纖維素酶活的測(cè)定

1、纖維素酶活的測(cè)定一 纖維素酶活力單位定義在37、pH值為5.50的條件下，每分鐘從濃度為4mg/ml的羧甲基纖維素鈉溶液中降解1umol還原糖所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位U。二 測(cè)定原理 纖維素酶能將羧甲基纖維素降解成寡糖和單糖。具有還原性末端的寡糖和有還原集團(tuán)的單糖在沸水浴條件下可以與DNS試劑發(fā)生顯色反應(yīng)，反應(yīng)顏色的強(qiáng)度與酶解產(chǎn)生的還原糖量成正比，而還原糖的生成量又與反應(yīng)液中的纖維素酶的活力成正比。因此，通過(guò)分光比色測(cè)定反應(yīng)液顏色的強(qiáng)度，可以計(jì)算反應(yīng)液中的纖維素酶的活力。三 試劑與溶液除特殊說(shuō)明外，所用的試劑均為分析純，水均為符合GB/T6682中規(guī)定的三級(jí)水。3.1 葡萄糖溶液，c（C6

2、H12O6）=10.0mg/ml稱取無(wú)水葡萄糖1.000g，加水溶解，定容至100ml。3.2 乙酸溶液，c(CH3COOH)=0.1mol/L吸取冰乙酸0.60ml，加水溶解，定容至100ml。3.3 乙酸鈉溶液，c（CH3COONa）=0.1 mol/L 稱取三水乙酸鈉1.36g，加水溶解，定容至100ml。3.4 氫氧化鈉溶液，c（NaOH）=200g/L稱取氫氧化鈉20.0g，加水溶解，定容至100ml。3.5 乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，c（CH3COOH-CH3COONa）稱取三水乙酸鈉11.57g，加入冰醋酸0.85ml，加水溶解，定容至1000ml，測(cè)定溶液的pH值，如果pH偏離5.

3、50，用乙酸溶液（3.2）或乙酸鈉溶液（3.3）調(diào)至5.50.3.6 羧甲基纖維素鈉溶液，0.8%（w/v）稱取羧甲基纖維素鈉（Sigma C5678）0.40g，加入到盛有30ml3.5緩沖溶液的燒杯中，磁力攪拌，同時(shí)緩慢加熱，直至羧甲基纖維素鈉完全溶解（在攪拌加熱過(guò)程中可以補(bǔ)加適量的緩沖液，但是溶液的總體積不能超過(guò)50ml），停止攪拌，用3.5緩溶將其定容至50ml，羧甲基纖維素鈉溶液能立即使用，使用前適當(dāng)搖勻。4避光保存，有效期為3天。3.7 DNS試劑稱取3，5-二硝基水楊酸（化學(xué)純）3.15g，加水500ml，攪拌5min，水浴至45，然后逐步加入100ml氫氧化鈉溶液（3.4），同

4、時(shí)不斷攪拌，知道溶液清澈透明（在加入氫氧化鈉過(guò)程中，溶液溫度不要超過(guò)48）.再逐步加入四水酒石酸鉀鈉91.0g、苯酚2.50g和無(wú)水亞硫酸鈉2.50g，繼續(xù)45水浴加熱，同時(shí)補(bǔ)加水300ml，不斷攪拌，直到加入的物質(zhì)完全溶解，停止加熱，冷卻至室溫后，用水定容至1000ml，用燒結(jié)玻璃過(guò)濾器過(guò)濾。取濾液，儲(chǔ)存在棕色試劑瓶中，避光保存，室溫下可以存放7天后可以使用，有效期為6個(gè)月。四 儀器與設(shè)備4.1 實(shí)驗(yàn)室用樣品粉碎機(jī)或碾缽。4.2分樣篩：口徑為0.25mm（60目）。4.3分析天平：精確至0.001g。4.4 pH計(jì)：精確至0.01.4.5磁力攪拌器：附加熱功能。4.6振蕩器4.7燒結(jié)玻璃過(guò)濾

5、器：孔徑為0.45nm。4.8離心機(jī)：2000r/min以上。4.9恒溫水浴鍋：溫度控制范圍在30-60之間，精度為0.1.五 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制標(biāo)準(zhǔn)空白樣：吸取3.5緩沖液4.0ml，加入DNS試劑5.0ml，震蕩后沸水浴加熱5min，然后迅速用冷水冷卻至室溫，用水定容至25.00ml，震蕩搖勻。葡萄糖：分別吸取葡萄糖溶液（3.1）1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00ml，分別用3.5緩溶定容至100ml，配制成濃度為0.10-0.70mg/ml的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取上述濃度系列的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液各2.00ml（分別做2個(gè)平行），分別加入到7個(gè)試管中，再分別加入

6、2ml蒸餾水和5mlDNS試劑，震蕩均勻后沸水浴加熱5min，然后迅速用冷水冷卻至室溫，用水定容至25.00ml，震蕩搖勻。以標(biāo)準(zhǔn)空白樣作為對(duì)照調(diào)零，在540nm處測(cè)定吸光值。以葡萄糖濃度為Y軸，吸光度OD值為X軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，每次新配制DNS試劑均需要重新繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。六 測(cè)定步驟1稀釋好的待反應(yīng)酶液和底物羧甲基纖維素鈉溶液都需要在水浴中37平衡10min反應(yīng)順序樣品、標(biāo)準(zhǔn)樣品空白1、加入待反應(yīng)酶液2ml2ml2、依次加入底物羧甲基纖維素鈉溶液2ml DNS試劑5ml3、充分混合均勻 4、依次加入 -底物羧甲基纖維素鈉溶液2ml5、充分混合均勻 - 6、37水解30min（時(shí)間要精確） 7、依次加入 DNS試劑5ml -8、充分混合均勻-9、沸水浴5min10、冷水快速降溫11、總體積定容至25ml 12、充分混合均勻反應(yīng)結(jié)束后，在室溫下靜置10min進(jìn)行比色2樣品測(cè)定在分光光度計(jì)550