DNA的粗提取與鑒定_實驗報告.ppt

1、DNA的粗提取與鑒定,一、基礎(chǔ)知識,（一）提取DNA的方法,1、提取生物大分子的基本思路,選用一定的物理或化學(xué)方法分離具有不同物理或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子,2、提取DNA的基本思路,利用DNA與RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面的差異，提取DNA，去除其他成分,3、DNA的溶解性,DNA和蛋白質(zhì)等其他成分在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，利用這一特點，選擇適當(dāng)?shù)柠}濃度就能使DNA充分溶解，而使雜質(zhì)沉淀，或者相反,根據(jù)DNA在NaCl溶液中的溶解度曲線圖，思考在什么濃度下，DNA的溶解度最?。?DNA在NaCl溶液中的溶解度是如何變化的？,DNA在NaCl溶液中的溶解度曲線圖,在NaC

2、l溶液濃度低于0.14 mol/L時，DNA的溶解度隨NaCl溶液濃度的增加而逐漸降低；在0.14 mol/L時，DNA溶解度最小；當(dāng)NaCl溶液濃度繼續(xù)增加時，DNA的溶解度又逐漸增大。,如何通過控制NaCl溶液的濃度使DNA在鹽溶液中溶解或析出？,當(dāng)氯化鈉的物質(zhì)的量濃度為 2 molL時，DNA的溶解度最大，濃度為 014 molL時，DNA的溶解度最低。利用這一原理，可以使DNA在鹽溶液中溶解或析出。,DNA不溶于酒精溶液，但是細(xì)胞中的某些物質(zhì)則可以溶于酒精。利用這一原理，可以將DNA與蛋白質(zhì)進(jìn)一步分離,5、DNA在酒精溶液中的溶解性,6、DNA對酶、高溫和洗滌劑的耐受性,蛋白酶能水解蛋

3、白質(zhì)，但是對DNA沒有影響,大多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受6080的高溫，而DNA在80以上才會變性,洗滌劑可以溶解細(xì)胞的細(xì)胞膜，去除脂質(zhì)和蛋白質(zhì),但對DNA沒有影響,7、DNA的鑒定,DNA與二苯胺（沸水?。境伤{(lán)色，因此，二苯胺可以作為鑒定DNA的試劑,二、實驗設(shè)計,（一）實驗材料的選取,1、材料：魚卵、豬肝、菜花、香蕉、雞血、哺乳動物的紅細(xì)胞、獼猴桃、洋蔥、豌豆、菠菜、在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的大腸桿菌。（從中選取23種實驗材料）,2、原則：凡是含有DNA的生物材料都可以考慮，但選用DNA含量相對較高的生物組織，成功的可能性更大,動物細(xì)胞的破碎較易，例如，在雞血細(xì)胞液中加入一定量的蒸餾水 ，同時用玻璃

4、棒攪拌，過濾后收集濾液即可,（二）破碎細(xì)胞，獲取含DNA的濾液,1、動物細(xì)胞,答：蒸餾水對于雞血細(xì)胞來說是一種低滲液體，水分可以大量進(jìn)入血細(xì)胞內(nèi)，使血細(xì)胞脹裂，再加上攪拌的機(jī)械作用，就加速了雞血細(xì)胞的破裂(細(xì)胞膜和核膜的破裂)，從而釋放出DNA,討論：為什么加入蒸餾水能使雞血細(xì)胞破裂？,植物細(xì)胞需要先用一定的洗滌劑和食鹽溶解細(xì)胞膜,2、植物細(xì)胞,討論：加入洗滌劑和食鹽的作用分別是什么？,答：洗滌劑是一些離子去污劑，能溶解細(xì)胞膜，有利于DNA的釋放；食鹽的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解,實例：提取洋蔥DNA時，在切碎的洋蔥中加入一定的洗滌劑和食鹽，進(jìn)行從分的攪拌和研磨，過濾后收集研磨液,

5、答：研磨不充分會使細(xì)胞核內(nèi)的DNA釋放不完全，提取的DNA量變少，影響實驗結(jié)果，導(dǎo)致看不到絲狀沉淀物、用二苯胺鑒定不顯示藍(lán)色等,討論：如果研磨不充分，會對實驗結(jié)果產(chǎn)生怎樣的影響？,（三）去除濾液中的雜質(zhì),為了純化提取的DNA需要將濾液作進(jìn)一步處理,討論：此步驟獲得的濾液中可能含有哪些細(xì)胞成分？,答：可能含有核蛋白、多糖和RNA等雜質(zhì),討論：方案二與方案三的原理有什么不同？,答：方案二是利用蛋白酶分解雜質(zhì)蛋白，從而使提取的DNA與蛋白質(zhì)分開；方案三利用的是DNA和蛋白質(zhì)對高溫耐受性的不同，從而使蛋白質(zhì)變性，與DNA分離,（四） DNA的析出與鑒定,DNA的析出用的是與濾液體積相等的冷卻的酒精溶液

6、（體積分?jǐn)?shù)為95 ） ，靜置23min，溶液中會出現(xiàn)白色絲狀物，這就是粗提取DNA。用玻璃棒沿一個方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸取上面的水,1、DNA的析出,2、 DNA的鑒定,鑒定DNA時在試管中先加入物質(zhì)的量的濃度為2mol/L 的NaCl溶液5ml于兩只試管中，其中一只加入DNA絲狀物，各加入二苯胺4ml 試劑?；旌暇鶆蚝?，將試管置于沸水中加熱5min,待試管冷卻后，比較兩只試管中溶液顏色的變化，看看溶解有DNA的溶液是否有藍(lán)色,雞血細(xì)胞液中DNA的粗提取實驗流程圖,2mol/L,雞血細(xì)胞液中DNA的粗提取實驗流程圖,5、過濾取紗布上的濾物,紗布過濾,6、再次溶解DNA,2mol/LN

7、aCl溶液,取濾物,雞血細(xì)胞液中DNA的粗提取實驗流程圖,7、加冷酒精使DNA析出（純化）,冷酒精,雞血細(xì)胞液中DNA的粗提取實驗流程圖,DNA的鑒定,總結(jié)：,加入檸檬酸鈉溶液的目的是防止血凝固,加速血細(xì)胞破裂,溶解DNA,使2mol/L的NaCl溶液稀釋至0.14mol/L使得DNA最大限度地釋出,使含DNA的黏稠物被留在紗布上,使含DNA的黏稠物盡可能多的溶解于溶液中,除去含DNA的濾液中的雜質(zhì),提取DNA, A出現(xiàn)藍(lán)色 B無變化,DNA的粗提取與鑒定,一、實驗原理,1.血細(xì)胞在蒸餾水中會滲透吸水過度而導(dǎo)致細(xì)胞膜和細(xì)胞核膜的破裂。利用此特性可得到含有DNA的溶液。,2.DNA在氯化鈉溶液中

8、的溶解度，是隨著氯化鈉的濃度的變化而改變的。DNA在物質(zhì)的量濃度為0.14 molL的氯化鈉溶液中的溶解度最低，利用這一原理，可以使溶解在氯化鈉溶液中的DNA析出。,3.DNA不溶于酒精溶液，但細(xì)胞中的某些物質(zhì)則可以溶于酒精。利用這一原理，可以進(jìn)一步提取出含雜質(zhì)較少的DNA。,4.DNA遇二苯胺（沸水浴）會變成藍(lán)色，因此，二苯胺可以作為鑒定DNA的試劑。,二、方法與過程,1.制雞血細(xì)胞液（活雞鮮血經(jīng)分離或沉淀獲得）,500mL燒杯中，玻棒攪拌，離心、分離或靜置沉淀。,2.提取DNA,取血細(xì)胞5-10mL20mL蒸餾水，用玻棒沿一個方向快速攪拌。,紗布過濾：濾液中含DNA和其他核物質(zhì)，如蛋白質(zhì)。

9、,原理：血細(xì)胞的細(xì)胞膜、核摸吸水脹破，玻璃棒快速攪拌，機(jī)械加速血細(xì)胞破裂。,.提取血細(xì)胞核物質(zhì)：,.溶解核內(nèi)的DNA：,濾液2mol/L的NaCl溶液40mL，玻棒沿一個方向輕緩攪拌。,.析出含DNA的粘稠物：,.濾取含DNA的粘稠物：,. DNA粘稠物的再溶解：,在上述溶液中緩緩加入蒸餾水，并沿一個方向輕輕攪拌，出現(xiàn)絲狀物；當(dāng)絲狀物不在增加時，停止加水（此時NaCl溶液的濃度相當(dāng)于0.14mol/L）。,用多層紗布過濾，含DNA的粘稠物留在紗布上。,在20mL燒杯中輕緩攪拌3min，使盡可能多的DNA溶解在NaCl溶液。,.過濾含有DNA的NaCl溶液：,用放有兩層紗布的漏斗過濾步驟所得的溶

10、液，濾液中含有DNA。,.提取含有雜質(zhì)較少的DNA：,步驟所得的濾液體積分?jǐn)?shù)為95%的冷卻酒精50mL，用玻棒沿一個方向輕緩攪拌，溶液中（析出）出現(xiàn)乳白色絲狀物，用玻棒將絲狀物卷起，并用濾紙吸取上面的水分。,3.DNA的鑒定：,加入二苯胺試劑4mL，用玻棒攪拌使DNA溶解，沸水浴5min，觀察溶液是否出現(xiàn)藍(lán)色。,1.共有“三次過濾，兩次析出，七次攪拌”,2.加入“兩次蒸餾水，三次NaCl溶液，一次酒精”,三、實驗小結(jié),練習(xí),1、請解釋提取DNA的實驗操作中主要的步驟的目的。,答：提取DNA的第一步是材料的選取，其目的是一定要選取DNA含量較高的生物材料，否則會由于實驗過程中或多或少的損失而造成

11、檢測的困難；第二步是DNA的釋放和溶解，這一步是實驗成功與否的關(guān)鍵，要盡可能使細(xì)胞內(nèi)的DNA全部溶解；第三步是DNA的純化，即根據(jù)DNA的溶解特性、對酶及高溫的耐受性的不同等特性，最大限度地將DNA與雜質(zhì)分開；最后一步是對DNA進(jìn)行鑒定，這是對整個實驗的結(jié)果的檢測。,2、你認(rèn)為從細(xì)胞中提取某種特定的蛋白質(zhì)與提取DNA一樣容易嗎？,答：提取蛋白質(zhì)比提取DNA的難度大。這是因為，與DNA相比，蛋白質(zhì)對溫度、鹽濃度、pH等條件要敏感得多，很容易失活；并且蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)多種多樣，理化性質(zhì)各不相同，使得蛋白質(zhì)的提取沒有一種統(tǒng)一的方法，只能根據(jù)特定蛋白質(zhì)的特性摸索提取的條件，設(shè)計特定的方法。,2.實驗中NaCl的物質(zhì)的量濃度為2 molL和0.14 molL對DNA有何影響?,1.在DNA的粗提取實驗過程中，兩次向燒杯中加入蒸餾水的作用是( )。 A.稀釋血液、沖洗樣品 B.使血細(xì)胞破裂、降低NaCl濃度使DNA析出 C.使血細(xì)胞破裂、增大DN