地中海貧血的診斷方法

1、地中海貧血的診斷方法B- 地中海貧血的篩查和診斷主要依賴實(shí)驗(yàn)室檢查，方法主要有：1 血常規(guī)檢測(cè)地中海貧血的重要特征之一是小細(xì)胞低色素性貧血，如MCV80 fl，MCH250 Pg，則可疑為地中海貧血患者或基因攜帶者，可同時(shí)測(cè)定血清鐵和鐵蛋白，以排除缺鐵性貧血。2 紅細(xì)胞滲透脆性試驗(yàn) ( 一管法 )其原理是地中海貧血紅細(xì)胞膜表面粗糙、凹陷、折疊和漿膜擴(kuò)展，膜與內(nèi)容物之比增大，對(duì)滲透溶解的抗性增加，在032( 或036)NaC1中溶解度降低 ( 脆性降低 ) 。一管法可用于地中海貧血群體篩查。3 血紅蛋白 (Hb) 電泳 Hb電泳是檢測(cè)地中海貧血、 異常血紅蛋白最常用的方法， 可觀察到 HbE、H

2、bH等異常血紅蛋白區(qū)帶， 同時(shí)可定量檢測(cè) HbF、HbA2的含量并區(qū)分常見類型的地中海貧血。有研究顯示MCV、Hb電泳和紅細(xì)胞脆性實(shí)驗(yàn)三者聯(lián)合檢測(cè)的靈敏度可達(dá)100 ，陰性預(yù)告值達(dá) 100 ，聯(lián)合特異度可達(dá) 100 ，陽性預(yù)告值達(dá) 100DS。4 高效液相色譜技術(shù) (HPLC)原理：采用微柱法離子交換層析和梯度洗脫技術(shù)，全自動(dòng)分析儀可分離血紅蛋白的變異體與亞型，容易發(fā)現(xiàn)重型和輕型B地中海貧血。在操作上， HPLC采用的是全血標(biāo)本，不需要制備Hb液，只要將全血標(biāo)本直接放在儀器上，通過電腦操作便能實(shí)現(xiàn)HbA、HbA2、HbF等定量檢測(cè)。優(yōu)點(diǎn)：所需樣本量少，自動(dòng)化程度高，操作簡(jiǎn)單，快速，能消除人為誤

3、差，結(jié)果準(zhǔn)確。 HPLC也可用于胎兒臍帶血的產(chǎn)前診斷，可診斷出重型 B地中海貧血， 但不能區(qū)分正常胎兒和雜合子胎兒 。近年來，地中海貧血高發(fā)地區(qū)也采用此法進(jìn)行攜帶者檢測(cè)。5 基因診斷近年來，隨著分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的不斷發(fā)展， 從最初的 B珠蛋白基因簇限制性酶切多態(tài)性檢測(cè)至目前的聚合酶鏈反應(yīng) (PCR)技術(shù)結(jié)合其他分子生物學(xué)方法， B地中海貧血的診斷已逐步改進(jìn)和完善?；蛟\斷方法有下列幾種：51 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性連鎖分析(RFLP連鎖分析 )原理：DNA限制性內(nèi)切酶可識(shí)別并切割 DNA上特定的核苷酸序列， 得到一定長(zhǎng)度的 DNA片段，而堿基的突變可導(dǎo)致酶切位點(diǎn)的丟失或形成，從而改變酶切片段的

4、大小。 突變基因在經(jīng)過相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶水解后，其電泳條帶的數(shù)量和大小就會(huì)發(fā)生改變， 根據(jù)這些改變可判斷出突變是否存在。缺點(diǎn)：由于單獨(dú)使用該方法，不能直接測(cè)出受試者突變基因的類型， 必須結(jié)合寡核苷酸探針等技術(shù)， 故其應(yīng)用范圍有一定限制，且操作繁瑣。 如果母親或父親在所有的多態(tài)性位點(diǎn)上都為純合子，無法用此方法進(jìn)行產(chǎn)前診斷， 或者患兒和父母所有位點(diǎn)上都是雜合狀態(tài)，只能進(jìn)行 50 的排除性診斷。52 探針斑點(diǎn)雜交技術(shù) ( allelespecific oligonucleotideASO) 應(yīng)用引物擴(kuò)增珠蛋白基因， 同時(shí)合成與正常序列和突變序列完全互補(bǔ)的寡核苷酸探針。將 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物點(diǎn)在尼龍膜上，

5、分別與標(biāo)記的正常和突變的 ASO探針雜交，不完全互補(bǔ)的探針，在一定條件下可以完全洗脫，再從放射自顯影觀察雜交結(jié)果。如果兩個(gè)等位B珠蛋白基因正常，僅與正常探針雜交，反之，均帶有突變時(shí)，則僅與突變探針雜交。這種檢測(cè)方法快速、靈敏。缺點(diǎn)：對(duì)DNA的純度和數(shù)量要求較高，一次雜交能檢測(cè)一種突變，對(duì)于具有高度異質(zhì)性的B地中海貧血往往需要多次更換探針雜交，才能確定診斷， 如使用同位素標(biāo)記探針，還存在放射性污染等問題。53 反向點(diǎn)雜交方法 (Reverse dot blothybridization，RDB)與傳統(tǒng)等位基因特異性寡核苷酸探針點(diǎn)雜交的基本原理相同，所不同的是：將膜上固定探針取代固定靶DNA，經(jīng)一

6、次雜交就可對(duì)未知樣品中多個(gè)突變進(jìn)行檢測(cè)， 改變了傳統(tǒng)雜交法一次只能檢測(cè)一種突變的方式。優(yōu)點(diǎn)：較快速、敏感，操作簡(jiǎn)單。缺點(diǎn)：只能檢測(cè)已知位點(diǎn)突變的B地中海貧血，不能檢出未知突變。54 缺口 PCR(gap PCR)原理：設(shè)計(jì)三個(gè)或兩對(duì)引物，即在缺失區(qū)域外側(cè)， 靠近缺失位點(diǎn)的位置設(shè)計(jì)一對(duì)引物，另外一個(gè)或一對(duì)引物在缺失區(qū)域內(nèi)。 在缺失區(qū)域內(nèi)的引物能夠在雜合子和正常人中擴(kuò)增出片段，在缺失純合子中不能擴(kuò)增。在缺失區(qū)域外側(cè)的一對(duì)引物，因?yàn)槿笔瓜嗑嗌踹h(yuǎn)的兩端DNA拉進(jìn)，從而可擴(kuò)增出特定的DNA片斷。從而檢測(cè)出純合子患者，雜合子攜帶者。Wang等 報(bào)道用此方法對(duì) 89個(gè)B珠蛋白基因突變的檢測(cè)。55 擴(kuò)增不應(yīng)

7、突變系統(tǒng) (amplification refractorymutationsys tems，ARMS)或稱等位基因特異性 PCR原理：在PCR中，針對(duì)某個(gè)點(diǎn)突變?cè)O(shè)計(jì)出 3端堿基與目的基因的突變堿基互補(bǔ)的引物，PCR反應(yīng)中，只有突變的基因才有相應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物，而正常的基因則不能擴(kuò)增 。從而將正常與突變的 DNA區(qū)別開來。優(yōu)點(diǎn)：僅需微量的DNA樣品 (100 400 ng) ，通過簡(jiǎn)單的設(shè)計(jì)，僅需同一種 PCR循環(huán)體系便可同時(shí)探測(cè)常見 B珠蛋白基因突變， 無需 PCR之后的分子雜交等過程， 不需限制性內(nèi)切酶及放射性核素。缺點(diǎn)：特異性較低，易出現(xiàn)假陽性或假陰性。有報(bào)道應(yīng)用該方法進(jìn)行 B地中海貧血的檢

8、測(cè) 。56 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(real time PCR)在實(shí)驗(yàn)過程的 PCR體系中加入熒光集團(tuán)， 由于被測(cè)產(chǎn)物的數(shù)量與起始模板拷貝數(shù)直接相關(guān)，具體可以通過特定的定量PCR儀監(jiān)測(cè)每次循環(huán)產(chǎn)生的熒光信號(hào)強(qiáng)度，并參照對(duì)照基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線來定量，熒光染料能與所有的DNA相結(jié)合，不必因?yàn)槟０宀煌貏e定制。缺點(diǎn)：由于選取的相對(duì)定量和標(biāo)準(zhǔn)曲線本身存在局限性，所得結(jié)果存在誤差。國(guó)內(nèi)外有報(bào)道采用該方法進(jìn)行 B地中海貧血的檢測(cè)?。57 單鏈構(gòu)向多態(tài)性 PCR(PCRSSCP) 與PCR聯(lián)合應(yīng)用，即PCRSSCP是一種基于單鏈 DNA構(gòu)象差別來檢測(cè)未知點(diǎn)突變的常用方法。原理： PCR產(chǎn)物在加熱或變性劑下生成單

9、鏈，單個(gè)核苷酸的改變即可造成 DNA片斷單鏈的改變。根據(jù)構(gòu)象不同的單鏈 DNA在非變性聚丙烯酰胺凝膠 (PAGE)條件下電泳表現(xiàn)不同的遷移率， 電泳帶用銀染法顯示，無放射性核素污染?？捎糜跈z測(cè)B地中海貧血基因缺失的病人及攜帶者，是一種篩查未知點(diǎn)突變的有效方法。缺點(diǎn)：當(dāng) PCR產(chǎn)物小于200 bp 可檢出 70 90的突變率，敏感度隨PCR的長(zhǎng)度58 等位基因特異性擴(kuò)增技術(shù)(AlleleSpecificPCR，ASPCR)原理：針對(duì) B地中海貧血的突變類型設(shè)計(jì)特異堿基引物，根據(jù)擴(kuò)增得到的電泳帶判斷是否存在對(duì)應(yīng)的點(diǎn)突變，結(jié)果清晰、準(zhǔn)確可靠，尤適用于小片段 DNA分析，可作為快速檢測(cè)攜帶者的篩查手段

10、。59 DNA芯片技術(shù) (DNA chip)以反向斑點(diǎn)雜交為基本原理。將預(yù)先設(shè)計(jì)好的大量核酸探針有序、 高密度地顯微打印在玻璃片、 硅片等固體支持物上，制成 DNA微陣列。用熒光標(biāo)記的待測(cè)樣品 DNA、eDNA或 RNA與位于芯片上的核酸探針雜交后，通過激光共聚焦熒光掃描系統(tǒng)檢測(cè)雜交信號(hào)強(qiáng)度， 用特制的軟件對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行分析處理， 便可得到待測(cè)樣品的遺傳信息或表達(dá)信息。優(yōu)點(diǎn)：高通量，基因診斷可在一張芯片上完成， 適用于大面積的篩查。 缺點(diǎn)：設(shè)備要求及費(fèi)用較高，目前難以推廣。510 DNA序列測(cè)定法 (DNA sequencing)常用于分析基因的未知或已知突變。 應(yīng)用 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在 DNA自動(dòng)測(cè)序儀上進(jìn)行序列分析。該法快速、簡(jiǎn)便、靈敏，重復(fù)性好，是基因突變檢測(cè)的最直接、最準(zhǔn)確的方法。511 熒光聚合酶鏈反應(yīng) (Fluorescent PCR) 熒光 PCR是近年發(fā)展起來的新興技術(shù)， 它比普通的 PCR敏感性高出一千倍以上 。用不同