第五章 DNA體外重組技術(shù)-LXG-2006-4.ppt

1、第五章,DNA體外重組技術(shù),概述,一、DNA重組技術(shù)相關(guān)概念,克隆(clone) 來自于同一始祖的一群相同分子、細(xì)菌、細(xì)胞 或動(dòng)物（常被成為副本或拷貝）。,克隆化(cloning) 獲取大量單一拷貝的過程，也稱無性繁殖。,DNA克隆(DNA cloning),應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）與載體DNA接合成一具有自我復(fù)制能力的DNA分子。 繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞。 再進(jìn)行擴(kuò)增提取獲得大量同一DNA分子，又稱基因克隆(gene cloning)或分子克隆(molecular cloing)。,

2、“克隆”某一基因或DNA片段過程中，將外源DNA插入載體分子所形成的復(fù)制子是雜合分子嵌合DNA，所以DNA克隆又稱重組DNA (recombinant DNA)。,實(shí)現(xiàn)DNA克隆所用的方法及相關(guān)的工作稱DNA重組技術(shù)(recombinant DNA technology)，又稱基因工程(genetic engineering)。,二、DNA重組技術(shù)基本程序,外源DNA的獲取,DNA導(dǎo)入受體菌,目的基因與載體的連接,克隆載體的選擇與構(gòu)建,重組體的篩選,克隆基因的表達(dá),三、DNA重組的基本步驟,+,+,連接,轉(zhuǎn)化、篩選和鑒定陽性克隆,含重組子的陽性克隆,載體,目的基因,分、切、接、轉(zhuǎn)、篩,第一節(jié),

3、DNA體外重組載體的種類與選擇,載體（vector）：能攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞, 并在其中進(jìn)行擴(kuò)增或誘導(dǎo)外源基因表達(dá)的工具。,作為基因工程載體所需具備的基本條件：,1. 有自身的復(fù)制子，能借助自身的復(fù)制和調(diào)控對(duì)攜帶的目的基因進(jìn)行復(fù)制和增殖。,3. 有多個(gè)利于選擇和篩選的遺傳表型或標(biāo)志，包括抗藥性、營(yíng)養(yǎng)缺陷型、噬菌斑形成及顯色反應(yīng)。,2. 有多克隆位點(diǎn)(多種酶單一位點(diǎn))，易于外源DNA分子與載體及重組。,4. 表達(dá)型載體還應(yīng)有強(qiáng)啟動(dòng)子、前導(dǎo)序列、增強(qiáng)子等調(diào)控元件。,（一）按功能分類,（二）按受體細(xì)胞分類,（三）按載體來源分類,一、載體的分類,細(xì)菌培養(yǎng),質(zhì)粒擴(kuò)增并表達(dá)蛋白質(zhì),大腸桿菌,染色質(zhì),質(zhì)

4、粒,定義: 細(xì)菌染色質(zhì)以外的雙鏈環(huán)狀DNA， 能自我復(fù)制和表達(dá)其攜帶的遺傳信息。,二、不同載體的特點(diǎn)與分類 （一）質(zhì)粒載體 1. 質(zhì)粒(plasmid),基因克隆的質(zhì)粒載體具備的特點(diǎn)：,分子相對(duì)較小，具有較高的拷貝數(shù) 含高效的復(fù)制子，可用氯霉素阻止細(xì)菌蛋白 質(zhì)的合成，非使質(zhì)粒的拷貝數(shù)增加。 具有多種遺傳選擇標(biāo)記，包括各種抗藥基因 或營(yíng)養(yǎng)代謝基因等。,抗藥基因或營(yíng)養(yǎng)代謝基因,氨芐青霉素抗性基因（ampr）:編碼-內(nèi)酰胺酶，水解amp -內(nèi)酰胺環(huán)使amp失效 四環(huán)素抗性基因（tetr）：編碼轉(zhuǎn)膜泵將tet從細(xì)胞移出 大腸桿菌LacZ基因：編碼半乳糖苷酶，分解X-gal，使菌落為藍(lán)色。,Ampr,O

5、RI,Tetr,pBR322質(zhì)粒：一種克隆質(zhì)粒,ORI：復(fù)制起始點(diǎn)， 保證高拷貝自我復(fù)制。,結(jié)構(gòu)：,Ampr, Tetr：,兩個(gè)抗性基因用于 篩選陽性克隆。,Pst I, BamH I：,兩個(gè)單酶切位點(diǎn)用于插入目的基因,Ampr,LacZ,MCS,pfxBlue: 克隆質(zhì)粒,MCS：Multiple Clonning Site,提供多個(gè)單酶切位點(diǎn)用于克隆操作,LacZ: 藍(lán)白斑篩選陽性克隆,pUC18/pUC19,pcDNA3：真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒,Pcmv：,CMV增強(qiáng)子/啟動(dòng)子,驅(qū)動(dòng)目的基因在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá),BGH pA：加尾信號(hào),目的基因轉(zhuǎn)錄后加上polyA尾，使其更穩(wěn)定。,（二） 噬菌體,

6、A WB DEF Z J att xis N cl cro O P Q SR,重組區(qū),cos位點(diǎn),cos 位點(diǎn),A,R,A,R,EcoRI,目的基因,EcoRI,EcoRI,插入型,置換型,噬菌體作為載體具有兩個(gè)特點(diǎn), 噬菌體生長(zhǎng)繁殖所必需的序列位于其左右二臂上，噬菌體基因組中央含有30%的DNA是噬菌體生長(zhǎng)所非必需的。, 噬菌體的成熟需要包裝，當(dāng)與外源DNA重組后的大小介于原來的75%105%之間時(shí)，重組的DNA分子才可包裝為成熟的噬菌體顆粒。,噬菌體的種類：,Charon系列、 gt系列、EMBL系列,（三）粘粒載體（cosmid),質(zhì)粒序列：復(fù)制原點(diǎn)，抗性標(biāo)志 噬菌體：cos粘端序列 插

7、入片段長(zhǎng)度可以是載體本身長(zhǎng)度的7-10倍,（四） 酵母人工染色體載體(YAC),質(zhì)粒pBR322衍生物,酵母基因,著絲粒,端粒,自主復(fù)制順序,復(fù)制起點(diǎn)(ori),Ampr基因,組成,用途,構(gòu)建真核生物基因組DNA文庫,第二節(jié),基因工程中常用工具酶,一、限制性核酸內(nèi)切酶(II型),切分子克隆的手術(shù)刀,定義：,由細(xì)菌自己產(chǎn)生的一種能識(shí)別和切割DNA內(nèi)部特定序列的一類核酸酶,有嚴(yán)格的識(shí)別、切割順序，以內(nèi)切方式水解雙鏈DNA中的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生的DNA片段5 端為P，3端為OH。,識(shí)別順序一般為46個(gè)堿基，通常為回文結(jié)構(gòu)，即具有180反向重復(fù)。 如CATATG,(1). 產(chǎn)生平頭末端(blunt en

8、d),Hae,型酶切割雙鏈DNA產(chǎn)生：,一、限制性核酸內(nèi)切酶,EcoR I,(2). 產(chǎn)生粘性末端(sticky end),一、限制性核酸內(nèi)切酶,酶單位定義：,在適當(dāng)反應(yīng)條件下，1h內(nèi)在50l體系中完全酶解1g特定DNA底物所需酶量，定為1個(gè)活性單位。,出售的內(nèi)切酶幾乎均以DNA作底物測(cè)其酶活性單位。,星活性: 酶切反應(yīng)條件不能滿足最適條件,導(dǎo)致某些酶產(chǎn)生第二活性.,EcoR I* GAATTC,AATT,標(biāo)準(zhǔn)的酶切體系,1gDNA，20l總反應(yīng)體積，1U酶，推薦的Buffer和溫度，反應(yīng)1h,酶切體系組成,內(nèi)切酶 根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇，保存，使用，稀釋（避免失活與污染） DNA底物 純度，含量

9、反應(yīng)buffer 嚴(yán)格按產(chǎn)品說明書 高、中、低鹽,酶切反應(yīng)體系的建立：,酶切溫度與時(shí)間,一般為37, 1h,酶切反應(yīng)過程,容積：20l，50l, 酶容積10%, 即甘油 5% 注意混勻 反應(yīng)終止： 三種方法 : 10mM EDTA 或0.1%SDS; 65，20min; 酚/氯仿抽提，乙醇沉淀 酶切鑒定 ：瓊脂糖凝膠電泳,酶切反應(yīng)體系的建立：,二、DNA聚合酶,含3種酶活性：,1. 大腸桿菌DNA聚合酶I,5 3聚合酶活性 5 3外切酶活性 3 5外切酶活性,催化DNA缺口平移反應(yīng),制備DNA探針(5 3外切酶活性)-主要用途 DNA序列分析,應(yīng)用：,二、DNA聚合酶I,2. Klenow片段

10、,隨機(jī)引物標(biāo)記法標(biāo)記探針-主要用途 雙脫氧末端終止法進(jìn)行DNA測(cè)序 cDNA第二鏈的合成 DNA 3突出末端進(jìn)行末端標(biāo)記,用途：,(大腸桿菌DNA聚合酶I大片段， 缺5 3外切酶活性),二、DNA聚合酶I,PCR反應(yīng)-主要用途 DNA測(cè)序,用途：,3. Taq DNA聚合酶(65kD),耐熱， 在7075時(shí)具有最佳的生物活性， 無3 5外切酶活性(無校正功能）,4.反轉(zhuǎn)錄酶(Reverse Transcriptase, RT),功能：,以RNA為模板，以帶3-OH末端的DNA片段為引物， 沿5至3方向合成DNA鏈。,3AAAAAAUCUGUCCUA5,dNTP Mg2+,反轉(zhuǎn)錄酶,3AAAAA

11、AUCUGUCCUA5,5TTTTTTTOH 3,AGACAGGAT3,1. RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性,5TTTTTTT,2. DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性；RNA酶H(35RNA外切酶)活性.,4. 反轉(zhuǎn)錄酶,功能：,后者可降解DNA-RNA雜交分子中的RNA,反轉(zhuǎn)錄酶缺乏35核酸外切酶活性,故未校正功能, 會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)配.,應(yīng)用,最主要是將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,三、DNA連接酶(DNA ligase) 基因工程的縫紉針,催化雙鏈DNA相鄰堿基5P和3-OH間磷酸二酯鍵形成的酶。,T4噬菌體DNA連接酶-最常用,催化兩個(gè)獨(dú)立DNA片段(粘性末端和平末端) 5P和3-OH之間形成磷酸二酯鍵

12、。,主要功能與用途：,催化平末端連接要比粘性末端 效率低得多。,修復(fù)雙鏈DNA分子中單鏈缺口。,三、DNA連接酶(DNA ligase),修復(fù)雙鏈DNA分子中單鏈缺口,并可催化互補(bǔ)粘性末端的連接. 主要用于cDNA第二鏈的合成.,主要功能與用途：,(二) 大腸桿菌DNA連接酶,連接粘性末端可代替T4 DNA連接酶.,四、其他修飾酶,功能：,催化多個(gè)脫氧核苷酸依次加到單鏈或雙鏈DNA分子的3-OH末端。,(一) 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT),用途：,1. 主要作用是在載體或目的基因 3末端加上同源多聚尾巴，形成人工粘性末端，便于DNA重組。,2. DNA 3末端的同位素標(biāo)記。,催化DNA，RN

13、A以及核糖和脫氧核糖三磷酸上的 5 磷酸基團(tuán)水解。,用途：,1. 在連接反應(yīng)中去除載體DNA片段5-P，防止載體自我連接.,2. 用32P標(biāo)記5末端時(shí)，用此酶去除5-P，再用激酶進(jìn)行5的 32P標(biāo)記.,(二) 堿性磷酸酶,功能：,(三) 多聚核苷酸激酶 (四) RNase (五) DNase,第三節(jié) 目的基因的獲得和修飾 -分,通過基因組文庫分離、篩選基因 通過cDNA文庫分離、篩選基因 應(yīng)用PCR或RT-PCR獲得目的基因 人工合成基因,一、采用限制性內(nèi)切酶酶切法直接分離目的基因,從原核基因組中制備 從真核基因組中制備,二、采用PCR或RT-PCR方法制備目的基因,獲得已知的基因 構(gòu)建RT-

14、PCR文庫法并獲得未知基因 計(jì)算機(jī)克隆,三、基因組文庫或cDNA文庫的構(gòu)建和篩選,基因組文庫(genomic library，G文庫)用基因克隆的方法保存宿主細(xì)胞中的DNA重組分子中的集合, 所有重組子所含的插入片段的總和代表某種生物基因組全部核苷酸序列。,分離、篩選基因方法：分子雜交及探針技術(shù),用目的基因上的一段DNA做成探針與文庫中的DNA作核酸雜交，從基因文庫中“釣出”有目的基因的克隆。,G文庫構(gòu)建方法：鳥槍法,cDNA文庫(cDNA library，C文庫)用基因克隆的方法保存在宿主細(xì)胞中的DNA重組體的群體，每一重組子只含一種mRNA信息，這些重組子的總和包含某種生物的全部mRNA序

15、列。,C文庫構(gòu)建方法：,反轉(zhuǎn)錄法合成的cDNA與合適的載體重組并導(dǎo)入宿主細(xì)胞而形成的,分離、篩選基因方法：分子雜交及探針技術(shù),C文庫的優(yōu)勢(shì)與局限性,本方法適用于氨基酸殘基數(shù)目較少的蛋白基因。,缺點(diǎn)：,2. 如目的基因DNA序列需通過氨基酸序 列推測(cè)，難于保證與天然基因序列一 致，往往導(dǎo)致表達(dá)效率大大降低。,使用DNA合成儀,1. 只能合成較小片段的DNA,四、化學(xué)合成法制備基因片段,第四節(jié),目的基因的載體連接 -接，分子克隆的核心,一、PCR產(chǎn)物的克隆策略,（一）限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)添加法 （二）T/A克隆法,定向克隆,將外源DNA片段定向插入到載體中的方法,對(duì)于雙向插入，如為擴(kuò)增型載體并無影

16、響； 如為表達(dá)型載體，反向插入則可導(dǎo)致不表達(dá)，故一定要保證正向插入,常用方法：雙酶切,Nde I,Hind,TA克隆定義,利用嗜熱聚合酶如Taq聚合酶的模板非依賴性末端轉(zhuǎn)移酶活性(在7075活性高)，使PCR產(chǎn)物的3末端加一個(gè)A的粘性端，將其直接克隆至3粘性末端含一個(gè)T的線性克隆載體中.,常規(guī)的克隆方法：,PCR產(chǎn)物,載體,酶切,酶切后PCR產(chǎn)物,酶切后載體,重組分子,連接,不足：,需要酶切,受酶切位點(diǎn)的限制,TA克隆方法(一步PCR克隆),PCR擴(kuò)增,+,連接,轉(zhuǎn)化,藍(lán)白篩選,校正聚合酶,平端PCR產(chǎn)物,（一）粘性末端連接法,用同一種 限制性內(nèi)切酶酶切,DNA連接酶,重組質(zhì)粒,質(zhì)粒,目的基因

17、,適用于插入片段和載體具有相同的粘性末端,高背景(自身環(huán)化),多拷貝插入,雙向(正、反)插入,單酶切,缺陷,二、外源DNA片段和載體的連接,（二）平頭末端連接法,質(zhì)粒,產(chǎn)生平末端的 內(nèi)切酶,DNA連接酶,產(chǎn)生粘性末端 的內(nèi)切酶,核酸酶S1,目的基因,重組質(zhì)粒,產(chǎn)生粘性末端 的內(nèi)切酶,核酸酶S1,本法適用于在質(zhì)粒 和目的基因上沒有相 同的酶切位點(diǎn)！,（三）人工接頭法,用同一種 限制性內(nèi)切酶酶切,DNA連接酶,重組質(zhì)粒,質(zhì)粒,目的基因,+,+,DNA連接酶,接頭(linker),本法適用于在質(zhì)粒和 目的基因上沒有相同的 酶切位點(diǎn),（四）同聚物接尾法,DNA連接酶,重組質(zhì)粒,質(zhì)粒,目的基因,內(nèi)切酶,

18、末端轉(zhuǎn)移酶 +dGTP,末端轉(zhuǎn)移酶 +dCTP,本法適用于在質(zhì)粒 和目的基因上沒有相 同的酶切位點(diǎn),連接反應(yīng)：,16，16h,如何實(shí)現(xiàn)？,第五節(jié),重組分子的擴(kuò)增和鑒定,宿主細(xì)胞：被導(dǎo)入重組分子的細(xì)胞,宿主細(xì)胞,原核細(xì)胞：大腸桿菌、鏈霉菌 及枯草桿菌,真核細(xì)胞：酵母、昆蟲細(xì)胞及哺乳動(dòng)物細(xì)胞,一、重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞-轉(zhuǎn),大腸桿菌的轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化(transformation),轉(zhuǎn)化原意：細(xì)菌細(xì)胞的生物學(xué)特性由于受納了外源DNA而發(fā)生可遺傳的改變。,質(zhì)粒DNA或以質(zhì)粒為載體構(gòu)建的重組DNA導(dǎo)入細(xì)菌的過程,轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵：感受態(tài)細(xì)菌的制備,感受態(tài)細(xì)胞-competent cell,用理化方法人工誘導(dǎo)細(xì)

19、胞，使之處于易于吸收和容納外源DNA分子的狀態(tài)，此時(shí)的細(xì)菌稱。,轉(zhuǎn)化原理及轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染程序,大腸桿菌,膨脹成球形,DNA,抗DNA酶的羥基-鈣磷酸復(fù)合物,細(xì)胞表面,細(xì)胞吸收,分裂增殖,原理,化學(xué)轉(zhuǎn)化法,重組質(zhì)粒的導(dǎo)入方法,化學(xué)法：需感受態(tài)細(xì)胞 電擊法：不需感受態(tài)細(xì)胞,轉(zhuǎn)化程序：,對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌,感受態(tài)細(xì)菌(4保存24h),重組質(zhì)粒DNA+細(xì)菌,熱休克(42,90s),普通培養(yǎng)基溫育,涂布于含抗生素的培養(yǎng)基平板,單菌落,基因?qū)胙b置(Bio-Rad),噬菌體轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞,體外包裝,在離體條件下，將提取的包裝蛋白與帶COS位點(diǎn)的DNA混合，產(chǎn)生噬菌體顆粒的過程。,通過噬菌體的釋放和感染將DNA從一

20、個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞的過程。,轉(zhuǎn)導(dǎo)-transduction,體外包裝,噬菌體的頭部蛋白,完整的噬菌體顆粒,DNA重組分子,大腸桿菌,體外包裝液已商品化, 106噬菌斑/gDNA,1034噬菌斑/gDNA,二、重組DNA分子的鑒定,非轉(zhuǎn)化子,轉(zhuǎn)化子,非重組子,重組子,鑒定,（一）抗生素平板篩選-實(shí)為插入失活法,Ampr,Tetr,Kanr,Amps,Tets,Kans,單抗生素篩選,非轉(zhuǎn)化子,轉(zhuǎn)化子,陽性重組子 自身環(huán)化載體 未酶解完全載體 非目的基因插入載體,僅作為初步篩選,Ampr,Terr,插入失活的雙抗生素對(duì)照篩選法,用PstI酶切,DNA連接酶,重組質(zhì)粒,目的基因,Ampr,Tet

21、r,Pst I,目的基因與pBR322經(jīng)PstI酶切后進(jìn)行重組如何篩選得到陽性克??？,思考題,克隆3,5,7,9,10 是陽性克隆,Tet,轉(zhuǎn)化子 非轉(zhuǎn)化子 (不能生長(zhǎng)),插入失活篩選法(120),（二）X-gal篩選-藍(lán)/白篩選,見于pUC系列， pEGM系列，M13,-半乳糖苷酶基因來源-Lac操縱子,LacZ調(diào)節(jié)序列,載體中,編碼-半乳糖苷酶N-末端146個(gè)AA序列,IPTG誘導(dǎo),宿主編碼的-半乳糖苷酶缺陷型基因,+,-半乳糖苷酶,Ampr,MCS,LacZ,在Laz中插入目的基因,X-gal,藍(lán)色化合物,-半乳糖苷酶,Lac-Z基因,藍(lán)白斑篩選,陽性克隆,陰性克隆,互補(bǔ)篩選法（237）,(三）酶切電泳鑒定,瓊脂糖凝膠電泳,限制性內(nèi)切酶酶切鑒定,快速小量提取質(zhì)粒DNA,跑得慢-重組質(zhì)粒,跑得快-空載體,以本人課題為例,重組CK2 亞基轉(zhuǎn)化子的篩選 第2, 6, 8, 10, 11, 13號(hào)克隆是陽性克隆; 第1, 3, 4, 5, 7, 9, 12號(hào)是陰性克隆,重組CK2 亞基轉(zhuǎn)化子的篩選 第1,2,3,5,7,9,10,11,12,13號(hào)克隆是陽性克隆; 第4,6,8號(hào)是陰性克隆,1. DNA/EcoR I+Hind 2. recombinant plasmid /Nde I+Hind III 3. recombinant plasmid