AFLP分子標(biāo)記實(shí)驗(yàn)流程

1、AFLP分子標(biāo)記實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增片段長度多態(tài)性Amplified fragment length polymorphism（AFLP）是在隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性（RAPD）和限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）技術(shù)上發(fā)展起來的DNA 多態(tài)性檢測技術(shù)，具有RFLP技術(shù)高重復(fù)性和RAPD技術(shù)簡便快捷的特點(diǎn)，不需象RFLP分析一樣必須制備探針，且與RAPD標(biāo)記一樣對基因組多態(tài)性的檢測不需要知道其基因組的序列特征，同時(shí)彌補(bǔ)了RAPD技術(shù)重復(fù)性差的缺陷。同其他以PCR為基礎(chǔ)的標(biāo)記技術(shù)相比，AFLP技術(shù)能同時(shí)檢測到大量的位點(diǎn)和多態(tài)性標(biāo)記。此技術(shù)已經(jīng)成功地用于遺傳多樣性研究，種質(zhì)資源鑒定方面的研究，構(gòu)建遺傳圖譜等。其基本原理是

2、：以PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))為基礎(chǔ)，結(jié)合了RFLP（限制性片段長度多態(tài)性）的分子標(biāo)記技術(shù)。把DNA進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切，然后選擇特定的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增(在所有的限制性片段兩端加上帶有特定序列的“接頭”，用與接頭互補(bǔ)的但3-端有幾個隨機(jī)選擇的核苷酸的引物進(jìn)行特異PCR擴(kuò)增，只有那些與3-端嚴(yán)格配對的片段才能得到擴(kuò)增)，再在有高分辨力的測序膠上分開這些擴(kuò)增產(chǎn)物，用放射性法、熒光法或銀染染色法均可檢測之。一、 實(shí)驗(yàn)材料采用青稞葉片提取總DNA。二、 實(shí)驗(yàn)設(shè)備1.美國貝克曼庫爾特CEQ8000毛細(xì)管電泳系統(tǒng)， 2.美國貝克曼庫爾特臺式冷凍離心機(jī)，3.美國MJ公司PCR儀，4.安瑪西亞電泳儀等。三、

3、實(shí)驗(yàn)試劑1. 試劑：請使用高質(zhì)量產(chǎn)品，推薦日本東洋坊TOYOBO公司的相關(guān)產(chǎn)品。DNA提取試劑盒；EcoRI酶,MseI酶，T4連接酶試劑盒；Taq酶，dNTP, PCR reaction buffer；AFLP引物；瓊脂糖電泳試劑：瓊脂糖，無毒GeneFinder核酸染料替代傳統(tǒng)EB染料；超純水（18.2Mcm）2其他實(shí)驗(yàn)需要物品微量移液槍（一套）及相應(yīng)尺寸Tip頭,PCR管,冰浴等。四、 實(shí)驗(yàn)流程1、 總DNA提取使用DNA提取試劑盒提取植物基因組DNA，通過紫外分光光度計(jì)檢測或用標(biāo)準(zhǔn)品跑膠檢測。一般來說，100ng的基因組DNA作為反應(yīng)模板是足夠的。2、 EcoR1酶消化（20ul體系/

4、樣品）EcoR1 1ul (10U/ul) 10Buffer 2ul 37 2hrs 65 30min終止反應(yīng) sample(總DNA) 5ulddH2O 12ul3、 Mse1酶消化（20ul體系/樣品）Mse1 2ul（1U/ul）10Buffer 2ul sample(EcoR1酶切產(chǎn)物) 15ul 65 2hrs 80 30min終止反應(yīng)ddH2O 1ul4、 T4 DNA Ligase（20ul體系/樣品）接頭退火65度10分鐘25度2小時(shí)T4 DNA Ligase 2ul(1U/ul)10Buffer 2ulsample(雙酶切產(chǎn)物) 10ulMse1 Adaptor 1ul （不

5、稀釋) 22 3hrs 65 10min終止反應(yīng)EcoR1 Adaptor 1ul稀釋10倍ddH2O 4ul5、 預(yù)擴(kuò)增（20ul體系/樣品）sample 4ulPrimer(Mse1/EcoR1) 1ul (100uM分別稀釋14倍) AFLP Core Mix 15ul * AFLP Core Mix 配方：ddH2O 8.8ulMgCl2 1.6uldNTPs(2.5mM) 1.6ulTaq酶(1U/ul) 1ul10Buffer 2ul預(yù)擴(kuò)增程序：94 2min94 20s56 30s 20cycles72 2min60 30min6、選擇性擴(kuò)增（20ul體系/樣品）sample 4

6、ul(預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋20倍)Primer(Mse1-XXX/EcoR1-XXX) 1ul（M引物100uM稀釋14倍，E引物100um稀釋100倍） AFLP Core Mix 15ul選擇性擴(kuò)增程序：94 2min94 20s66 30s 每循環(huán)降1，共10個循環(huán)72 2min94 20s56 30s 20個循環(huán)72 2min60 30min7、產(chǎn)物電泳檢測上樣液：Loading Buffer 20ulSize standard-600 0.2ulSample 3ul(稀釋10倍)四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析本實(shí)驗(yàn)使用貝克曼庫爾特（BeckmanCoulter）公司CEQ8000遺傳分析系統(tǒng)，運(yùn)用先進(jìn)

7、的熒光標(biāo)記技術(shù)和毛細(xì)管電泳分離技術(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，擴(kuò)增產(chǎn)物在高分辨率毛細(xì)管中電泳分離，采用激光激發(fā)熒光采集數(shù)據(jù)，靈敏度極高，電泳結(jié)果通過軟件自動統(tǒng)計(jì)分析并轉(zhuǎn)換成“0、1”矩陣，便于對結(jié)果進(jìn)一步深入分析研究，整個電泳、數(shù)據(jù)采集和數(shù)據(jù)分析過程由軟件來控制完成，最大程度避免了人工操作造成的誤差，提高了數(shù)據(jù)的可靠性。產(chǎn)物電泳數(shù)據(jù)采集在CEQ8000遺傳分析系統(tǒng)上進(jìn)行（圖1），得到的數(shù)據(jù)（圖2）用第三方軟件再進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析。圖1 AFLP分子指紋圖譜圖2 AFLP“0、1”矩陣圖AFLP操作流程圖：總DNAEcoR1酶切Mse1酶切連接接頭預(yù)擴(kuò)增選擇性擴(kuò)增 優(yōu)化 電泳檢測 數(shù)據(jù)分析附錄1：常用的8對AFLP選

8、擇性擴(kuò)增引物：E-AGG: 5-GACTGCGTACCAATTCAGG-3E-ACG: 5-GACTGCGTACCAATTCACG-3E-AAC: 5-GACTGCGTACCAATTCAAC-3E-ACA: 5-GACTGCGTACCAATTCACA-3E-AGC: 5-GACTGCGTACCAATTCAGC-3E-ACT: 5-GACTGCGTACCAATTCACT-3E-AAG: 5-GACTGCGTACCAATTCAAG-3E-ACC: 5-GACTGCGTACCAATTCACC-3M-CAA: 5-GAT GAG TCC TGA GTA ACAA-3M-CAC: 5-GAT GAG T

9、CC TGA GTA ACAC-3M-CAG: 5-GAT GAG TCC TGA GTA ACAG-3M-CTA: 5-GAT GAG TCC TGA GTA ACTA-3M-CAT: 5-GAT GAG TCC TGA GTA ACAT-3M-CTC: 5-GAT GAG TCC TGA GTA ACTC-3M-CTG: 5-GAT GAG TCC TGA GTA ACTG-3M-CTT: 5-GAT GAG TCC TGA GTA ACTT-3附錄2：AFLP傳統(tǒng)垂直板電泳(銀染法檢測)介紹： 原理與方法同前，區(qū)別：1.選擇性擴(kuò)增引物不帶熒光標(biāo)記；2.電泳方法不同，采用測序膠垂直板電泳；3.電泳結(jié)果采用銀染法，比較直觀，但條帶的統(tǒng)計(jì)與分析全人工化，工作量大，銀染法靈敏度比熒光標(biāo)記法要低。示例：下圖為玉米(maize)DNA的AFLP圖譜。Panel A: AFLP fingerprints of control maize DNA using EcoR1 primer E-AGG with eight Mse1 primers: M-CAA (1), M-CAC (2), M-CAG (3), M-CAT (4), M-CTA (5), M-CTC (6), M-CTG (7), and M-CTT (8).Panel B: AFLP fingerprints of co