長在280nm處。而在波長 260nm處光吸收較弱。這兩種波長吸光值的強(qiáng)弱與濃度成正比。通過測定蛋白質(zhì)溶液在280n

12、m和260nm處的光吸收值，求出A280/A260的比值，從表中查出F因子，通過計(jì)算公式可以計(jì)算出待測蛋白質(zhì)的含量。,蛋白質(zhì)濃度(mg/m1) = F(l/d) A280 N F：F因子 d：比色杯的厚度 N：稀釋倍數(shù) (2)方法 取一定濃度的蛋白溶液，分別測定280nm和260nm處的光吸收值。求出A280/A260的比值，從F因子表中查出F因子。紫外吸收法測定蛋白質(zhì)含量A280A260的比值與F因子的關(guān)系見表1,表1紫外吸收法測定蛋白質(zhì)含量F因子表1,2.3定氮法 4.3.1凱氏定氮法： (1)原理： 因?yàn)槊恳环N蛋白質(zhì)都有其恒定的含氮量(約為14-16)，只要測出其氮元素的含量就可以推算出

13、其蛋白質(zhì)的量。因此，可以通過測定有機(jī)化合物或蛋白質(zhì)分子中氮元素的含量來推算蛋白質(zhì)的含量。計(jì)算公式如下： 蛋白質(zhì)(mg/ml) = 測得的含氮量 14 6.25 凱氏定氮法是將含氮有機(jī)化合物或蛋白質(zhì)與濃硫酸共熱硝化，有機(jī)氮轉(zhuǎn)變成氨，氨又與硫酸結(jié)合生成硫酸銨，硫酸銨在堿性條件下被分解，放出氨氣，用水蒸汽蒸餾將氨氣蒸出，硼酸吸收，然后用標(biāo)準(zhǔn)堿溶液進(jìn)行滴定。,(2)實(shí)驗(yàn)方法： 蛋白質(zhì)消化氨硫酸銨氨硼酸銨滴定含氮量 蛋白質(zhì)含量。 凱氏定氮法是一種經(jīng)典方法，靈敏度高，使用的儀器比較簡單，但操作比較繁瑣，影響的因素較多，日前使用的不多。 (3) 影響因素: 空氣中的氨氣, 標(biāo)準(zhǔn)堿的濃度,凱氏定氮裝置,1.安

14、全管 2.導(dǎo)管 3.汽水分離管 4.樣品入口 5.塞子 6.冷凝管 7.吸收瓶 8.隔熱液套 9.反應(yīng)管 10.蒸汽發(fā)生瓶,2.3.2原子吸收光譜法 (1)原理： 基本理是通過原子燈發(fā)出的被測元素的特征譜線在通過原子化器時(shí)，被待測元素的基態(tài)原子所吸收，使原子燈發(fā)出的被測元素的特征譜線強(qiáng)弱發(fā)生改變，通過檢測特征譜線的變化來測定原子吸收光譜，利用這些光信號(hào)的變化的強(qiáng)弱測定化合物中各種元素的含量。利用這一性質(zhì)，通過原子吸收光譜儀測定蛋白質(zhì)中的氮元素便可計(jì)算出蛋白質(zhì)的量。 (2)方法： 通過原子吸收光譜儀直接測定蛋白質(zhì)的氮元素，或者通消化后測定消化液中氮元素。這種經(jīng)典方法的測試靈敏度高，操作比較簡單，

15、但需要大型的原子光譜儀，一般的實(shí)驗(yàn)室不具備。,2.4重量法： (1)原理： 在溶液中同時(shí)存在揮發(fā)性溶劑和非揮發(fā)溶質(zhì)，結(jié)冰的溶劑在高真空度的條件下直接升華，溶質(zhì)被干燥，獲得蛋白質(zhì)干粉，然后進(jìn)行重量分析。 (2)方法： 精確吸取一定的蛋白質(zhì)溶液凍干，恒重后，稱重，即得蛋白質(zhì)重量。這種方法適用于比較珍貴的樣品，重量法要求的天平的精度比較高。,3定量分析應(yīng)注意的問題 要使分析方法有較高的靈敏度和準(zhǔn)確性，選擇最佳的測定條件：是十分重要。它包括儀器測量，試樣反應(yīng)和參比溶液等條件。 2.1光學(xué)儀器的最小測量誤差： 任何分光光度計(jì)都有一定的測量誤差，這是由于光學(xué)系統(tǒng)穩(wěn)定性的差異所造成的，實(shí)驗(yàn)條件的瞬間變化，導(dǎo)

16、致讀數(shù)波動(dòng)，對(duì)測定結(jié)果的準(zhǔn)確性有一定的影響，尤其是試樣濃度過高或過低均會(huì)引起的誤差。因此，測定時(shí)合適的吸光度測量范圍是很重要的。根據(jù)Lamber-Beer定律，可以推出測定結(jié)果的相對(duì)誤差。,若要使測定結(jié)果的相對(duì)誤差最小，通過Lamber-Beer定律的方程解，從理論上得出相對(duì)誤差最小值是： 吸光度(A) = 0.434 透光率(T) = 36.8。 也就是說吸光度讀數(shù)應(yīng)控制在光譜儀上最靈敏的范圍內(nèi)， (A) = 0.434、(T) = 36.8。是儀器誤差最小的。,濃度測量的相對(duì)誤差與溶液透射率(T)的關(guān)系如圖所示：圖1,3.2比色測定呈色反應(yīng) 在定量分析中，有許多物質(zhì)的測定是通過化學(xué)反應(yīng)生成

17、顏色后再進(jìn)行比色測定，一般要注意下列問題 (1)顏色反應(yīng)后的生成物必須在選定測定波長有較大的光吸收 (2)顏色反應(yīng)后生成物理化性質(zhì)必須穩(wěn)定，顯色條件容易控制，重復(fù)性好 (3)對(duì)照性好，反應(yīng)物和生成物之間的最大吸收波長之差，差值一般要在60nm以上。,3.3參比溶液的選擇 根據(jù)樣液的性質(zhì)不同，可選擇不同的參比溶液。 (1) 溶劑參比：當(dāng)樣液的組分比較簡單，與其它組分共存對(duì)所測定波長無任何吸收劑為參比。 (2) 溶液參比：參與反應(yīng)的試劑在所測定波長部分干擾，可按照顯色反應(yīng)的條件，選用不加被測試樣品的溶液為參比。 (3)純水參比：試樣與共存組分在測定波長均有較大的吸收，可選用水為空白，先測出試樣和對(duì)

18、照的光吸收值，然后用試樣的吸收值減去對(duì)照的光吸收值即可。,.,4定量分析小結(jié),第二節(jié) 蛋白質(zhì)純度 1概念 1.1蛋白質(zhì)純度 蛋白質(zhì)的純度分析，是從蛋白質(zhì)樣品中確定目標(biāo)蛋白和雜質(zhì)的分析方法，也是蛋白質(zhì)分析中的一類重要方法。任何一個(gè)蛋白質(zhì)制品從理論上說都含有二類組分，即蛋白質(zhì)和雜質(zhì)。 蛋白質(zhì)：是樣品中主要的成分，是分析的目標(biāo)蛋白 雜質(zhì)：是殘留的非目標(biāo)蛋白和殘留的小分子，無機(jī)鹽等 因此，蛋白質(zhì)純度分析方法大致分為兩類。,(1)目標(biāo)蛋白與雜蛋白的分析 (2)目標(biāo)蛋白與非蛋白的分析 從廣義上說蛋白質(zhì)純度一般是指樣品中是否含有雜蛋白的，不包括無機(jī)鹽和有機(jī)小分子的分析鑒定。因?yàn)橛行┑鞍踪|(zhì)要在一定無機(jī)鹽和有機(jī)

19、小分子的保護(hù)下才比較穩(wěn)定。因此，某些產(chǎn)品中要添加一些小分子化合物。但是如果要進(jìn)行蛋白質(zhì)的含量測定，則要包括雜蛋白，無機(jī)鹽和有機(jī)小分子的測定。,1.2蛋白質(zhì)純度的表示方法 一個(gè)天然蛋白或一個(gè)重組蛋白質(zhì)，產(chǎn)品的純度是一個(gè)重要的指標(biāo)。純度的表示方法主要根據(jù)實(shí)際用途區(qū)分。如化學(xué)試劑的純度一樣，主要有化學(xué)純，分析純，優(yōu)級(jí)純等。蛋白質(zhì)的純度通常有兩種方式表示。 (1)工業(yè)用的用百分含量表示：如：95、99、99.9 (2)實(shí)驗(yàn)室用的以用途表示： 有實(shí)驗(yàn)室級(jí)純(1ab) 電泳純(electrophoresis) 色譜純(choromatography)。,2分析的方法： 2.1光譜法： 2.1.1光譜掃描法

20、： 一種純度的蛋白質(zhì)溶液在一定的波長范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描就會(huì)得到一個(gè)特征吸收光譜，可以根據(jù)掃描光譜的吸收曲線的形狀，吸收峰的位置，數(shù)量和大小判斷該蛋白的純度。 用紫外吸收光譜測定樣品的純度，既方便又靈敏，測得結(jié)果可靠，是常用的純度分析方法。 光譜分析的特點(diǎn)：主要是鑒別目標(biāo)蛋白質(zhì)和非蛋白類雜質(zhì)。,2.1.2光吸收比值法： 一種純物質(zhì)在紫外光區(qū)有其最大光吸收峰，如核酸的最大吸收峰在260nm，蛋白質(zhì)的最大吸收峰在280nm。同一溶液在這兩種波場下測得的光吸收值是不同的。利用在280nm和260nm處測得的光吸收值之比，即可得到蛋白質(zhì)的純度。如純核酸的標(biāo)準(zhǔn)光吸收比為A280/A260 = 0.5、純蛋

21、白的標(biāo)準(zhǔn)光吸收比為A280/A260 = 1.8。 特點(diǎn)：僅限于蛋白質(zhì)溶液中含有核酸或核酸溶液中含有蛋白質(zhì)的純度測定。 含有核酸的蛋白質(zhì)溶液，可分別測定其A280和A260，由此吸收差值，用下面的經(jīng)驗(yàn)公式，即可算出蛋白質(zhì)的濃度。蛋白質(zhì)濃度=1.45A2800.74A260 (mg/ml) 此經(jīng)驗(yàn)公式是通過一系列已知不同濃度比例的蛋白質(zhì)（酵母烯醇化酶）和核酸（酵母核酸）的混合液所測定的數(shù)據(jù)來建立的,2.2層析法： 2.2.1原理：一個(gè)純的蛋白質(zhì)在穩(wěn)定的層析條件下，得到的保留值只有一個(gè)，如果得到的層析峰多于一個(gè)就可以視為不純。所以根據(jù)層析峰的數(shù)量判斷物質(zhì)的純度。層析法鑒定蛋白質(zhì)純度的方法有： (1

22、)保留值法 在一定的層析條件下各種蛋白質(zhì)組分在層析柱內(nèi)的保留值是一定的，通過測定蛋白質(zhì)的層析保留值(保留時(shí)間，保留體積)就能確定蛋白質(zhì)組分，從而可以判斷蛋白質(zhì)的純度。如：排阻層析根據(jù)蛋白質(zhì)不同的分子量可得到不同的保留體積，若流速恒定的條件下，其保留時(shí)間也是一定的。圖2,(2)基準(zhǔn)物標(biāo)定法： 已知物內(nèi)標(biāo)法，在被鑒定物的樣品中加入己知基準(zhǔn)物，稱內(nèi)標(biāo)物。通過層析分離，從得到的層析峰的增高或峰的位置來判斷。圖3,2.2.2層析的模式 層析分析鑒定法的方法很多，但根據(jù)層析的分離機(jī)理利方法來分類，大致可分為以下幾類。 根據(jù)蛋白質(zhì)質(zhì)量和分子形狀的層析分離模式 根據(jù)蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)多少和分子極性的差異的層析分離模式 根據(jù)蛋白質(zhì)的帶