第五章發(fā)酵動力學.ppt

1、第五章 發(fā)酵動力學,第一節(jié) 微生物反應(yīng)過程概論,一、微生物反應(yīng)過程的主要特征 1、微生物是該反應(yīng)過程的主體：是生物催化劑，又是一微小的反應(yīng)容器。 2、微生物反應(yīng)的本質(zhì)是復雜的酶催化反應(yīng)體系。酶能夠進行再生產(chǎn)。,輔酶Q10體內(nèi)轉(zhuǎn)化前體,枯草芽胞桿菌分泌胞外淀 粉酶,3、微生物反應(yīng)是非常復雜的反應(yīng)過程 （1）反應(yīng)體系中有細胞的生長，基質(zhì)消耗和產(chǎn)物的生成，有各自的最佳反應(yīng)條件。 （2）微生物反應(yīng)有多種代謝途徑。 （3）微生物反應(yīng)過程中，細胞形態(tài)、組成要經(jīng)歷生長、繁殖、維持、死亡等若干階段，不同菌齡，有不同的活性。,二、微生物反應(yīng)動力學的描述方法,細胞生長動力學 反應(yīng)基質(zhì)消耗動力學 代謝產(chǎn)物生成動力學

2、 發(fā)酵過程：包括細胞內(nèi)的生化反應(yīng)，胞內(nèi)與胞外的物質(zhì)交換，胞外物質(zhì)傳遞及反應(yīng)。,1、發(fā)酵過程特點,多相：氣相、液相和固相 多組分：培養(yǎng)基中多種營養(yǎng)成分，多種代謝產(chǎn)物，細胞內(nèi)也具有不同生理功能的大、中、小分子化合物。 非線性：細胞代謝過程用非線性方程描述。 復雜群體的生命活動,2、反應(yīng)動力學描述的簡化,動力學是對細胞群體的動力學行為的描述 不考慮細胞之間的差別，而是取性質(zhì)上的平均值，在此基礎(chǔ)上建立的模型稱為確定論模型； 如果考試每個細胞之間的差別，則建立的模型為概率論模型。 如果在考慮細胞組成變化的基礎(chǔ)上建立的模型，稱為結(jié)構(gòu)模型，一般選取RNA、DNA、糖類及蛋白含量做為過程變量。 菌體視為單組分

3、的模型為非結(jié)構(gòu)模型。 通過物料平衡建立超經(jīng)驗或半經(jīng)驗的關(guān)聯(lián)模型。,如果細胞內(nèi)的各種成分均以相同的比例增加，稱為均衡生長。 如果由于各組分的合成速率不同而使各組分增加比例不同，稱為非均衡生長。 生長模型的簡化考慮一般采用均衡生長的非結(jié)構(gòu)模型。 將細胞作為與培養(yǎng)液分離的生物相處理所建立的模型為分離化模型。在細胞濃度很高時采用。 如果把細胞和培養(yǎng)液視為一相，建立的模型為均一化模型。,非結(jié)構(gòu)模型,結(jié)構(gòu)模型,確定論模型,最理想情況 不考慮細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu) 各種細胞均一 細胞群體做為一種溶質(zhì) A,細胞之間無差異，是均一的，細胞內(nèi)有多個組分存在。 B,均衡生長,概率論模型,考慮細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu) 各種細胞不均一 C,

4、實際情況： 細胞內(nèi)多組分； 細胞之間不均一 D,不均衡生長,對細胞群體的描述模型匯總,三、研究發(fā)酵動力學的步驟、方法和內(nèi)容,1、研究發(fā)酵動力學的步驟 （1）為了獲得發(fā)酵過程變化的第一手資料，要盡可能尋找能反映過程變化的各種理化參數(shù)。 （2）將各種參數(shù)變化和現(xiàn)象與發(fā)酵代謝規(guī)律聯(lián)系起來，找出它們之間的相互關(guān)系和變化規(guī)律。 （3）建立各種數(shù)學模型以描述各參數(shù)隨時間變化的關(guān)系。 （4）通過計算機的在線控制，反復驗證各種模型的可行性與適用范圍。,2、過程控制和監(jiān)測,Fermentation time (h),3、研究發(fā)酵動力學的目的,（1）確定最佳發(fā)酵工藝條件 （2）建立發(fā)酵過程中菌體濃度、基質(zhì)濃度、溫

5、度、pH、溶氧等工藝參數(shù)的控制方案 （3）可在此研究基礎(chǔ)上進行優(yōu)選。,4、發(fā)酵動力學的研究內(nèi)容,主要包括：細胞生長和死亡動力學，基質(zhì)消耗動力學，氧消耗動力學，CO2生成動力學，產(chǎn)物合成和降解動力學，代謝熱生成動力學等。 以上各方面不是孤立的，而是既相互依賴又相互制約，構(gòu)成錯綜復雜、豐富多彩的發(fā)酵動力學體系。,四、微生物生長動力學（以分批發(fā)酵為例討論）,1、得率(或產(chǎn)率，轉(zhuǎn)化率，Y) ：是指被消耗的物質(zhì)和所合成產(chǎn)物之間的量的關(guān)系。 生長得率（或稱細胞得率）：是指每消耗1g(或mo1)基質(zhì)(一般指碳源)所產(chǎn)生的菌體重(g) 。,產(chǎn)物得率：,細胞生長速率rx：單位時間內(nèi)細胞（菌體）重量的變化； 基質(zhì)

6、消耗速率rs：單位時間內(nèi)基質(zhì)的變化(一般指碳源)的變化量。,細胞得率的單位是g細胞/g基質(zhì)。這里的細胞是指干細胞。 實際生產(chǎn)中，細胞得率是一個較重要的概念，比如，在單細胞蛋白（Single Cell Protein，SCP）生產(chǎn)中，選用相對于基質(zhì)細胞得率高的菌株是必要的。,部分菌體得率與產(chǎn)物得率,2、微生物細胞的生長速率和比生長速率,在對數(shù)生長期，培養(yǎng)基營養(yǎng)物豐富，因而在一段時間內(nèi)細胞生長不受限制，生長速率維持恒定，與營養(yǎng)物濃度無關(guān)。因此，細胞濃度的變化率與細胞濃度成正比：以下式表示這種關(guān)系,式中： X-細胞濃度，g/L; t-時間，h；-比生長速率，h-1 是細胞濃度的瞬時最大速率和細胞濃度

7、的比例常數(shù)，即單位重量菌體的瞬時增量。它與細胞種類、培養(yǎng)溫度、pH、培養(yǎng)基組成和限制性基質(zhì)濃度有關(guān)，反映了對數(shù)生長期細胞生長的快慢。,微生物細胞的生長速率：單位時間菌體的變化量,（5-1）,定義式為,比生長速率：是菌體的生長速率除以菌體濃度，在平衡條件下，比生長速率的定義為：,比生長速率除受細胞自身遺傳信息支配外，還受環(huán)境因素的影響。,上式積分：,（5-2a）,（5-2c）,（5-2b）,5-2b得出，微生物細胞生長（增量）的自然對數(shù)與時間呈直線關(guān)系，其斜率為,在單細胞微生物的對數(shù)生長期，生長速率達到最大值，群體細胞以幾何倍數(shù)增加，當細胞群體增加一倍時，所需的時間（td），稱倍增時間，用于描述

8、微生物的生長狀況。（遲滯期后）,某些微生物的世代時間,例題,例題：以乙醇為唯一碳源進行產(chǎn)氣桿菌培養(yǎng)，菌體初始濃度X0=0.1kg/m3，培養(yǎng)至3.2h，菌體濃度為8.44kg/m3，如果不考慮延遲期，比生長速率一定，求倍增時間td,lnX= t+lnX0 Ln2=td,3、生長的非結(jié)構(gòu)模型,根據(jù)T suchiya理論可分類 確定論的非結(jié)構(gòu)模型 確定論的結(jié)構(gòu)模型 概率論的非結(jié)構(gòu)模型 概率論的結(jié)構(gòu)模型 從工程角度看，理想的微生物生長模型應(yīng)具備下列條件 要明確建立模型的目的 明確地給出建立模型的假定條件 希望所含有的參數(shù)，能夠通過實驗逐個確定 模型應(yīng)盡可能地簡單,4、微生物生長模型方程,一個現(xiàn)代化學

9、者應(yīng)注意微生物群體生長的合理數(shù)學模型。 群體的生長改變了群體所處的環(huán)境，反之，群體所處的環(huán)境又促進群體的生長速率發(fā)生變化。 假設(shè)一定數(shù)量的營養(yǎng)成分(培養(yǎng)基)用來合成新群體的組成，并進一步假定群體數(shù)量的繁殖速率與菌體密度和培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分的濃度乘積呈正比。 根據(jù)這些假說，僅取決于限制性基質(zhì)的濃度S，此時，微生物生長速率隨著限制性基質(zhì)的濃度的變化而呈拋物線型變化。 目前常使用確定論的非結(jié)構(gòu)模型是Monod方程,不是所有微生物的生長都符合方程：,（1）Monod方程建立的基本假設(shè),微生物利用碳氫化合物時dX/dt是常數(shù)，絲狀真菌（霉菌、放線菌）進行頂端生長，由于物質(zhì)在細胞組織中擴散，其生長速率也不符

10、合上述方程。,1942年，Monod首先提出分批發(fā)酵中比生長速率與限制性營養(yǎng)物濃度之間的關(guān)系符合方程：,式中：S限制性營養(yǎng)物質(zhì)濃度，g/L； max 最大比生長速率；Ks底物利用常數(shù)。,例題：乙醇為唯一碳源進行面包酵母培養(yǎng)，獲得如下數(shù)據(jù)：Sg/l 0.40 0.33 0.18 0.10 0.071 0.049 0.038 0.020 0.014h-10.161 0.169 0.169 0.149 0.133 0.135 0.112 0.0909 0.0735求max 和Ks。,變形,max 和Ks的求解,微生物反應(yīng)動力學,（1）Monod方程建立的基本假設(shè),微生物生長中，生長培養(yǎng)基中只有一種物

11、質(zhì)的濃度（其它組分過量）會影響其生長速率，這種物質(zhì)被稱為限制性(生長)基質(zhì)。并且認為微生物為均衡生長且為簡單的單一反應(yīng)。 根據(jù)這些假說，僅取決于限制性基質(zhì)的濃度S，此時，微生物生長速率隨著限制性基質(zhì)的濃度的變化而呈拋物線型變化,Monod根據(jù)實驗觀察到的E coli 的比生長速率在底物濃度低時呈一級反應(yīng)動力學，在底物濃度高時呈二級反應(yīng)動力學，提出比生長速率表達式。,Monod模型既以較好地描述很多情況下的細胞生長行為，又具有模型簡單、參數(shù)少的優(yōu)勢，因而廣泛應(yīng)用。,（2）無抑制作用的細胞生長動力學Monod方程,（3）Monod方程的解析(Monod model ),溫度和pH恒定時，對于某一特

12、定培養(yǎng)基組分的濃度S，Monod方程為,式中: max稱為最大比生長速率(h-1)，Ks稱為半飽和常數(shù)(g/L)，表示（ =1/2max）時限制營養(yǎng)物濃度。,Monod方程,提高 S，可明顯提高，一級反應(yīng)。,Ks，微生物對底物的半飽和常數(shù),與親和力成反比。 當= 1/2max，S=KS 當S KS，基質(zhì)濃度很低時，,Monod方程,當X KS，基質(zhì)濃度較高時，,與S無關(guān)，零級反應(yīng)。,max是理論上最大的生長潛力，即細胞處于對數(shù)生長期，生長速度達到最大值。,Monod方程圖示,C-A區(qū)：限制性基質(zhì)濃度限制了微生物的生長，其比生長速率低于最大比生長速率max，相當于分批培養(yǎng)的減速期。 A點：限制性

13、基質(zhì)濃度到達A點時，比生長速率等于最大比生長速率，這時該基質(zhì)的濃度就不再影響微生物的生長，即不再成為限制性基質(zhì)，這個濃度成為臨界基質(zhì)濃度S crit 。 A-B區(qū)：基質(zhì)濃度過量，微生物以 max生長。,Scrit,C,A,B,對于任一營養(yǎng)物質(zhì) S Scrit，為非限制性底物 S S crit，為限制性底物,Monod方程,Monod方程中單一限制性底物可以是培養(yǎng)基中任何一種與微生物生長有關(guān)的營養(yǎng)物，只要該基質(zhì)相對貧乏，就成為限制性生長因子。實際過程中，可能出現(xiàn)多種限制性基質(zhì)和抑制性物質(zhì)，影響了Monod方程的適用性。,（4）非結(jié)構(gòu)動力學模型-邏輯方程（logisticequation）,邏輯方

14、程適用于營養(yǎng)成分復雜、生長限制性因素不清楚的情形（兩種以上），至今在生態(tài)學和間歇發(fā)酵動力學上廣泛應(yīng)用。,許多學者發(fā)現(xiàn)，有些情況下Monod方程并不完全符合微生物的生長規(guī)律，例如由于初始底物濃度過高而造成的細胞生長過快的細胞反應(yīng),不同方程所獲得的菌體濃度與時間的變化關(guān)系,五、基質(zhì)消耗動力學,1、基質(zhì)消耗速率：單位時間內(nèi)基質(zhì)的變化量。,(5-3),基質(zhì)比消耗速率 （g，或mo1)g菌體h)：系指每克菌體在一小時內(nèi)消耗營養(yǎng)物質(zhì)的量。它表示細胞對營養(yǎng)物質(zhì)利用的速率或效率。,基質(zhì)的消耗速率被菌體量除稱之為基質(zhì)的比消耗速率(specific substrate consumption rate)，即：,(

15、5-4),根據(jù)5-1式、5-3式和5-4式，有,rX=dX/dt=X,由Monod方程表示時，上式變形為,(5-6),(5-5),當以氮源、無機鹽類、維生素等為基質(zhì)時，由于這些成分只能組成菌體的構(gòu)成成分，不能成為能源，Yx/s近似一定，所以上式能夠成立。但當基質(zhì)既作為能源又是碳源時，就應(yīng)考慮維持代謝所消耗的能量。此時,(碳源總消耗速率)=(用于生長的消耗速率)+(用于維持代謝的消耗速率),兩邊間除以X,則,(5-8),(5-7),式中： m基質(zhì)維持代謝系數(shù)，mol/(gh ); -rs-碳源總消耗速率，mol/(Lh); rx-菌體生長速率， g/(Lh); YG-菌體得率系數(shù)（對細胞生長所消

16、耗的基質(zhì)而言，g/mol;,建立了細胞比生長速率與基質(zhì)的比消耗謝速率的關(guān)聯(lián)式,2、基質(zhì)消耗動力學,基質(zhì)比消耗率QS=-dS/Xdt；產(chǎn)物比生產(chǎn)率QP=dP/Xdt,如果限制性的基質(zhì)是碳源，消耗的碳源中一部分形成細胞物質(zhì)，一部分形成產(chǎn)物，一部分產(chǎn)物維持生命活動，即有：,Yp/s:產(chǎn)物得率系數(shù)，g/g;,六、代謝產(chǎn)物的生成動力學,利用微生物生產(chǎn)的代謝產(chǎn)物種類很多，并且微生物細胞內(nèi)的生物合成途徑與代謝調(diào)節(jié)機制各有特色，因此代謝產(chǎn)物的生成動力學很難用統(tǒng)一的式子表達。 代謝產(chǎn)物有分泌于培養(yǎng)液中的，也有保留在細胞內(nèi)的，因此在探討生成速率的數(shù)學模型時有必要區(qū)分這兩種情況,1、定義,代謝產(chǎn)物的生成速率（rp）

17、 ：單位時間內(nèi)代謝產(chǎn)物的合成量。 產(chǎn)物比生成速率(qp，g(或mo1)g菌體h)：系指每克菌體在一小時內(nèi)合成產(chǎn)物的量，它表示細胞合成產(chǎn)物的速度或能力，可以作為判斷微生物合成代謝產(chǎn)物的效率。,2、代謝產(chǎn)物的生成速率和比生成速率的計算方法,與生長速率和基質(zhì)消耗速率相同，當以體積為基準時，稱為代謝產(chǎn)物的生成速率，記為rp；當以單位重量為基準時，稱為產(chǎn)物的比生成速率，記為qp。相關(guān)式為,(5-11),生物反應(yīng)器設(shè)計中，常使用到rp。但是，在 的轉(zhuǎn)化過程中，當微生物作為催化劑使用時，用qp更為合理些。可以認為qp表達了細胞在 的轉(zhuǎn)化過程中的轉(zhuǎn)化活性,(5-12),發(fā)酵動力學涉及的常規(guī)參數(shù)總結(jié),第二節(jié) 微

18、生物發(fā)酵方法及其動力學類型,一、微生物發(fā)酵方法分類：微生物培養(yǎng)過程根據(jù)是否要求供氧的分類。 厭氧培養(yǎng)：不通氧的深層培養(yǎng) 好氧培養(yǎng)： 液體表面培養(yǎng) 通風固態(tài)發(fā)酵 通氧深層培養(yǎng),1、通氧深層培養(yǎng)反應(yīng)器的操作分類,（1）分批式操作（batch operation, batch fermentation） 基質(zhì)（底物）一次性加入反應(yīng)器內(nèi)，在適宜條件下接種進行反應(yīng)，反應(yīng)完成后將全部反應(yīng)物取出的操作方式。 是目前發(fā)酵制品生長采取的主要操作方式。 （2）反復分批式操作（repeated batch operation） 是指分批操作完成后取出部分反應(yīng)系，剩余部分重新加入一定量的基質(zhì)，再按照分批式操作方式反復

19、進行。,（3）半分批式操作 半分批式操作(semibatch operation)也稱流加式操作(feedbatch operation)。 是指先將一定量基質(zhì)加入反應(yīng)器內(nèi)，在適宜條件下接種使反應(yīng)開始。反應(yīng)過程中，將特定的限制性基質(zhì)按照一定要求加入到反應(yīng)器內(nèi)，以控制罐內(nèi)限制性底物濃度保持一定，當反應(yīng)終止取出反應(yīng)物料的操作方式。 酵母、淀粉酶、某些氨基酸和抗生素等常用操作方式。,(4)反復半分批式操作（repeated semibatch opertion） 是指流加操作完成后，取出部分反應(yīng)系，剩余部分重新加入一定量基質(zhì)，再按流加操作方式進行，反復進行。,（5）連續(xù)式操作（continuous）

20、 是指在分批式操作進行到一定階段，一方面將基質(zhì)連續(xù)地供給到反應(yīng)器中，另一方面又把反應(yīng)液連續(xù)不斷地取出，使反應(yīng)條件（如反應(yīng)液體積等）不隨時間變化的操作方式。 活性污泥法處理廢水、固定化微生物反應(yīng)等多采取連續(xù)式操作。,二、通氧深層發(fā)酵（培養(yǎng)）方式及其動力學,一般來說，發(fā)酵工業(yè)中微生物的生長和培養(yǎng)方式可以分為： 分批培養(yǎng) 補料分批培養(yǎng) 連續(xù)培養(yǎng),（一）分批發(fā)酵法,1、基本概念： 分批培養(yǎng)又稱分批發(fā)酵，是指在一個密閉系統(tǒng)內(nèi)投入有限數(shù)量的營養(yǎng)物質(zhì)后，接入少量的微生物菌種進行培養(yǎng)，使微生物生長繁殖，在特定的條件下只完成一個生長周期的微生物培養(yǎng)方法。,空氣,發(fā)酵尾氣,消泡劑,酸堿,2、分批發(fā)酵的特點,微生物

21、所處的環(huán)境是不斷變化的； 可進行少量多品種的發(fā)酵生產(chǎn)； 發(fā)生雜菌污染能夠很容易終止操作； 當運轉(zhuǎn)條件發(fā)生變化或需要生產(chǎn)新產(chǎn)品時，易改變處理對策； 對原料組成要求較粗放。,3、分批發(fā)酵一般工藝流程,4、細胞代謝特點及生長過程,屬于非穩(wěn)定狀態(tài)下的培養(yǎng)與發(fā)酵方法，發(fā)酵環(huán)境（包括溫度、pH、培養(yǎng)基成分、溶解氧、氧化還原電位等）隨微生物生長代謝的變化而變化；其生長速率和比生長速率也隨之變化。 細胞的生長過程分為： 遲滯期 對數(shù)生長期 穩(wěn)定期 死亡期,（1）遲滯期,概念：將少量的單細胞接種到一定體積的新鮮培養(yǎng)基中，開始階段細胞并不分裂，細胞數(shù)目不增加，這一階段稱為遲滯期。 表現(xiàn)：細胞不分裂，體積增大，代謝

22、活躍，蛋白質(zhì)、DNA、RNA含量增高，對不良環(huán)境敏感。 實質(zhì)：通過自身代謝機能調(diào)節(jié)，合成并完善內(nèi)酶系統(tǒng)，進行DNA復制，為細胞增殖生長做準備。 特點：細胞本身面臨著一系列的變化，如pH值的改變、營養(yǎng)物質(zhì)供給增加等。因而，延滯期的微生物主要是適應(yīng)新的環(huán)境，讓細胞內(nèi)部對新環(huán)境作出充分反應(yīng)和調(diào)節(jié)，從而適應(yīng)新的環(huán)境。,A、遲滯期長短對發(fā)酵結(jié)果的影響,種子培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件必須合適，只有這樣才能獲得高的產(chǎn)量。 接種后延滯期的長短關(guān)系到發(fā)酵周期的長短，而與產(chǎn)物形成速率和產(chǎn)率并無必然聯(lián)系。 實際生產(chǎn)過程中，為縮短發(fā)酵周期、提高設(shè)備利用率、提高體積生產(chǎn)率，就必須盡可能地縮短延滯期。,B、影響延滯期長短的因素及解

23、決途徑,接種材料的生理狀態(tài)：如果接種物正處于指數(shù)生長期，則延滯期可能根本就不出現(xiàn)； 培養(yǎng)基的組成和培養(yǎng)條件也可影響延滯期的長短。 接種物的濃度對延滯期長短也有一定影響，加大接種濃度可相應(yīng)縮短延滯期。 解決途徑： 一是盡量選擇處于指數(shù)生長期的種子； 二是擴大接種量。但是，如果要擴大接種量，又往往需要多級擴大制種，這不僅增加了發(fā)酵的復雜程度，又容易造成雜菌污染，故而應(yīng)從多方面考慮。,（2） 指數(shù)生長期,A、基本概念：微生物經(jīng)過遲滯期調(diào)整，進入快速生長階段，細胞數(shù)目和菌體質(zhì)量隨培養(yǎng)時間成直線上升，這一階段為對數(shù)生長期。 對細菌、酵母等單細胞微生物來講，單位時間內(nèi)其細胞數(shù)目將成倍增加。 而對于絲狀微生

24、物而言，單位時間內(nèi)其生物量將加倍。 此時，如以細胞數(shù)目或生物量的對數(shù)對時間作一對數(shù)圖，將得一直線，因而這一時期稱作指數(shù)生長期。,B、指數(shù)生長期細胞特點:,細胞保持均恒生長。 不斷吸收培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分以合成自身物質(zhì)，并不斷向培養(yǎng)基中分泌代謝產(chǎn)物。 由于此時培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分遠遠過量，且積累的代謝產(chǎn)物尚不足以抑制微生物本身的生長繁殖，因而微生物的生長速率不受這些因素的影響，而僅與微生物本身的比生長速率及發(fā)酵液中的生物量濃度X(g/L)相關(guān)。,C、發(fā)酵動力學,生長速率：在對數(shù)生長期，隨著時間的推移，培養(yǎng)基中的成分不斷發(fā)生變化，但此期間，細胞的生長速度基本維持恒定，其生長速度可用數(shù)學方程表示：,菌體

25、細胞生長速率：單位體積單位時間內(nèi)菌體細胞的生長量 rx=dx/dt：菌體細胞的比生長速率：菌體細胞的瞬時生長速率,x-細胞濃度（g/l）；t-培養(yǎng)時間（hr）； -細胞的比生長速率（1/h）；如果當t=0時，細胞的濃度為x0(g/l)，上式積分后就為：,于是，用微生物細胞濃度的自然對數(shù)對時間作圖，就可得到一條直線，該直線的斜率就等于 。,倍增時間：微生物細胞濃度增加一倍所需要的時間，也叫增代時間。(td) 表示,微生物細胞的比生長速率和倍增時間因受遺傳特性及生長條件的控制，有很大的差異，如下表：,表10-2 一些微生物在不同碳源上的比生長速度和倍增時間,對于特定的微生物而言，其比生長速率只與三

26、個因素有關(guān)。限制性營養(yǎng)物質(zhì)的濃度、最大比生長速率max、底物相關(guān)常數(shù)Ks。 假定營養(yǎng)物質(zhì)進入細胞后，立即被利用而不積累，則存在以下關(guān)系式：,如果各種營養(yǎng)物質(zhì)均大大過量的話，則= max ，這時便是指數(shù)生長期。也就是說，處于指數(shù)生長期的微生物，其生長繁殖不受營養(yǎng)物質(zhì)的限制，因而具有最大比生長速率。 如果發(fā)酵的目的是為了獲得微生物菌體的話，則應(yīng)盡量設(shè)法維持指數(shù)生長期。,D、微生物的最大比生長速率在工業(yè)上的意義,為保證工業(yè)發(fā)酵的正常周期，要盡可能地使微生物的比生長速率接近其最大值。 最大比生長速率不僅與微生物本身的性質(zhì)有關(guān)，也與所消耗的底物以及培養(yǎng)的方式有關(guān)。 限制微生物生長代謝的并不是發(fā)酵液中營養(yǎng)

27、物質(zhì)的濃度，而是營養(yǎng)物質(zhì)進入細胞的速度。,（3）穩(wěn)定期,A、概念：在細胞生長代謝過程中，培養(yǎng)基中的底物不斷被消耗，一些對微生物生長代謝有害的物質(zhì)在不斷積累。受此影響，微生物的生長速率和比生長速率就會逐漸下降，直至完全停止，這時就進入穩(wěn)定期。 處于穩(wěn)定期的生物量增加十分緩慢或基本不變；但微生物細胞的代謝還在旺盛地進行著，細胞的組成物質(zhì)還在不斷變化。 當微生物賴以生存的培養(yǎng)基中存在多種營養(yǎng)物質(zhì)時，微生物將優(yōu)先利用其易于代謝的營養(yǎng)物質(zhì)，至其耗用完時，降解利用其他營養(yǎng)物質(zhì)的酶才能誘導合成或解除抑制。,B、穩(wěn)定期特點,細胞開始老化、裂解，形成芽孢，并向培養(yǎng)基中釋放出新的碳水化合物和蛋白質(zhì)等，這些物質(zhì)可以

28、用來維持生存下來的細胞緩慢生長。 微生物的很多代謝產(chǎn)物，尤其是次級代謝產(chǎn)物，是在進入穩(wěn)定期后才大量合成和分泌的。 所有微生物停止生長或細胞增加速度與死亡速率相等 出現(xiàn)二次或隱性生長 原因：由于細胞的溶解作用，一些新的營養(yǎng)物質(zhì)，諸如細胞內(nèi)的一些糖類、蛋白質(zhì)等被釋放出來，又作為細胞的營養(yǎng)物質(zhì)，從而使存活的細胞繼續(xù)緩慢地生長，出現(xiàn)通常所稱的二次或隱性生長。或者是開始利用第二種碳源。,（4）死亡期,A、基本概念：穩(wěn)定生長期后，隨基質(zhì)嚴重缺乏，代謝產(chǎn)物更多積累，細胞的能量儲備消耗完畢及環(huán)境條件（溫度、pH、無機離子濃度）劣化，細胞生長進入衰亡期。 B、特點： 微生物細胞內(nèi)所儲存的能量已經(jīng)基本耗盡， 細胞

29、開始在自身所含的酶的作用下死亡。 細胞死亡速率大于增加速度。 細胞產(chǎn)生或釋放對人類有用的抗生素等次生代謝產(chǎn)物的時期。 C、工業(yè)意義： 在進入死亡期之前應(yīng)及時將發(fā)酵液放罐處理。,（二）分批發(fā)酵微生物生長與代謝產(chǎn)物合成的動力學關(guān)系,1、生產(chǎn)連動型產(chǎn)物形成(I型發(fā)酵)：產(chǎn)物生成直接與基質(zhì)（糖類）消耗有關(guān)。 即偶聯(lián)型：產(chǎn)物生成速率與菌體生長速率有緊密聯(lián)系。 （1）基本概念： 微生物的生長、碳水化合物的降解代謝和產(chǎn)物的形成幾乎是平行進行的，營養(yǎng)期和分化期彼此不分開。 生產(chǎn)連動型產(chǎn)物通常都直接涉及微生物的產(chǎn)能降解代謝途徑，或是正常的中間代謝產(chǎn)物。 酵母發(fā)酵生成酒精，以及葡萄糖酸和大部分氨基酸、單細胞蛋白都

30、屬于這種類型。,（2）動力學關(guān)系,分批生物工藝中各種比速率(生長速率、基質(zhì)比消耗速率qs和產(chǎn)物比生成速率qp)之間關(guān)系的圖示,生產(chǎn)連動型,qp：單位質(zhì)量細胞在單位時間內(nèi)生成產(chǎn)物的速率,生產(chǎn)連動型產(chǎn)物的生成反應(yīng)可表示如下：,產(chǎn)物形成的比速率則與微生物的比生長速率呈正比。 所以，對于這種類型的產(chǎn)物來說，調(diào)整發(fā)酵工藝參數(shù)，使微生物保持高的比生長速率，對于快速獲得產(chǎn)物、縮短發(fā)酵周期十分有利。,即：,產(chǎn)物得率：,產(chǎn)物生成速率：,因為：,有：,qp：單位質(zhì)量細胞在單位時間內(nèi)生成產(chǎn)物的速率,該式表明生長于產(chǎn)物生成相偶聯(lián)，產(chǎn)物比生成速率隨著比生長速率的增長而提高，在這種類型的發(fā)酵生產(chǎn)中，控制好最佳生長條件就可

31、獲得產(chǎn)物合成的最適條件。,2、部分生長連動型產(chǎn)物形成(II型發(fā)酵)：產(chǎn)物生成與基質(zhì)（糖類）消耗間接有關(guān)。 即：部分偶聯(lián)型，產(chǎn)物生成速率與菌體生長速率只有部分聯(lián)系。 （1）基本概念： 微生物的生長和產(chǎn)物的形成是分開進行的，糖既滿足菌體生長所需的能量，又作為產(chǎn)物合成的碳源。,其生成反應(yīng)可表示為；,分批發(fā)酵中，這種類型產(chǎn)物的形成分成兩個極限：起初，微生物消耗大量底物用于產(chǎn)能代謝和生長，而產(chǎn)物形成很緩饅，甚至根本不形成； 此后，微生物的生長速率開始減慢后，細胞開始大量消耗底物以合成產(chǎn)物。對這類產(chǎn)物來說，營養(yǎng)期和分化期在時間上是彼此分開的。 檸檬酸、衣糠酸、乳酸和部分氨基酸為這種類型產(chǎn)物的典型代表。,（

32、2）動力學關(guān)系,分批生物工藝中各種比速率：菌體比生長速率、基質(zhì)比消耗速率qs和產(chǎn)物比生成速率qp之間關(guān)系的圖示,(b)部分生長連動型,qs,細胞生長與產(chǎn)物合成部分偶聯(lián)，當比生長速率下降后，產(chǎn)物比生成速率才明顯增加，進入產(chǎn)物合成期后qp與接近同步，產(chǎn)物的合成與底物的消耗無直接的化學定量關(guān)系，這兩產(chǎn)物的合成是能量代謝的間接結(jié)果，不是底物的直接氧化產(chǎn)物。,式中：與生長相關(guān)的產(chǎn)物形成常數(shù)； 與非生長相關(guān)的產(chǎn)物形成常數(shù)。 Luedeking-Piret方程,qp,產(chǎn)物的形成只與發(fā)酵液中的菌體濃度有關(guān)，而微生物的生長速率對它無直接影響。 對于這一類型發(fā)酵，只要能保證獲得足夠高濃度的生物量，就可以獲得高速率

33、的產(chǎn)物合成。,（1）基本概念： 非生長連動型的產(chǎn)物一般不是直接或間接來自微生物的產(chǎn)能降解代謝，而是通過兩用代謝途徑合成的。 在這一類型的發(fā)酵中，起初是微生物的初級代謝和菌體生長，而沒有產(chǎn)物的合成。此時，營養(yǎng)物質(zhì)的消耗非常大。 當培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)消耗盡、微生物的生長停止以后，產(chǎn)物才開始通過中間代謝大量合成。即產(chǎn)生該類產(chǎn)物的微生物，其營養(yǎng)期和分化期在時間上是完全分開的。 非生產(chǎn)連動型的產(chǎn)物大多數(shù)是微生物的次級代謝產(chǎn)物，大多數(shù)的抗生素和生物毒素，以及維生素類。,3、非生長連動型產(chǎn)物形成(型發(fā)酵)：產(chǎn)物生成與基質(zhì)（糖類）消耗無關(guān) 即，非偶聯(lián)型：產(chǎn)物生成速率與菌體生長速率無緊密聯(lián)系。,（2）動力學關(guān)系

34、,分批生物工藝中各種比速率：菌體比生長速率、基質(zhì)比消耗速率qs和產(chǎn)物比生成速率qp之間關(guān)系的圖示,qs,特點：產(chǎn)物的合成是在菌體濃度接近或達到最高（進入穩(wěn)定期）之后才開始，產(chǎn)物合成速率與底物的消耗不存在定量關(guān)系，產(chǎn)物的合成與能量代謝無關(guān)，與細胞生長液無直接關(guān)系，只與細胞的積累量有關(guān)，這類發(fā)酵可劃分兩個階段，即菌體生長階段和產(chǎn)物合成階段。,式中： 與非生長相關(guān)的產(chǎn)物形成常數(shù)。,C、非生長連動型,例題1：以甘油為基質(zhì)進行陰溝氣桿菌分批培養(yǎng)，時間t=0時，X0=0.1g/L，S0=50g/L。反應(yīng)方程式可以Monod方程表示，max=0.85h-1，Ks=1.23x10-2g/L，Yx/s=0.53

35、g/g（以細胞/葡萄糖計），若不考慮誘導期和死亡期，求培養(yǎng)至6h的菌體濃度。,由菌體得率定義式，帶入已知數(shù)值：,(1),變形，得：S=-1.89X+50.2,(2),變形得：,(3),因為：,(4),將公式（3）帶入到（4）中，積分得：,X=16g/L,例題2：采用合成培養(yǎng)基，在1m3生物反應(yīng)器中進行大腸桿菌分批培養(yǎng)，菌體的生長變化可利用Monod方程描述，已知max=0.935h-1，Ks=0.71kg/m3，基質(zhì)初始濃度為50kg/m3，菌體初始濃度X0=0.1kg/m3，Yx/s=0.6kg/kg（以細胞/基質(zhì)計），求當80%的基質(zhì)已反應(yīng)時所需時間。,當80%的基質(zhì)已反應(yīng)時的基質(zhì)濃度為S

36、=50-(50 x80%)=10kg/m3 由于在整體反應(yīng)過程中SKs=0.71kg/m3,Monod方程,可以寫成,S0=50kg/m3，S=10kg/m3，Yx/s=0.6 X=(S0 - S )Yx/s+X0=40X0.6+0.1=24.1kg,時間從t=0至t=t時，菌體增量由0.1kg增至24kg,(1)式積分,（三）補料分批培養(yǎng)技術(shù),在傳統(tǒng)的分批培養(yǎng)發(fā)酵工藝中，所有的物料都是在發(fā)酵開始前加入反應(yīng)器中的。 一般來說，微生物生長所需要的營養(yǎng)物質(zhì)濃度并不十分高，往往在10Ks以上時就可達到最大比生長速率。在此基礎(chǔ)上，即使營養(yǎng)物質(zhì)濃度再進一步提高，比生長速率也不會再增加了。 然而，在分批發(fā)

37、酵工藝中，低濃度培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)會迅速耗盡，引起微生物過早地從指數(shù)生長期向穩(wěn)定期轉(zhuǎn)變，這樣，設(shè)備的利用率和產(chǎn)物的積累濃度都不高。,提高底物濃度可以延長微生物的指數(shù)生長期，從而提高發(fā)酵的設(shè)備利用率、容積產(chǎn)量和產(chǎn)物的積累濃度； 但過高的底物濃度往往會引起一系列的不利影響，如底物抑制、粘度升高引起的傳質(zhì)效率降低等。 尤為嚴重的是，微生物的許多次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，都受高濃度的葡萄糖、碳水化合物以及含氮化合物的降解產(chǎn)物的抑制。,高底物濃度的優(yōu)缺點,1、補料分批發(fā)酵基本概念,（1）定義：指在分批培養(yǎng)伊始，投入較低濃度的底物，在發(fā)酵過程中，當微生物開始消耗底物后，再以某種方式向培養(yǎng)系統(tǒng)中間歇或連續(xù)補加一定

38、的新鮮物料，使培養(yǎng)基中的底物濃度在較長時間內(nèi)保持在一定范圍內(nèi)，以維持微生物的生長和產(chǎn)物的形成，并避免不利因素的產(chǎn)生，從而達到提高容積產(chǎn)量、產(chǎn)物濃度和產(chǎn)物得率的目的。 （2）發(fā)酵工業(yè)應(yīng)用 單細胞蛋白、氨基酸、抗生素、維生素、酶制劑、有機酸以及的生產(chǎn)過程,（3）補料分批發(fā)酵的優(yōu)缺點,優(yōu)點 使發(fā)酵系統(tǒng)中維持很低的基質(zhì)濃度，解除底物抑制、葡萄糖效應(yīng)、代謝阻遏等問題； 和連續(xù)發(fā)酵比、不需要嚴格的無菌條件； 不會產(chǎn)生菌種老化和變異等問題 對發(fā)酵過程可實現(xiàn)優(yōu)化控制。 缺點 存在一定的非生產(chǎn)時間； 和分批發(fā)酵比，中途要流加新鮮培養(yǎng)基，增加了染菌的危險。,（4）補料控制目的,解除基質(zhì)過濃的抑制 解除產(chǎn)物的反饋抑

39、制 解除葡萄糖分解代謝阻遏效應(yīng),（5）補料的內(nèi)容,補充微生物能源和碳源的需要。 補充菌體所需要的氮源。 補充微量元素或無機鹽。,（6）補料的原則,控制微生物的中間代謝，使之向著有利于產(chǎn)物積累的方向發(fā)展。 為實現(xiàn)這一目標，在中間補料控制時，必須選擇恰當?shù)姆答伩刂茀?shù)和補料速率。,（7）分批補料培養(yǎng)特點,分批補料培養(yǎng)技術(shù)是介于分批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)之間的一種發(fā)酵技術(shù)。 由于在發(fā)酵過程中向發(fā)酵罐中補加了物料，分批補料系統(tǒng)不再是一個封閉的系統(tǒng)。 分批補料系統(tǒng)并不連續(xù)地向罐外放出發(fā)酵液，因而發(fā)酵罐內(nèi)的培養(yǎng)基體積不再是個常數(shù)，而是隨時間和物料流速而變化的變量。,2、補料分批發(fā)酵的類型,補料方式 連續(xù)流加 不連

40、續(xù)流加 多周期流加 補料成分 單一組分流加 多組分流加 控制方式 反饋控制 無反饋控制,表10-5 補料方法對細胞密度、生長速度及生產(chǎn)率的影響,流加發(fā)酵目前應(yīng)用范圍非常廣泛，幾乎遍及整個發(fā)酵行業(yè)。 補料分批發(fā)酵的理論研究在20世紀70年代以前幾乎是個空白，在早期的工業(yè)生產(chǎn)中，補料的方式非常簡單，采用的方式就僅僅局限于間歇流加和恒速流加，控制發(fā)酵也是以經(jīng)驗為主。 直到1973年日本學者Yoshida等人提出了“Fed-batch fermentation”這個術(shù)語，并從理論上建立了第一個數(shù)學模型，補料分批發(fā)酵的研究才進入理論研究階段。,3、補料控制的策略,大多數(shù)補料分批發(fā)酵均補加生長限制性基質(zhì) 以經(jīng)驗數(shù)據(jù)或預測數(shù)據(jù)控制流加； 以pH、溶氧、產(chǎn)物濃度等參數(shù)間接控制流加； 以物料平衡方程，通過傳感器在線測定的一些參數(shù)計算限制性基質(zhì)的濃度，間接控制流加； 用傳感器直接測定限制性基質(zhì)的濃度，直接控制流加。,4、補料控制參數(shù)的選擇,為了有效地進行中間補料，必須選擇恰當?shù)姆答伩?/p>