轉(zhuǎn)基因技術(shù)與作物育種49.ppt

1、1,第16章 轉(zhuǎn)基因技術(shù)與作物育種,2,作物轉(zhuǎn)基因育種 就是根據(jù)育種目標(biāo)，從供體生物中分離目的基因，經(jīng) DNA重組與遺傳轉(zhuǎn)化或直接運(yùn)載進(jìn)入受體作物，經(jīng)過(guò)篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)的遺傳工程體，并經(jīng)過(guò)田間試驗(yàn)與大田選擇育成轉(zhuǎn)基因新品種或種質(zhì)資源。 轉(zhuǎn)基因作物（GMC，genetically modified crops）,什么是轉(zhuǎn)基因育種?,3,與常規(guī)育種技術(shù)相比，轉(zhuǎn)基因育種在技術(shù)上較為復(fù)雜，要求也很高，但是具有常規(guī)育種所不具備的優(yōu)勢(shì)： 1.拓寬可利用的基因資源； 2.培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高抗優(yōu)良品種提供了嶄新的育種途徑； 3.可以對(duì)植物的目標(biāo)性狀進(jìn)行定向變異和定向選擇； 4. 可以大大提高選擇效率，加快育種

2、進(jìn)程。 此外，還可將植物作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥物等生物制品。,4,Traditional crossbreeding,Recombinant DNA techniques,5,一、轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀,第一節(jié) 作物的轉(zhuǎn)基因技術(shù),自從1983年第一株轉(zhuǎn)基因煙草獲得以來(lái)，至今已有120種植物轉(zhuǎn)基因獲得成功。1996年全球大面積種植，并不斷擴(kuò)大。,國(guó)際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)局（ISAAA）統(tǒng)計(jì)結(jié)果,6,世界銀行下屬機(jī)構(gòu)預(yù)測(cè)，世界范圍內(nèi)轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)業(yè)的交易額： 2005年達(dá)到60億美元； 2010年達(dá)到200億美元， 1500萬(wàn)農(nóng)民種植轉(zhuǎn)基因作物 種植國(guó)家 先后有30多個(gè)國(guó)家批準(zhǔn)了3000多例田間試驗(yàn)，涉

3、及的植物種類有40多種； 2000年有13個(gè)國(guó)家種植商品化轉(zhuǎn)基因植物； 2004年有17個(gè)國(guó)家種植商品化轉(zhuǎn)基因植物。 （2004年） 美國(guó)（59%），阿根廷（20%），加拿大（6%） 中國(guó)（5%），歐洲很少 2004年3月英國(guó)批準(zhǔn)大面積種植轉(zhuǎn)基因，但要求非常嚴(yán)格。 2005年德國(guó)通過(guò)法案，嚴(yán)格限制（包括實(shí)驗(yàn)室研究）。,7,美國(guó)：3900萬(wàn)公頃 加拿大：350萬(wàn)公頃 阿根廷：1350萬(wàn)公頃 中國(guó)：210萬(wàn)公頃,8,轉(zhuǎn)基因作物種類 主要為大豆、玉米、棉花和油菜等，以轉(zhuǎn)基因大豆面積最大。,目標(biāo)性狀 抗除草劑： 2000年使用抗除草劑大豆、玉米和棉花占轉(zhuǎn)基因作物74%。 抗蟲(chóng)和抗病毒?。?000年，B

4、t玉米、 Bt棉花占19%。 耐除草劑+抗蟲(chóng)性雙價(jià)的轉(zhuǎn)基因棉花和玉米占7%。,9,美國(guó)三大轉(zhuǎn)基因作物歷年種植面積,10,First biotech plant product Flavr Savr tomato,11,我國(guó)轉(zhuǎn)基因作物研究與利用概況 我國(guó)是世界上第一個(gè)商品化種植轉(zhuǎn)基因作物的國(guó)家。自行培育的雙價(jià)轉(zhuǎn)基因煙草的抗病蟲(chóng)性達(dá)到60，產(chǎn)量比對(duì)照增加15，產(chǎn)值增加20，1992年每畝增收200元，遺憾的是由于市場(chǎng)的原因現(xiàn)已不推廣。,到1999年我國(guó)已批準(zhǔn)中試的轉(zhuǎn)基因作物有48項(xiàng)：包括水稻、小麥、玉米、番茄、白菜、番木瓜、甜瓜、花生、棉花、煙草、廣藿香等11種作物； 主要目標(biāo)性狀是抗蟲(chóng)、抗病、耐

5、鹽、抗凍、耐儲(chǔ)藏和抗衰老等。 已批準(zhǔn)環(huán)境釋放的有49個(gè)品種，涉及水稻、玉米、大豆、馬鈴薯、番茄、甜椒、線辣椒、棉花、楊樹(shù)、煙草等10種作物。,12,經(jīng)全國(guó)基因工程安全委員會(huì)批準(zhǔn)商品化生產(chǎn)的作物已有： 我國(guó)自行研制開(kāi)發(fā)的抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因棉花（轉(zhuǎn)Bt及Bt+CpTI雙價(jià)抗蟲(chóng)棉）； 2004年種植轉(zhuǎn)基因棉花370萬(wàn)公頃，占棉花種植面積的50% 美國(guó)Monsanto公司開(kāi)發(fā)的Bt抗蟲(chóng)棉； 延遲成熟期的轉(zhuǎn)基因番茄； 抗黃瓜花葉病毒(CMV)轉(zhuǎn)基因番茄； 抗CMV轉(zhuǎn)基因甜椒； 轉(zhuǎn)查爾酮合酶（CHS）反義RNA基因矮牽牛。,13,由中國(guó)農(nóng)科院生物工程中心開(kāi)發(fā)的Bt棉對(duì)棉鈴蟲(chóng)有顯著的抗性。與對(duì)照相比減少農(nóng)藥用量80

6、，并減少用工150個(gè)/hm2，以上兩者可使每公頃節(jié)省1500元，Bt轉(zhuǎn)基因棉種深受棉農(nóng)的歡迎。,14,二、轉(zhuǎn)基因育種的程序,基因分離,體外重組,轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化體,安全性評(píng)價(jià),結(jié)合常規(guī)育種,轉(zhuǎn)基因品種,遺傳穩(wěn)定性評(píng)價(jià),市場(chǎng)開(kāi)發(fā),載體的構(gòu)建,農(nóng)桿菌介導(dǎo) 基因槍轟擊,篩選,15,(一)目的基因的獲得 根據(jù)獲得基因的途徑主要可以分為兩大類： 根據(jù)基因表達(dá)的產(chǎn)物蛋白進(jìn)行基因克?。?從基因組DNA或mRNA序列克隆基因。,1.根據(jù)基因表達(dá)的產(chǎn)物蛋白進(jìn)行基因克隆 主要步驟如下： 利用這種方法人類首次人工合成了胰島素基因。 雖然在早期采用這種方式已經(jīng)成功地克隆了許多基因。 局限性：兼并密碼子 效率低 未知基因及產(chǎn)

7、物,分離蛋白質(zhì),明確氨基酸序列,推導(dǎo)核苷酸序列,人工合成,16,2.從基因組DNA或mRNA序列克隆基因,(1)同源序列法 (Homology Based Candidate Gene Method) 根據(jù)基因家族成員所編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中具有保守氨基酸序列的特點(diǎn)克隆基因家族未知成員。,氨基酸序列比較,設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物,PCR擴(kuò)增,文庫(kù)篩選/RACE,17,(2)表達(dá)序列標(biāo)簽EST是指能夠特異性標(biāo)記某個(gè)基因的部分序列，通常包含了該基因足夠的結(jié)構(gòu)信息區(qū)，可以與其它基因相區(qū)分。主要是通過(guò)cDNA的途徑獲得。 獲得EST的途徑: 大規(guī)模cDNA文庫(kù)測(cè)序 各種mRNA水平的分析手段,mRNA,cDNA,反轉(zhuǎn)

8、錄酶,cDNA文庫(kù),PCR,差異顯示,抑制消減雜交,EST,RACE/文庫(kù)篩選,dbEST,GenBank,18,(3)根據(jù)連鎖圖譜克隆目的基因 圖位克隆技術(shù)(Map-based cloning),19,Marker,cM,1,0.8,a,Gene,c,bp,BAC,染色體步移,亞克隆,cDNA文庫(kù)篩選,互補(bǔ)實(shí)驗(yàn),精細(xì)定位,染色體步移,候選基因,20,(4)轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法 轉(zhuǎn)座子是染色體上一段可復(fù)制、移動(dòng)的 DNA片段。當(dāng)轉(zhuǎn)座子插入到某個(gè)功能基因內(nèi)部時(shí)，就會(huì)引起該基因的失活，并誘導(dǎo)產(chǎn)生突變型；當(dāng)轉(zhuǎn)座子再次轉(zhuǎn)座或切離這一位點(diǎn)時(shí)，失活基因的功能又可得到恢復(fù)。 目前應(yīng)用最為廣泛的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)是Ac/Ds

9、玉米轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)。,插入突變體,篩選突變DNA文庫(kù)，PCR，RACE,鑒定性狀遺傳分析,轉(zhuǎn)座子DNA探針,基因部分DNA探針,篩選野生型DNA文庫(kù)，PCR，RACE,完整目的基因,互補(bǔ)實(shí)驗(yàn),21,(5)差異顯示法 在生物個(gè)體發(fā)育不同階段，或不同的組織與細(xì)胞中或不同環(huán)境下，基因表達(dá)差異。即不同基因有序的時(shí)空表達(dá)方式，叫做基因的差異表達(dá)。差異顯示PCR(differential display-PCR,DD-PCR)是指通過(guò)對(duì)來(lái)源特定組織類型的總mRNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增、電泳，并找出待測(cè)組織和對(duì)照之間的特異擴(kuò)增條帶。,葉mRNA,根mRNA,反轉(zhuǎn)錄,反轉(zhuǎn)錄,PCR,隨機(jī)引物+3 錨定poly(t)引物

10、,PCR,PAGE,葉,根,22,(6) cDNA微陣列, cDNA 芯片 cDNA序列（純樣）機(jī)器點(diǎn)樣在支持物,與熒光標(biāo)記的不同mRNA樣品分別進(jìn)行雜交,通過(guò)激光共聚焦掃描分析不同cDNA序列的雜交信號(hào)強(qiáng)度,判斷該cDNA在不同mRNA樣品中的表達(dá)豐度.,mRNA 1,mRNA 2,23,(6) 電子克隆 in silico cloning 借助于電子計(jì)算機(jī)，利用公布的核酸序列資料，進(jìn)行序列的拼接和組裝最終獲得完整基因序列的技術(shù)，類似于cDNA文庫(kù)的篩選但更加方便和快速。,24,（二）目的基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建,目的基因體外重組到適當(dāng)?shù)囊迅脑斓馁|(zhì)粒中 包括保存用中間載體（大腸桿菌寄主）：pBR3

11、22、pUC、 pBluescript K、pKS,pGEM-T 繁殖載體（大腸桿菌寄主）： JM109, TOP10 植物轉(zhuǎn)化載體（農(nóng)桿菌寄主）： pBI121, pCAM1001,25,分離基因,克隆到某中間載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌,提取質(zhì)粒,限制酶切/連接,克隆到植物表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌,基因槍轉(zhuǎn)化,pKS,pBR332,pGEM-T,JM109, TOP10,HindIII/EcroI T4 ligase,pBI121, pCAM1001,LBA4404, EHA,26,農(nóng)桿菌: used extensively for genetic engineering of plants. 包含Ti

12、質(zhì)粒 Tumor inducing plasmid (bacterial plasmid) T-DNA (Transferred-DNA), 可以轉(zhuǎn)移進(jìn)入植物基因組.,Tumor induced by A. tumefaciens,27,Ti Plasmid,T-DNA region,Left border,Right border,vir genes,ori,已知農(nóng)桿菌附著到植物細(xì)胞后，只留在細(xì)胞間隙中。T-DNA首先在細(xì)菌中被加工、剪切、復(fù)制，然后轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞。,auxin,28,Ti質(zhì)粒是根癌農(nóng)桿菌染色體外的遺傳物質(zhì)，為雙股共價(jià)閉合的環(huán)狀DNA分子，其分子量為95156106D, 約有2

13、00kb組成。 根據(jù)其誘導(dǎo)的植物冠癭瘤中所合成的冠癭堿種類不同，Ti質(zhì)?？梢员环殖伤姆N類型： 章魚(yú)堿型(octopine) 胭脂堿型(nopaline) 農(nóng)桿堿型（agropine） 農(nóng)桿菌素堿型（agrocinopine）或稱琥珀堿型(succinamopine),Ti質(zhì)粒的遺傳特性及類型,29,Ti質(zhì)粒的功能區(qū)域,（1）T-DNA區(qū)（transferred-DNA regions）： 農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞時(shí)，從Ti質(zhì)粒上切割下來(lái)轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞的一段DNA，稱為轉(zhuǎn)移DNA。該DNA片段上的基因與腫瘤的形成有關(guān)。 （2）Vir區(qū)（virulence region） 該區(qū)段上的基因能激活T-DNA

14、轉(zhuǎn)移，使農(nóng)桿菌表現(xiàn)出毒性。T-DNA區(qū)與Vir區(qū)在質(zhì)粒DNA上彼此相鄰，約占Ti質(zhì)粒DNA的三分之一。 （3）Con區(qū)（regions encoding conjugations） 該區(qū)段上存在著與細(xì)菌接合轉(zhuǎn)移的有關(guān)基因（tra），調(diào)控Ti質(zhì)粒在農(nóng)桿菌之間的轉(zhuǎn)移。冠癭堿能激活tra基因，誘導(dǎo)Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)移，因此稱之為接合轉(zhuǎn)移編碼區(qū)。 （4）Ori區(qū)（origin of replication） 該區(qū)段基因調(diào)控Ti質(zhì)粒的自我復(fù)制，故稱之為復(fù)制起始區(qū)。,30,野生型Ti質(zhì)粒直接作為植物基因工程載體，存在如下障礙： Ti質(zhì)粒分子量過(guò)大，一般在160240kb，比pBR322質(zhì)粒大50倍左右； 大型的野

15、生Ti質(zhì)粒上分布著各種限制酶的多個(gè)切點(diǎn)，不能通過(guò)體外DNA重組技術(shù)直接向野生型Ti質(zhì)粒導(dǎo)入外源基因； T-DNA區(qū)內(nèi)含有許多編碼基因，其中Onc基因的產(chǎn)物干擾宿主植物中內(nèi)源激素的平衡，轉(zhuǎn)化細(xì)胞長(zhǎng)成腫瘤，阻礙細(xì)胞的分化和植株的再生； Ti質(zhì)粒不能在大腸桿菌中復(fù)制, 即使得到重組質(zhì)粒，也只能在農(nóng)桿菌中進(jìn)行擴(kuò)增； Ti質(zhì)粒上還存在一些對(duì)于T-DNA轉(zhuǎn)移不起任何作用的基因。,31,雙元載體系統(tǒng):binary Ti vector system,32,載體構(gòu)建中常用的選擇標(biāo)記,如何選擇和篩選轉(zhuǎn)化體同樣是一個(gè)重要問(wèn)題?？茖W(xué)家家一直試圖把轉(zhuǎn)化體帶上一個(gè)標(biāo)記，從而便于選擇和篩選。至今己建立了許多標(biāo)記基因，并已插

16、入各種轉(zhuǎn)化載體中，作為一種標(biāo)記基因。,33,必須具備以下四個(gè)條件： 編碼一種不存在于正常植物細(xì)胞中的酶； 基因較小，可構(gòu)成嵌合基因； 能在轉(zhuǎn)化體中得到充分表達(dá)； 檢測(cè)容易，并且能定量分析。 細(xì)菌篩選標(biāo)記基因： 產(chǎn)物給予細(xì)胞產(chǎn)生一種選擇壓力，致使未轉(zhuǎn)化細(xì)胞不能生長(zhǎng)、發(fā)育與分化。而轉(zhuǎn)化細(xì)胞對(duì)該標(biāo)記產(chǎn)生抗性，不影響其生長(zhǎng)等，從而將轉(zhuǎn)化細(xì)胞選擇出來(lái)，例如， Cat（氯霉抗性基因）。 植物篩選標(biāo)記基因： 強(qiáng)調(diào)給轉(zhuǎn)化細(xì)胞帶上一種標(biāo)記，起報(bào)告和識(shí)別作用，故稱報(bào)告基因。,34,報(bào)告基因: Gus基因（-葡糖苷酸酶基因） 在植物細(xì)胞中所產(chǎn)生的葡糖苷酸酶在檢測(cè)上具有以下特點(diǎn)： 在一定條件下與X-G1ucuioni

17、c acid （5-bromo-4-chioro-3-indoyl-D-glucuronic acid）底物發(fā)生作用，產(chǎn)生藍(lán)色沉淀，既可以用分光光度計(jì)法測(cè)定，又可以直接觀察到植物組織中形成的藍(lán)色斑點(diǎn)。 當(dāng)加入4-甲基傘形酮基和葡萄糖苷酸時(shí)生成4-甲基傘形酮，發(fā)熒光（=465nm）。因而可以用熒光光譜法測(cè)定。由于熒光強(qiáng)度高，本底低，故熒光檢測(cè)極為靈敏。 檢測(cè)容易、迅速并能定量，只需少量植物組織抽提液即可在短時(shí)間內(nèi)測(cè)定完畢。 價(jià)格便宜。,35,36,GFP（綠色熒光蛋白基因）;LUC (螢火蟲(chóng)熒光素酶基因);,報(bào)告基因:,37,啟動(dòng)子的選擇,35S, cauliflower mosaic viru

18、s 35S promoter,CaMV 35S is a strong promoter that is active in essentially all dicot plant tissues.,38,(三受體材料的選擇 受體是指用于接受外源DNA的轉(zhuǎn)化材料。 良好的植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)應(yīng)滿足如下條件： 1、高效穩(wěn)定的再生能力； 2、受體材料要有較高的遺傳穩(wěn)定性； 3、外植體來(lái)源方便，如胚和其它器官等； 4、對(duì)篩選劑敏感； 5、轉(zhuǎn)化率高,39,常用的受體材料有以下幾大類型:,1.愈傷組織再生系統(tǒng) 外植體材料經(jīng)過(guò)脫分化培養(yǎng)誘導(dǎo)形成愈傷組織，轉(zhuǎn)化（帶有目的基因質(zhì)粒的農(nóng)桿菌侵染），分化培養(yǎng)獲得再

19、生植株。 優(yōu)點(diǎn)：外植體來(lái)源廣，繁殖快，易接受外源基因， 轉(zhuǎn)化效率高。 缺點(diǎn)：遺傳穩(wěn)定性差、嵌合體 因此需要連續(xù)的再生系統(tǒng),40,2.直接分化再生系統(tǒng) 外植體材料細(xì)胞不經(jīng)過(guò)脫分化形成愈傷組織階段，而是直接分化出不定芽形成再生植株。 優(yōu)點(diǎn)：周期短、操作簡(jiǎn)單，體細(xì)胞變異小，遺傳穩(wěn)定； 缺點(diǎn)：材料局限，轉(zhuǎn)化率低。,3.原生質(zhì)體再生系統(tǒng) 原生質(zhì)體恢復(fù)細(xì)胞壁具有分化再生能力，是應(yīng)用最早的再生受體系統(tǒng)之一。 優(yōu)點(diǎn)：高效、廣泛地?cái)z取外源DNA或遺傳物質(zhì)，獲得基因型一致的克隆細(xì)胞，所獲轉(zhuǎn)基因植株嵌合體少，適用于多種轉(zhuǎn)化系統(tǒng)； 缺點(diǎn)：不易制備、再生困難和變異程度高。,41,4.胚狀體再生系統(tǒng) 是指具有胚胎性質(zhì)的個(gè)

20、體。 優(yōu)點(diǎn)：個(gè)體數(shù)目巨大、同質(zhì)性好，接受外源基因能力強(qiáng)， 嵌合體少，易于培養(yǎng)、再生。 缺點(diǎn)：技術(shù)含量高，多數(shù)植物不易獲得胚狀體。,5.生殖細(xì)胞受體系統(tǒng) 以生殖細(xì)胞如花粉粒、卵細(xì)胞等受體細(xì)胞進(jìn)行外源基因轉(zhuǎn)化的系統(tǒng)。 一是利用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行小孢子和卵細(xì)胞的單倍體培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)； 二是直接利用花粉和卵細(xì)胞受精過(guò)程進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化，如花粉管導(dǎo)入法，花粉粒浸泡法，子房微針注射法等。,42,（四）轉(zhuǎn)基因方法 概括起來(lái)說(shuō)主要有兩類： 第一類是以載體為媒介的遺傳轉(zhuǎn)化，也稱為間接轉(zhuǎn)移系統(tǒng)法。 第二類是外源目的DNA的直接轉(zhuǎn)化。,43,1.載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移系統(tǒng) 最常見(jiàn)的轉(zhuǎn)基因方法。 將外源基因重組進(jìn)入適合的載體系統(tǒng)

21、，通過(guò)載體將攜帶的外源基因?qū)胫参锛?xì)胞，整合在核染色體組中并隨核染色體復(fù)制和表達(dá)。 農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒（tumor-inducing plasmid）或 Ri質(zhì)粒(root-indcingplasmid)介導(dǎo)法是迄今為止植物基因工程中應(yīng)用最多、機(jī)理最清楚、最理想的載體轉(zhuǎn)移方法。,44,農(nóng)桿菌共培養(yǎng)侵染,誘導(dǎo)愈傷組織,分化生芽,生根,葉盤轉(zhuǎn)化法,(1)葉盤法 雙子葉植物較為常用、簡(jiǎn)單有效的方法。,45,(2)真空滲入法 將適宜轉(zhuǎn)化的健壯植株倒置浸于裝有攜帶外源目的基因的農(nóng)桿菌滲入培養(yǎng)基的容器中，經(jīng)真空處理，造傷，使農(nóng)桿菌通過(guò)傷口感染植株，在農(nóng)桿菌的介導(dǎo)下，發(fā)生遺傳轉(zhuǎn)化。 簡(jiǎn)便、快速、可靠，不需要組織

22、培養(yǎng)。 (3)愈傷組織共培養(yǎng) (4)原生質(zhì)體共培養(yǎng),46,2.外源基因直接導(dǎo)入法 （1）化學(xué)刺激法 細(xì)胞融合劑：聚乙二醇（PEG）、聚乙烯醇（PVC）,47,(2)基因槍轟擊法 （微彈轟擊技術(shù)micro-projectile bombardment) 將外源DNA包裹在微小的鎢粉或金粉顆粒的表面，借助高壓動(dòng)力射入受體細(xì)胞或組織，最后整合到植物基因組并得以表達(dá)。 步驟簡(jiǎn)單易行：適合于大多數(shù)細(xì)胞或組織，克服了受體材料的限制，不必制備原生質(zhì)體，具有相當(dāng)廣泛的應(yīng)用范圍，已經(jīng)成為植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化最有效方法之一。 到目前為止，利用基因槍法已經(jīng)在煙草、豆類和多數(shù)禾本科農(nóng)作物、果樹(shù)花卉和林木等植物上獲得轉(zhuǎn)基因植株

23、。 單子葉植物,48,1. Pericarp sholud be pulled back and the immature embryos (0.5 - 1.0 mm) are removed.,2. The immature embryos are placed on a callus induction medium,high osmotic media prepare calli for transfomation,Transformation is performed by gene gun method,49,50,(4)微注射法 細(xì)胞操作： 利用瓊脂糖包埋、聚賴氨酸粘連和微吸管吸附

24、等方式將受體細(xì)胞（原生質(zhì)體或生殖細(xì)胞）固定，然后將供體DNA或RNA直接注射進(jìn)入受體細(xì)胞。 子房注射法或花粉管通道法： 具有較大子房或胚囊的植株可在田間進(jìn)行活體操作。操作簡(jiǎn)便、成本低。,51,（五）轉(zhuǎn)化體的篩選和鑒定 1.轉(zhuǎn)化體的篩選 外源目的基因轉(zhuǎn)化頻率低 目的基因已被整合到核基因組并表達(dá)轉(zhuǎn)化細(xì)胞更少 使用特異性選擇標(biāo)記基因（selectable marker genes）進(jìn)行標(biāo)記，有效地選擇出真正轉(zhuǎn)化細(xì)胞。 常用選擇標(biāo)記基因： 抗生素抗性基因 除草劑抗性基因 將選擇標(biāo)記基因與適當(dāng)啟動(dòng)子構(gòu)成嵌合基因，克隆到質(zhì)粒載體上，與目的基因同時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。 標(biāo)記基因在受體細(xì)胞表達(dá)，使轉(zhuǎn)化細(xì)胞具有抵抗相應(yīng)抗

25、生素或除草劑的能力而存活下來(lái)。非轉(zhuǎn)化細(xì)胞則被抑制、殺死。,52,2.轉(zhuǎn)化體的鑒定 通過(guò)篩選得到的再生植株初步證明標(biāo)記基因整合進(jìn)入受體細(xì)胞。至于目的基因是否整合到受體核基因組、是否表達(dá)，還必須對(duì)抗性植株進(jìn)一步檢測(cè)。,DNA水平的鑒定 檢測(cè)內(nèi)容：是否整合、拷貝數(shù)、整合位置。 檢測(cè)方法：特異性PCR（以外源基因兩側(cè)序列設(shè)計(jì)引物） Southern雜交（外源目的基因序列為探針）,53,特異性PCR檢測(cè)外源基因整合到受體,54,(2) 轉(zhuǎn)錄水平的鑒定 常用的方法 Northern雜交（標(biāo)記的RNA為探針對(duì)總RNA雜交） RT-PCR 檢測(cè),mRNA,cDNA,PCR,55,56,（3）翻譯水平的鑒定 為

26、檢測(cè)外源基因轉(zhuǎn)錄形成的mRNA能否翻譯，還必須進(jìn)行翻譯或者蛋白質(zhì)水平檢測(cè)。 主要方法：Western雜交 免疫檢測(cè),57,（六）轉(zhuǎn)化體的安全性評(píng)價(jià)和育種利用 根據(jù)有關(guān)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的管理規(guī)定、在可控制的條件下進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)和大田育種利用研究。 通過(guò)轉(zhuǎn)基因方法往往難以直接獲得理想的品種（系）原因：外源基因失活、純合致死、花粉致死、其它性狀變化等。 因此獲得轉(zhuǎn)化體后，應(yīng)結(jié)合雜交、回交、自交等常規(guī)轉(zhuǎn)育手段，最終選育綜合性狀優(yōu)良的轉(zhuǎn)基因品種。,58,第二節(jié) 轉(zhuǎn)基因作物的遺傳特點(diǎn) 少數(shù)外源基因整合到植株能穩(wěn)定遺傳，正常表達(dá)，符合孟德?tīng)栠z傳。 大多失活或表現(xiàn)復(fù)雜的遺傳方式。 原因：外源基因受宿主基因組排斥而發(fā)

27、生片段丟失、重排； 多拷貝； 整合隨機(jī)性； 一、整合機(jī)制 1、同源重組 2、位點(diǎn)特異性重組 3、轉(zhuǎn)座 4、異常重組,59,二、整合后外源基因表現(xiàn) 不表達(dá) 1、基因丟失 2、基因沉默 表達(dá) 1、符合孟德?tīng)栠z傳 2、獨(dú)立轉(zhuǎn)化體之間差異 3、無(wú)規(guī)律,60,第三節(jié) 轉(zhuǎn)基因作物品種的選育,純系育種 回交育種 雜交育種 雜交種,61,第四節(jié) 轉(zhuǎn)基因作物的生物安全性,62,直至今天，轉(zhuǎn)基因作物的安全性在全球范圍內(nèi)引起了激烈的爭(zhēng)論。 反對(duì)者認(rèn)為轉(zhuǎn)基因作物具有極大的潛在危險(xiǎn)，可能會(huì)對(duì)人類健康和人類生存環(huán)境造成威脅。 在歐洲，轉(zhuǎn)基因作物被一些媒體稱之為“惡魔食品”（frankenstein food）。 Fran

28、kenstein是英國(guó)科幻小說(shuō)中由一個(gè)科學(xué)家創(chuàng)造、最終又毀滅了這個(gè)科學(xué)家的怪物。那么，人類研制與種植轉(zhuǎn)基因作物到底是毀滅自己，還是拯救自己呢？,63,對(duì)轉(zhuǎn)基因作物的安全性爭(zhēng)論，國(guó)際上有幾個(gè)典型的事件。 Pusztai事件： 英國(guó)Rowett研究所有位Pusztai博士，他用轉(zhuǎn)雪花蓮凝集素基因的土豆喂大鼠，1998年秋天在英國(guó)電視臺(tái)發(fā)表講話，聲稱大鼠食用了這種土豆后，體重和器官重量減輕，免疫系統(tǒng)受到了破壞。 后果：綠色和平組織、地球之友等反生物技術(shù)組織把這種土豆說(shuō)成“殺手”，并策劃了破壞轉(zhuǎn)基因作物試驗(yàn)地等行動(dòng)，焚燒了印度的兩塊試驗(yàn)田，甚至美國(guó)加州大學(xué)戴維斯分校的非轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)材料也遭破壞，以致研究

29、生畢業(yè)論文都無(wú)法如期完成。 英國(guó)皇家學(xué)會(huì)組織了同行評(píng)審，并于1999年月發(fā)表評(píng)論，指出Pusztai的試驗(yàn)有六方面的錯(cuò)誤：不能確定轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的化學(xué)成分有差異；對(duì)食用轉(zhuǎn)基因土豆的大鼠，未補(bǔ)充蛋白質(zhì)以防止饑餓；供試動(dòng)物數(shù)量少，飼喂幾種不同的食物，且都不是大鼠的標(biāo)準(zhǔn)食物，缺少統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；試驗(yàn)設(shè)計(jì)差；統(tǒng)計(jì)方法不當(dāng)；試驗(yàn)結(jié)果無(wú)一致性等。,64,斑蝶事件： 1999年5月，康奈爾大學(xué)的一個(gè)研究組在Nature雜志上發(fā)表文章，聲稱轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)玉米的花粉飄到一種名叫“馬利筋”的雜草上，用馬利筋葉片飼喂美國(guó)大斑蝶，導(dǎo)致44的幼蟲(chóng)死亡。 這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果在科學(xué)上沒(méi)有說(shuō)服力：玉米的花粉非常重，擴(kuò)散不遠(yuǎn)，在玉米

30、地以外米，馬利筋葉片/CM2上只找到一個(gè)玉米花粉；2000年開(kāi)始在美國(guó)三個(gè)州和加拿大進(jìn)行的田間試驗(yàn)都證明，抗蟲(chóng)玉米花粉對(duì)斑蝶并不構(gòu)成威脅，實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)中用倍于田間的花粉量來(lái)喂大斑蝶的幼蟲(chóng)，也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育有影響。 斑蝶減少的真正原因，一是農(nóng)藥的過(guò)度使用，二是墨西哥生態(tài)環(huán)境的破壞。,65,加拿大“超級(jí)雜草”事件： 由于基因漂流，在加拿大油菜地里發(fā)現(xiàn)了個(gè)別油菜植株可以抗一種、兩種或三種除草劑，因而有人稱此為“超級(jí)雜草”，并怪罪于轉(zhuǎn)基因。 基因漂流并不是從轉(zhuǎn)基因作物開(kāi)始。如果沒(méi)有基因漂流，就不會(huì)有進(jìn)化，世界上也就不會(huì)有這么多種的植物和現(xiàn)在的作物栽培品種。舉例來(lái)說(shuō)，小麥由、三個(gè)基因組組成，它是由分

31、別帶有、基因組的野生種經(jīng)過(guò)基因漂流合成的。所以，以此來(lái)禁止轉(zhuǎn)基因作物，也是沒(méi)有道理的。,66,中國(guó)t抗蟲(chóng)棉破壞環(huán)境事件： 2002年6月3日，南京環(huán)科所與綠色和平組織在北京召開(kāi)會(huì)議，月日China daily上發(fā)表了題為“GM Cotton Damage Enviroment”的文章。 當(dāng)天,綠色和平組織在其網(wǎng)站上刊登了南京環(huán)科所、綠色和平組織顧問(wèn)薛達(dá)元先生長(zhǎng)達(dá)26頁(yè)的英文報(bào)告，從而再次引發(fā)國(guó)際爭(zhēng)論，在歐、美產(chǎn)生巨大反響。 月日德國(guó)農(nóng)業(yè)報(bào)發(fā)表了題為 “中國(guó)研究：棉破壞環(huán)境巨大”。 綠色和平組織的“中國(guó)項(xiàng)目主管”聲稱：“棉農(nóng)將面對(duì)不受控制的超級(jí)害蟲(chóng)”、 “轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉不但沒(méi)有解決問(wèn)題，反而制造了

32、更多的問(wèn)題”、“棉農(nóng)將被迫使用更多、更毒的農(nóng)藥”。 事實(shí)上，抗蟲(chóng)棉在中國(guó)實(shí)踐多年，深受廣大棉農(nóng)的歡迎。中國(guó)、美國(guó)、德國(guó)、加拿大、比利時(shí)、印度等國(guó)的科學(xué)家已在網(wǎng)上紛紛發(fā)表評(píng)論，反駁綠色和平組織的觀點(diǎn)。,67,爭(zhēng)論的實(shí)質(zhì) 現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因作物的安全性已經(jīng)成了國(guó)際貿(mào)易的技術(shù)壁壘。 由于某些媒體的炒作，對(duì)消費(fèi)者的心理和轉(zhuǎn)基因作物的產(chǎn)業(yè)化已經(jīng)產(chǎn)生了很大的負(fù)面影響。 我們的判斷？,68,我們所要了解的-轉(zhuǎn)基因植物的潛在風(fēng)險(xiǎn): 1. 轉(zhuǎn)基因植物釋放引發(fā)“超級(jí)雜草” 目前轉(zhuǎn)入植物的基因以抗除草劑的為多，其次以抗蟲(chóng)和抗病毒，然后是抗逆。 如果這些基因逐漸在野生種群中定居后，就具有選擇優(yōu)勢(shì)的潛在可能，成為難以控制的“超

33、級(jí)雜草”。,69,2. 轉(zhuǎn)基因植物中35S啟動(dòng)子的生物安全性 啟動(dòng)子是基因表達(dá)所必需的，決定了外源基因表達(dá)空間、表達(dá)時(shí)間和表達(dá)強(qiáng)度等，是人們定向改造生物的重要限制因素。 最常用的啟動(dòng)子是35S啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子能夠在植物組織中高水平表達(dá)。因此已經(jīng)被引入許多轉(zhuǎn)基因植物中。 潛在風(fēng)險(xiǎn)問(wèn)題: 35S啟動(dòng)子內(nèi)有一重組熱點(diǎn)。 （1）如果35S啟動(dòng)子插入到隱性病毒基因組旁，可能會(huì)重新活化病毒。 （2）啟動(dòng)子插入到某一編碼毒素蛋白的基因上游，可能會(huì)增強(qiáng)該毒素的合成。 （3）當(dāng)轉(zhuǎn)基因植物被動(dòng)物或人類食用后，35S啟動(dòng)子可能會(huì)插入到某一致癌基因上游，活化并且導(dǎo)致癌變。,70,3. 抗生素抗性標(biāo)記基因的生物安全性

34、抗生素抗性標(biāo)記基因是否導(dǎo)致的在環(huán)境中的傳播。 目前，轉(zhuǎn)基因作物都使用細(xì)菌編碼的抗生素抗性基因作為選擇性標(biāo)記。 在過(guò)去的幾年里，越來(lái)越多的報(bào)道指出:細(xì)菌可以獲得對(duì)多種抗生素的抗性。這導(dǎo)致人們開(kāi)始懷疑：轉(zhuǎn)基因植物中的抗性基因是否會(huì)轉(zhuǎn)移到細(xì)菌中。 抗性標(biāo)記基因是否會(huì)通過(guò)食物在腸道中水平轉(zhuǎn)移至體內(nèi)微生物，從而影響抗生素治療的有效性。 抗性標(biāo)記基因產(chǎn)物是否使人體產(chǎn)生抗藥性（食品安全性）。,71,4. 轉(zhuǎn)基因食品的安全性 1994年美國(guó)Caigene公司的轉(zhuǎn)基因延熟番茄經(jīng)FDA批準(zhǔn)上市，成為第一例通過(guò)安全評(píng)價(jià)的轉(zhuǎn)基因植物食品。 轉(zhuǎn)基因食品對(duì)人類的可能危害主要有3大類： （1）可能含有已知或未知的毒素，對(duì)人

35、體產(chǎn)生毒害作用。（2）可能含有已知或未知的過(guò)敏源，引起人體的過(guò)敏反應(yīng)。（3）食品某些營(yíng)養(yǎng)成分或營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量可能產(chǎn)生變化，使人體出現(xiàn)某種病癥。,國(guó)外對(duì)轉(zhuǎn)基因食品管理的現(xiàn)狀,1. 國(guó)際組織 實(shí)質(zhì)等同原則 表型性狀的等同 成分等同 2000年卡塔赫納生物安全協(xié)定書(shū)62個(gè)國(guó)家簽署 2001年生物安全議定書(shū) 130多個(gè)國(guó)家簽署 2003年生物技術(shù)食品的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估草案 226個(gè)國(guó)家表示歡迎,2. 美國(guó), 1992年美國(guó)公布了轉(zhuǎn)基因作物不需由作市場(chǎng)前評(píng)價(jià)，除非它引起新的安全性問(wèn)題。2000 年4月，在國(guó)會(huì)科學(xué)委員會(huì)下屬的基礎(chǔ)研究委員會(huì)的調(diào)查報(bào)告中，堅(jiān)持認(rèn)為沒(méi)有科學(xué)的證據(jù)之前不能將GMF作為一個(gè)新的食品級(jí)別 200

36、0年1月美國(guó)政府對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米的種植頒布了限令，以防止害蟲(chóng)對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米中毒素形成抗藥性。美國(guó)環(huán)境保護(hù)局限令美國(guó)大部分玉米產(chǎn)區(qū)的農(nóng)場(chǎng)主應(yīng)至少種植20的傳統(tǒng)玉米，在同時(shí)種植玉米和棉花的地區(qū)，傳統(tǒng)玉米要達(dá)到50 2001年7月出臺(tái)了轉(zhuǎn)基因食品管理草案規(guī)定，來(lái)源于植物且被用于人類或動(dòng)物的GMF在進(jìn)入市場(chǎng)之前至少120天，生物工程制造商必須提出申請(qǐng)，并提供此類食品的相關(guān)資料，以確認(rèn)此類食品與相應(yīng)的傳統(tǒng)產(chǎn)品相比具有等同的安全性,3. 歐盟,歐盟對(duì)GMF持反對(duì)態(tài)度，1998年提出轉(zhuǎn)基因技術(shù)安全性之后，其反對(duì)態(tài)度更加強(qiáng)硬。他們對(duì)轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育的農(nóng)作物、家畜以及再加工食品加以抵制，尤其對(duì)美國(guó)的轉(zhuǎn)基因玉米已終止了進(jìn)口，然而對(duì)于西班牙和德國(guó)的轉(zhuǎn)基因玉米卻沒(méi)有采取措施 歐盟的法律由兩項(xiàng)：歐盟理事會(huì)90220令，于1990年4月頒布實(shí)施，該法令中規(guī)定