分子生物學(xué)檢測(cè)室技術(shù)要求與質(zhì)量控制.ppt

1、分子生物學(xué)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求與質(zhì)量控制,國(guó)家質(zhì)檢總局動(dòng)植物檢疫實(shí)驗(yàn)所 二OO四年六月,實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求,總體要求 質(zhì)量控制 質(zhì)量保證,實(shí)驗(yàn)室總體要求,實(shí)驗(yàn)室分區(qū)要求 實(shí)驗(yàn)室工作人員要求 安全防護(hù) 廢棄物處理 結(jié)果判斷與驗(yàn)證,實(shí)驗(yàn)室分區(qū)要求設(shè)施和環(huán)境要求,各工作區(qū)域設(shè)置緩沖間，緩沖間的壓力為負(fù)壓（或上設(shè)抽風(fēng)裝置），與其相連的工作間為正壓，工作間與緩沖間之間宜安裝磁性連鎖裝置。 不同功能的核酸檢驗(yàn)工作區(qū)應(yīng)是分隔獨(dú)立的工作室，并有明顯的標(biāo)志，各區(qū)間不能直通。各區(qū)之間如果是緊密相連，需安裝物品傳遞艙。 每個(gè)工作區(qū)域的頂部應(yīng)安裝紫外燈，紫外燈的波長(zhǎng)為254 nm，安裝數(shù)量為每20 m2安裝一支40W的紫外

2、燈，燈與地面的距離不宜超過（2.00.1）m。,實(shí)驗(yàn)室分區(qū)要求 工作區(qū)域的設(shè)置及要求,核酸檢驗(yàn)區(qū) 試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū); 樣品制備區(qū); 核酸制備區(qū) 擴(kuò)增區(qū); 擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū) 蛋白質(zhì)檢驗(yàn)區(qū) 蛋白質(zhì)分離純化區(qū) 蛋白質(zhì)檢測(cè)區(qū) 其它區(qū)域 設(shè)置洗滌消毒室（洗滌、消毒、制備純水和/或雙蒸水、制冰等）、高速/超高速離心機(jī)室、低溫/超低溫冰箱室等。,主要功能：原裝試劑和配制試劑的貯存，所有試劑的配制與分裝。 工作區(qū)域的壓力要求：未設(shè)緩沖間的試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)，工作區(qū)域?yàn)檎龎骸?注意事項(xiàng)：當(dāng)試劑經(jīng)質(zhì)檢合格后，應(yīng)將其分裝貯存?zhèn)溆?，貯存試劑的分裝體積根據(jù)通常在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)一次測(cè)定所需的擴(kuò)增反應(yīng)數(shù)決定。用于擴(kuò)增的試劑應(yīng)冰凍貯存

3、。,核酸檢驗(yàn)區(qū)各區(qū)功能 試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū),核酸檢驗(yàn)區(qū)各區(qū)功能 樣品制備區(qū),主要功能：實(shí)驗(yàn)室樣品的混樣和測(cè)試樣品的制備。 工作區(qū)域的壓力要求：未設(shè)緩沖間的樣品制備區(qū)，工作區(qū)域?yàn)樨?fù)壓或減壓，可安裝排風(fēng)系統(tǒng)。 注意事項(xiàng)：此區(qū)應(yīng)遠(yuǎn)離其它實(shí)驗(yàn)操作區(qū)；粉碎樣品時(shí)的器皿應(yīng)單獨(dú)使用，所用的器具在使用前應(yīng)經(jīng)過徹底清洗并高壓消毒，防止交叉污染；稱取的測(cè)試樣品應(yīng)加蓋后再移至樣品核酸制備區(qū)。,核酸檢驗(yàn)區(qū)各區(qū)功能 核酸制備區(qū),主要功能：核酸的提取純化與貯存；核酸含量的測(cè)定；測(cè)試樣品DNA的保存。 工作區(qū)域的壓力要求：未設(shè)緩沖間的核酸制備區(qū)，工作區(qū)域?yàn)樨?fù)壓或減壓，可安裝排風(fēng)系統(tǒng)。 注意事項(xiàng)：已純化的核酸應(yīng)保存于20或80

4、，避免反復(fù)凍融；陽(yáng)性和陰性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)DNA可調(diào)整至常用的使用濃度后分裝并冷凍保存。,核酸檢驗(yàn)區(qū)各區(qū)功能 擴(kuò)增區(qū),主要功能：PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的配制和模板的加入，核酸擴(kuò)增。 工作區(qū)域的壓力要求：未設(shè)緩沖間的擴(kuò)增區(qū)，工作區(qū)域?yàn)樨?fù)壓或減壓，可安裝排風(fēng)系統(tǒng)。 注意事項(xiàng)：嚴(yán)格限制無關(guān)人員出入并減少在本區(qū)內(nèi)走動(dòng)；加樣應(yīng)在超凈工作臺(tái)（生物安全柜）內(nèi)進(jìn)行，超凈工作臺(tái)的氣流方向宜選擇垂流式；巢式PCR的第二次加樣必須在此區(qū)進(jìn)行。,核酸檢驗(yàn)區(qū)各區(qū)功能 擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū),主要功能：擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)定 工作區(qū)域的壓力要求：未設(shè)緩沖間的擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)，工作區(qū)域?yàn)樨?fù)壓或減壓，應(yīng)安裝排風(fēng)系統(tǒng)。 注意事項(xiàng)：此區(qū)是最主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來源

5、，應(yīng)遠(yuǎn)離其它實(shí)驗(yàn)操作區(qū)；使用PCR-ELISA方法檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，應(yīng)使用洗板機(jī)洗板。 若實(shí)驗(yàn)僅采用全自動(dòng)擴(kuò)增檢測(cè)儀（如實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀），可將擴(kuò)增區(qū)與擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)合并為一個(gè)區(qū)。,蛋白質(zhì)檢驗(yàn)區(qū) 功能及要求,蛋白質(zhì)分離純化區(qū) 主要功能：用于蛋白質(zhì)的分離與純化。 工作區(qū)域要求：蛋白質(zhì)純化應(yīng)具備低溫工作的場(chǎng)地，如4冷房和/或?qū)游龉竦取?蛋白質(zhì)分離純化區(qū) 主要功能：蛋白質(zhì)分析檢測(cè),檢測(cè)工作流程,實(shí)驗(yàn)室樣品到樣驗(yàn)收（確定是否具備檢驗(yàn)的基本條件）混樣獲取測(cè)試樣品測(cè)試樣品的制備（待檢狀態(tài)） 核酸和/或蛋白等目標(biāo)物質(zhì)的提取 PCR實(shí)驗(yàn)（包括擴(kuò)增和產(chǎn)物分析）和/或蛋白質(zhì)檢測(cè)結(jié)果判定結(jié)果表述（出具檢驗(yàn)報(bào)告）,

6、實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制和質(zhì)量保證 工作人員操作要求,按照ISO/IEC 17025：1999中5.2的要求。 應(yīng)具備良好的分子生物學(xué)專業(yè)技術(shù)操作規(guī)范。 方向：試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)樣本制備區(qū)核酸制備區(qū)擴(kuò)增區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū),各實(shí)驗(yàn)區(qū)域應(yīng)有專用的儀器設(shè)備，同一區(qū)域內(nèi)的儀器設(shè)備、物品和工作服應(yīng)有明顯標(biāo)記，避免與其他區(qū)域的儀器設(shè)備混用。 儀器設(shè)備的校準(zhǔn)應(yīng)符合ISO/IEC 17025：1999中5.5的規(guī)定。,實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制和質(zhì)量保證 儀器設(shè)備要求,實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制和質(zhì)量保證 試劑要求,除另有規(guī)定外，所有實(shí)驗(yàn)使用的試劑等級(jí)應(yīng)為不含DNA和DNase的分析純或生化試劑。試劑的選購(gòu)、驗(yàn)收、貯存應(yīng)符合ISO/IEC 170

7、25：1999規(guī)定。 實(shí)驗(yàn)用水應(yīng)符合GB 6682-92中一級(jí)水的規(guī)格。去離子水的電阻應(yīng)達(dá)到18.2。 商品試劑盒應(yīng)注明到貨日期，對(duì)所收到的試劑盒應(yīng)按規(guī)定的貯存條件存放。 對(duì)菌種、質(zhì)粒、動(dòng)植物細(xì)胞組織的貯存與保管應(yīng)符合ASTM E 1342-97的規(guī)定。,實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制和質(zhì)量保證 試劑配制,實(shí)驗(yàn)室配制的試劑應(yīng)在容器上標(biāo)明試劑名稱、濃度、配制時(shí)間、保存條件、失效日期及配制者姓名。 所用試劑溶液宜大體積配制、小體積分裝后高壓滅菌保存，不宜高壓滅菌的試劑應(yīng)過濾（0.22 m）除菌；PCR主混液、引物、探針應(yīng)避免反復(fù)凍融。,實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制和質(zhì)量保證 試劑配制,實(shí)驗(yàn)室應(yīng)確定關(guān)鍵試劑，并在使用前進(jìn)行質(zhì)量檢

8、測(cè)。關(guān)鍵試劑包括：核酸提取試劑、RNase、蛋白酶K、陰性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、Taq酶、各種限制性內(nèi)切酶、引物、探針、菌種、陽(yáng)性質(zhì)粒。 試劑質(zhì)檢包括有無污染，是否存在假陽(yáng)性；使用弱陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)檢測(cè)試劑的擴(kuò)增效果。,實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制和質(zhì)量保證 防止污染, 嚴(yán)格實(shí)驗(yàn)室分區(qū) 對(duì)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行功能分區(qū)，各區(qū)的工作服、實(shí)驗(yàn)用具和實(shí)驗(yàn)記錄本應(yīng)區(qū)分標(biāo)記，不能混用。 樣品管理 送檢樣品的包裝應(yīng)完好并有明確的標(biāo)識(shí)；在對(duì)實(shí)驗(yàn)室樣品進(jìn)行混樣、測(cè)試樣品的制備和稱量過程中應(yīng)避免交叉污染。 實(shí)驗(yàn)過程的質(zhì)量控制,實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制和質(zhì)量保證 實(shí)驗(yàn)過程的質(zhì)量控制, 實(shí)驗(yàn)室環(huán)境對(duì)照 陰性質(zhì)控對(duì)照 核酸提取空白對(duì)照：核酸提

9、取過程中不加樣品的空白管； PCR試劑對(duì)照：不含DNA/cDNA模板的PCR擴(kuò)增反應(yīng)液試劑； 陰性目標(biāo)DNA對(duì)照：即為內(nèi)源基因?qū)φ?，與測(cè)試樣品等同處理。 陽(yáng)性質(zhì)控對(duì)照 檢驗(yàn)PCR反應(yīng)是否正常進(jìn)行 PCR抑制物對(duì)照 檢測(cè)PCR反應(yīng)體系中是否存在水溶性抑制物質(zhì)。當(dāng)PCR反應(yīng)無擴(kuò)增結(jié)果和定量PCR時(shí)宜設(shè)此對(duì)照。,實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制和質(zhì)量保證 避免各類實(shí)驗(yàn)污染, 避免擴(kuò)增產(chǎn)物污染 PCR擴(kuò)增反應(yīng)液中加入U(xiǎn)DG酶，以dUTP代替dTTP可防止以前PCR擴(kuò)增產(chǎn)物所致的遺留污染。 避免RNase污染（RNA檢測(cè)） 戴口罩和手套; DEPC; 高溫烘烤; RNase抑制劑 避免操作過程污染 實(shí)時(shí)熒光PCR和總核酸

10、雜交法可防止操作過程的污染，實(shí)時(shí)熒光PCR尤其轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室重要的防污染措施之一。,陽(yáng)性樣品,陰性樣品,Ct 值,轉(zhuǎn)基因馬鈴薯和油菜籽的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè),實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制和質(zhì)量保證 室間質(zhì)量評(píng)價(jià)測(cè)試,凡對(duì)外開展基因檢測(cè)并出具檢測(cè)報(bào)告的實(shí)驗(yàn)室，應(yīng)定期參加國(guó)家有關(guān)法定部門組織的檢驗(yàn)項(xiàng)目的室間質(zhì)量評(píng)價(jià)測(cè)試。,實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制和質(zhì)量保證 實(shí)驗(yàn)室清潔, 清潔方向 應(yīng)按檢測(cè)工作流程方向進(jìn)行： 試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)樣品粉碎區(qū)核酸制備區(qū)擴(kuò)增區(qū)產(chǎn)物分析區(qū) 清潔用具 不同實(shí)驗(yàn)區(qū)域的清潔用具應(yīng)固定，不能交叉使用。工作結(jié)束后應(yīng)立即對(duì)工作區(qū)域進(jìn)行清潔。,實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制和質(zhì)量保證 實(shí)驗(yàn)室清潔, 實(shí)驗(yàn)室空間 實(shí)驗(yàn)室空間應(yīng)定

11、期進(jìn)行紫外照射。 實(shí)驗(yàn)臺(tái)面和儀器設(shè)備的清潔 實(shí)驗(yàn)臺(tái)面、超凈工作臺(tái)宜用3%雙氧水或10%次氯酸鈉溶液（含有效氯1 g/L）擦拭清潔；也可在擦拭后再用紫外光照射，照射距離應(yīng)不超過90 cm，照射時(shí)間宜過夜。 注：10%次氯酸鈉和3%雙氧水應(yīng)在使用前配制，配制好的溶液不宜長(zhǎng)期存放。,實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制和質(zhì)量保證 有毒有害及廢棄物質(zhì)的處理, 移液器吸頭 使用過的移液器吸頭應(yīng)放入含有10%次氯酸鈉溶液的容器內(nèi)浸泡，浸泡時(shí)間不宜少于24 h。 PCR產(chǎn)物 含有PCR產(chǎn)物的所有液體及廢棄物應(yīng)放入含有1 mol/L HCl的容器中浸泡，浸泡時(shí)間不宜少于6 h；采用PCR-ELISA方法檢測(cè)時(shí)洗板機(jī)洗板所產(chǎn)生的廢液應(yīng)收集至1 mol/L HCl溶液中。 瓊脂糖凝膠及電泳液 對(duì)含有EB或經(jīng)EB浸泡過的瓊脂糖凝膠、電泳緩沖液的處理參見分子克隆。 陽(yáng)性樣品和質(zhì)粒 陽(yáng)性質(zhì)粒宜放入1 mol/L HCl溶液中浸泡，浸泡時(shí)間不宜少于6 h。,實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制和質(zhì)量保證 安全防護(hù),紫外線 應(yīng)佩戴具有紫外線防護(hù)功能的護(hù)目鏡和/或防護(hù)面罩，并遮蔽暴露的皮膚。紫外照射消毒后由于空氣中臭氧富集，不宜立即開始工作，應(yīng)在停止紫外照射30 min后開始工作，有條件的實(shí)驗(yàn)室，可安裝無臭氧紫外燈。 溴化乙錠 在接觸溴化乙錠