生化分析常見交叉污染探討與對策ppt課件.ppt

1、生化分析常見交叉污染探討與對策 徐國超,1,一如何理解交叉污染,在A項目測定中所使用的試劑、樣本、反應產(chǎn)物、清洗劑等對B項目的測定產(chǎn)生了不良影響的現(xiàn)象。 A項目與B項目不一定是相鄰項目。,測試項目A,試劑、樣本等殘留,測試項目B,2,引發(fā)交叉污染的原因,生化儀的發(fā)展變化 多項目,多樣本處理 處理能力的提高(高速化) 設計共用機械部分 樣本針,試劑針 比色杯 攪拌棒,生化儀狀態(tài)不良,使用不當 清洗力的低下(日常維護欠缺,儀器老化) 生化儀內(nèi)污垢的積聚 測試順序安排不當 常規(guī)清洗不能有效消除污染,3,二交叉污染的分類,樣本針攜帶污染 試劑針攜帶污染 攪拌棒攜帶污染 清洗系統(tǒng)攜帶污染 比色杯污染 試

2、劑交叉污染,4,三不同類型交叉污染的鑒別方法及原因,1. 樣本針攜帶污染： 目前大多數(shù)全自動生化分析儀采用循環(huán)沖洗式樣本針吸取樣本，當樣本針在清洗不完全，或黏附力增加時，樣本殘留可能會對下一相鄰樣本的檢測結(jié)果造成影響。 原因：樣品針尖彎曲，特富龍涂層剝落，針堵塞，沖洗水沖洗不充分 攜帶污染率主要是體現(xiàn)樣品之間的污染程度,5,樣本針攜帶污染率試驗（一）,同一檢測項目濃度相差較大的a標本（高濃度），b標本（低濃度）。 檢測順序：a 1 , a 2 , b 1 ,b 2 , b3 計算： 評價： 以q小于10%為判斷標準。局限性：結(jié)果與選擇的標本濃度有關系 例1：選擇高濃度的ALT樣本濃度值為202

3、0 U/L，低濃度ALT 樣本第一次檢測結(jié)果40 U/L，第三次檢測結(jié)果20 U/L。 通過計算攜帶污染率q = （40 20）/ 2000 * 100% = 1%。 例2：選擇高濃度的Cl 樣本濃度值為140 mmol/L，低濃度Cl 樣本第一次檢測結(jié)果為86 mmol/L，第三次檢測結(jié)果為80 mmol/L。 通過計算攜帶污染率q = （86 80）/ 60 * 100% = 10%。 上例中，例1的攜帶污染率盡管只有1%，由于結(jié)果正好在醫(yī)學決定水平附近因此對臨床判斷有較大影響。例2的攜帶污 染率盡管達到了10%，但是對于臨床判斷不會產(chǎn)生大的影響。因此，使用該方法評價樣本針攜帶污染需考慮樣

4、本的實際濃度。,6,測試順序：3L 2H 1L 2H 4L 2H 1L 2H 1L 2H 1L （注上述順序前的數(shù)字代表測試數(shù)量，如3L代表連續(xù)測試3個低值樣本） 定義：L L 值為緊跟在低值標本后低值標本的結(jié)果。 H L 值為緊跟在高值標本后低值樣本的結(jié)果 攜帶污染指標= H L結(jié)果的平均值 L L結(jié)果的平均值 判斷標準： 當攜帶污染指標小于 3SD SD是 ( L L ) 結(jié)果的SD值。,樣本針攜帶污染率試驗（二）,7,試劑針攜帶污染,全自動生化分析儀一般采用雙試劑針，即所有項目的一試劑都共用試劑針R1，所有項目的二試劑都共用試劑針R2。試劑針R1或R2在每吸取一次試劑后都會進行一次清洗，

5、之后會 立即吸取下一個項目的試劑。 當自身清洗能力下降，試劑針在吸取試劑時會將部分殘留的前項目試劑成分帶入到后項 目反應杯中，對后項目的檢測結(jié)果造成影響。 從各個項目設置的參數(shù)可知，試劑體積量遠大于樣本體積量。因此試劑針攜帶污染影響程度會高于樣本針攜帶污染。,8,9,攜帶污染實驗方案,目前大部分實驗室開展的生化檢測項目至少都有20項以上，評價全項目之間的攜帶污染會非常耗時，試劑成本消耗量大。且不同儀器的動作原理不完全相同，設計一個較為簡單，合理的實驗方法是需要重點考慮的 內(nèi)容。 試劑針攜帶污染實驗方案原理：通過設置特定的標本檢測順序，每個樣本只做一個項目的檢測，可以控制不同項目的先后吸取順序，

6、實現(xiàn)任何一個 項目都能與其他項目相遇。為了有效評價項目之間攜帶污染影響程度，污染實驗所用病人樣本的混合血清應盡量包含醫(yī)學決定水平濃度,10,試劑針攜帶污染實驗方法,攜帶污染初實驗 假設本次實驗以A, B, C, D, E五個項目來考察各個項目之間的試劑針攜帶污染, 先在生化儀中輸入樣本測試號碼和選擇項目，每個樣本號碼只選擇一個項目，目的是使試劑針吸取項目的順序 完全按照樣本測試號碼的先后順序進行，五個項目的測試 順序見表1。測試完成后，將數(shù)據(jù)輸入到處理表格2和表格3中，按照一定的判斷標準，尋找可能存在的污染項目組合。,11,表3中顯示了試劑之間攜帶污染初實驗后的結(jié)果: a 將表格內(nèi)測試順序號代

7、表的位置處輸入該項目對應的測試結(jié)果， b 對每個測試順序號下面對應的測試結(jié)果和該項目單獨5次重復結(jié)果的均值相比 比值以百分比形式表示，通過考察百分比的大小來初步判斷攜帶污染的可能性。 目前的判斷標準以正負百分之五作為判斷標準，超過范圍時懷疑有攜帶污染。,12,試劑針攜帶污染確認實驗,由攜帶污染初實驗篩選出懷疑有污染的項目組合， 假設 (AB) 同(DE) 即A項目對B項目（A項目做好后緊接著做B項目），D項目對E項目（D項目做好后緊接著做E項目）懷疑有污染。 由于初實驗的項目交叉結(jié)果只是一次測試的結(jié)果， 可能有偶然因素，還必須進行確認實驗。 以(AB)為例，(DE)的情況相同 先單獨做A項目，

8、緊接著連續(xù)測試3次B項目，第一個B項目的結(jié)果受A項目影響最大，第三個B項目的結(jié)果因為有2次自身沖洗，結(jié)果應比較準確。比較第一個B項目檢測結(jié)果同第三個B項目檢測結(jié)果，如果影響百分比同初試結(jié)果影響趨勢和程度相近，可以判斷 A項目對B項目有攜帶污染。 確認實驗檢測順序以(AB ）, (DE)為例 確認實驗步驟（表4） A B1 B2 B3 D E1 E2 E3,13,攪拌棒污染：試劑與樣本、第一試劑與第二試劑的混 勻需要攪拌棒，而攪拌棒如果清洗不完全，或黏附力增加時，殘留試劑可能會對下一檢測結(jié)果造成影響。 鑒別 對同一份血清標本重復測定GGT 或ALT或AST20次以上，結(jié)果重復性較差且有走高趨勢。

9、 原因 攪拌棒特富龍涂層剝落，攪拌棒表面有頑固性污漬，沖洗水沖洗不充分, 可用無水乙醇擦洗攪拌棒,攪拌棒攜帶污染,14,15,4.清洗系統(tǒng)攜帶污染 鑒別： 在樣本測定過程中加做室內(nèi)質(zhì)控，部分項目測定異?；蛘呤Э?在樣本測定過程中以蒸餾水為樣本，多次測定LDH、P、M、TBA，結(jié)果重復性不好。 原因： 干燥棒攜帶污染為多,16,5.比色杯污染 生化分析儀的比色杯大體分為兩種，一 種是循環(huán)使用的（如石英比色杯等），另一種是需要定期更換的（如塑料比色杯等），每個比色杯檢測完畢后，進行清洗，然后繼續(xù)下一個檢測項目的檢測。當由于 各種原因?qū)е履硞€比色杯清洗不完全或該比色杯老化時，吸附在比色杯上的上一個項

10、目的殘留試劑可能會對在這個比色杯中進行的下一個項目的檢測結(jié)果造成影響。 根據(jù)經(jīng)驗，比色杯的污染對結(jié)果影響最大，因為比色杯最難以清洗干凈，且在實際工作中難以判斷該比色杯上一測試的項目。 鑒別： 在每日早晨剛開機時對所有項目做試劑空白測定， 試劑空白吸光度高（終點法）或者試劑空白吸光度變化率高（速率法） TBA（循環(huán)酶速率法）經(jīng)常出現(xiàn)負值 蛋白項目、血脂項目結(jié)果偏高 膽紅素（釩酸鹽法）易出現(xiàn)異常值 原因： 比色杯劃痕較深較多，清洗系統(tǒng)清洗不徹底,17,18,比色杯污染實驗方法,以項目A對BCDE 4個項目比色杯污染,19,不同類型的交叉污染的發(fā)生幾率由高到低排列：,試劑針攜帶污染,攪拌棒攜帶污染,

11、比色杯污染,樣本針攜帶污染,清洗系統(tǒng)攜帶污染,20,用排除法鑒別不同類型的交叉污染的排列順序（在保證試劑質(zhì)量沒有任何問題的前提下）：,樣本針攜帶污染,比色杯污染,試劑針攜帶污染,攪拌棒攜帶污染,清洗系統(tǒng)攜帶污染,21,試劑交叉污染-類型,1. 試劑成分間的直接影響 2.試劑成分間的間接影響 3.反應進程相同 4.影響反應條件,22,試劑交叉污染,1. 試劑成分間的直接影響 前一個測定試劑中直接含有后一個測試試劑所要測定的項目。例如：通常在AMY的R1試劑中含有Ca離子（酶活化劑）,當某樣品作AMY和Ca這兩個檢測項目時，檢測的順序是先檢測AMY，接著檢測Ca。因吸取過AMY的R1試劑針上可能沾

12、有殘留的R1試劑，所以當R1試劑針再吸取Ca試劑時，會引入AMY的R1試劑中含有的Ca離子，這樣對Ca項目的檢測結(jié)果就可能造成正誤差,23,試劑交叉污染,常見試劑成分間的直接影響 葡萄糖（GLU）（氧化酶法）、總蛋白 （TP）與酸性磷酸酶（ACP）試劑中含有較高濃度的鉀（K + ）； 膽堿酯酶（ChE）、總膽固醇（CHOL）、GLU（GOD法）、尿酸（UA）（尿酸酶法）、乳酸脫氫酶（LD）（IFCC法）、羥丁酸脫氫酶 （HBDH）（DGKC法）等試劑中含有磷酸緩沖液； CHOL、TG試劑及高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）試劑中含有膽酸鈉； 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 （ALT）（IFCC法）、天冬氨酸氨

13、基轉(zhuǎn)移酶（AST）（IFCC法）試劑中含有高活性的LD； 以上試劑的交叉污染就分別會對、K+（紫外酶法）、磷（P）、總膽汁酸（TBA）及LD的測定結(jié)果造成干擾,24,試劑交叉污染,2.試劑成分間的間接影響 試劑成分參與反 應：上一個試劑中含有的某種試劑成分與下一反應所要測定的底物有作用，因而干擾下一反應的測定結(jié)果。如：Mg 2+測定試劑的絡合 劑亦能與鐵（Fe）結(jié)合，影響鐵與鐵絡合劑的結(jié)合；直接膽紅素（DBil）（重氮法）試劑含有EDTA，Mg 2+試劑中含有 EDTA，均能與Ca結(jié)合，從而影響Ca的測定；以甘油作為酶保護劑的試劑，會對TG的測定帶來干擾；鈣（MTB法）試劑對K+有 負干擾；C

14、HOL試劑中含有膽固醇酯酶，可水解膽固醇酯形成游離膽固醇，而引起對游離膽固醇測定的干擾。,25,試劑交叉污染,（3）反應進程相同：上一個試劑所引導的反應對下 一個項目的反應進程帶來間接的干擾，下一項目所測定的是前后兩個項目反應的綜合作用結(jié)果。 如：當上一反應產(chǎn)物為H2O2時，則對以Trinder反應產(chǎn)生 顏色的測定結(jié)果引起干擾，如UA對CHOL結(jié)果的影響，CHOL對肌酐（CREA）（酶法）測定結(jié)果的影響，GLU（氧化酶法）對CREA測定結(jié)果的影 響；CK（NAC法）、CK-MB（NAC法）試劑中含有GLU成分，其分析方法的原理中包含GLU的己糖激酶（HK）反應過程，因此可能對GLU的測定 帶來

15、干擾，尤其對GLU的HK法測定可能帶來嚴重干擾。,26,試劑交叉污染,（4）影響反應條件：如上一試劑緩沖液成分改變了下一反應的pH環(huán)境，從而改變反應速率，如 TP（雙縮脲法）測定需在pH89時，蛋白肽鍵才都能與堿性銅溶液作用生成紫色反應，若pH8時，則會導致TP結(jié)果偏低，還直接影響球蛋白、白蛋白/ 球蛋白的結(jié)果； 酶活性測定有最適pH，大多數(shù)酶反應pH在6.07.5之間，ALP、-GT、LDH則在堿性條件下最適宜； CREA（苦味酸速率法） 反應條件為堿性，果糖胺（動力學法）反應條件為酸性，受到污染后反應速率會減慢。CREA（酶法）試劑中含有抗壞血酸氧化酶，影響了氧化還原反應的進程， 會對TB

16、A（酶循環(huán)法）測定結(jié)果有影響。DBil（釩酸鹽氧化法）試劑中含有表面活性劑的酒石酸鹽緩沖液會影響ALT活性，對測定結(jié)果有負干擾。,27,如何消除試劑間的化學污染,（1）為減少試劑間的化學污 染，應定期對儀器進行適當?shù)谋ｐB(yǎng)，如更換管道，用去污劑、酸性洗液清洗比色杯，用去污劑擦清試劑針，用無水乙醇擦洗攪拌棒等。 （2）合理安排檢測項目的順 序：一般在安排項目順序時要求兩個項目間至少要有一個非干擾項目，由于各廠商試劑盒原理不同，內(nèi)含成分不同，故無固定的測定順序格式，需要自己摸索。較好 的做法是將被干擾項目置于干擾項目之前，以消除干擾發(fā)生的可能。一般檢測順序有以下原則：不受上一試劑的干擾；不影響下一試

17、劑測定；不影響測試速 度；充分運用剩余試劑位開展新項目；利用好儀器的功能。 （3）當合理設置測試順序無法消除交叉污染時，可使用生化分析儀的試劑針、比色杯清洗程序，對 試劑針、比色杯進行2次或多次清洗。用堿性清洗液及酸性清洗液交叉沖洗試劑針可以有效地避免攜帶污染。 （4）選用具有抗交叉污染的試劑盒：如在游離膽固醇 試劑中添加膽固醇酯酶抑制劑，以減少膽固醇酯酶水解膽固醇酯而引起對游離膽固醇測定的污染。 （5）部分大型全自動生化分析儀有多個模塊或通道，可以將有化 學污染干擾的項目排在不同的模塊或通道中檢測。,28,第一類：前一測試項目試劑中含有緊跟其后測試項目所要測定的底物。 此時殘留的污染物被帶入

18、下一測試中，與該測試的試劑反應，可能會導致結(jié)果異常。引起這類交叉污染產(chǎn)生的物質(zhì)明確，并且可以定量分析。主要項目有： 1. ALT(IFCC法),AST(IFCC法)含高活性的LDH,會影響其后的LDH結(jié)果。 2. CK-NAC、CK-MB-NAC酶偶聯(lián)測定試劑含高濃度Glucose,會干擾其后的血糖測定，尤其對HK法干擾嚴重。 3. Glu(GOD法)、UA(尿酸酶法)、a-HBDH、 TG、 Ca(偶氮胂III法)、 TC(CHOD- PAP)等均采用磷酸鹽緩沖液,會干擾位于其后無機鹽(P)的結(jié)果。 4. ALP(IFCC-AMP法)，CK-NAC,CK-MB-NAC,TG(GPO法)試劑均含高濃度Mg2+會影響緊隨其后的Mg2+的結(jié)果。 5. TC、HDL-C、HDL-C、LDL-C采用膽固醇氧化酶法的試劑含膽酸鈉，會干擾緊跟其后的TBA結(jié)果，致假性偏高。 6. 以對一硝基苯麥芽七糖苷法(4NP-G4)為底物的AMY試劑含Ca2+濃度高會影響其后測Ca2+的準確性。 7. TG，TC試劑中有LIP，會導致LIP的測試結(jié)果不真實。 該種類型的交叉污染單試劑終點法的受污染項目測試結(jié)果的抬高或降低反映的是攪拌桿的攜帶污染。因為試劑針攜帶進來的上一個測試的干擾物會和下一個試劑發(fā)生反應，由于攜帶量小，一般在試劑空白段（2min）即反應平衡。而雙試劑項目