酵母中RNA的提取與含量測(cè)定

1、 酵母中RNA的提取與含量測(cè)定 14級(jí)拔尖 趙子杰 1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1.掌握稀堿法提取酵母RNA的原理和方法。 2.掌握用苔黑酚法測(cè)定RNA含量的原理和方法。2 實(shí)驗(yàn)原理 1.RNA的提取核酸（RNA）都是由核苷酸組成的多聚核苷酸化合物，而核苷酸是由糖、堿基和磷酸以等分子比例構(gòu)成的，故測(cè)定組成核苷酸的任意一種組分即可以測(cè)定生物體內(nèi)核酸的含量或者是提取出來(lái)的核酸的含量。提取RNA的方法很多，在工業(yè)生產(chǎn)上常用的是稀堿法和濃鹽法。前者是利用堿使細(xì)菌細(xì)胞壁溶解，是RNA釋放出來(lái)，后者是在加熱的條件下，利用高濃度的鹽改變細(xì)胞膜的通透性，使RNA釋放出來(lái)。使用濃鹽法提取RNA的時(shí)候應(yīng)該注意掌握溫度，直接至9

2、0100浸提，避免在2070的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，因?yàn)檫@是磷酸二酯酶和磷酸單酯酶的作用活躍的溫度范圍，會(huì)使RNA降解而降低提取率。這兩種方法是從廢棄的啤酒酵母中提取RNA的一般方法。但是這兩種方法各有利弊，如濃鹽法提取的RNA純度高，而稀堿法提取的時(shí)間短，提取率高，更利于工業(yè)化生產(chǎn)。本實(shí)驗(yàn)采取濃鹽法。酵母核酸中RNA的含量較多，DNA則少于2%。RNA可溶于堿性溶液，當(dāng)堿液被中和后，可加乙醇使其沉淀，由此即可得到粗RNA粗品。 2.RNA的鑒定 目前測(cè)定核酸含量的方法主要有以下四種：定磷法（RNA/DNA）、戊糖測(cè)定法(RNA)、脫氧戊糖測(cè)定法（DNA）和紫外吸收法（DNA/RNA）。定磷比色法是有準(zhǔn)確

3、，微量，快速的特點(diǎn)，是測(cè)定核酸含量的最好方法，戊糖測(cè)定法和脫氧戊糖測(cè)定法是通過(guò)糖的顏色反應(yīng)來(lái)測(cè)定RNA和DNA的，方法簡(jiǎn)單，快速，但是當(dāng)樣品中含有粘多糖和蛋白質(zhì)存在的時(shí)候?qū)y(cè)定會(huì)有干擾。在酸性條件下，RNA分子中的核算基轉(zhuǎn)變?yōu)?呋喃甲醛，后者與苔黑酚（3,5-二羥甲苯）作用生成綠色復(fù)合物，可用比色法鑒定。3 實(shí)驗(yàn)器材 RNA的提取： RNA的含量測(cè)定： 1.干酵母粉（市售）。 1.試管1.5cmX1.5cm(X7)。 2.PH試紙。 2.吸管5ml。 3.離心機(jī)4000r/min。 3.水浴鍋。 4.抽濾裝置。 4.722型（或720型）分光光度計(jì)。 5.電子天平。 5.移液槍。 6.量筒。

4、7.吸管(5ml)。4 實(shí)驗(yàn)試劑 1.0.2%NaOH溶液。 2.乙酸A.R.。 3.95%乙醇。 4.無(wú)水乙醚A.R.。 5.標(biāo)準(zhǔn)RNA溶液：準(zhǔn)確稱取RNA標(biāo)準(zhǔn)品10mg，用少量蒸餾水溶解，定容至100ml。 6.樣品溶液：同樣取10mg左右的樣品，定容于100ml，搖勻。 7.苔黑酚-三氯化鐵試劑。五實(shí)驗(yàn)步驟 1.RNA的提取 稱取8g酵母粉于100ml燒杯中，加入0.2%NaOH溶液40ml，沸水浴加熱30min，經(jīng)常攪拌。 冷卻，加入乙酸數(shù)滴，使提取液呈酸性（PH56）。離心10min,4000r/min。取上清液，加入兩倍體積的95%的乙醇，邊加邊攪。 加畢，靜置，待完全沉淀，過(guò)濾。

5、濾渣先用95%的乙醇洗兩次，每次約10ml，繼而用無(wú)水乙醚洗兩次，每次10ml。洗滌時(shí)可用玻棒小心攪動(dòng)沉淀。乙醚濾干后，濾渣即為粗RNA，可用作接下來(lái)的測(cè)定含量用。 2.RNA的含量測(cè)定 1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取干凈試管6支，編號(hào)。按下表進(jìn)行操作。 管號(hào)試劑0123456RNA標(biāo)準(zhǔn)溶液/ml0.00.40.81.21.62.0樣品溶液（0.5mg/ml)2.0蒸餾水2.01.61.20.80.40.00.0苔黑酚試劑2.02.02.02.02.02.02.0RNA含量/mg0.00000.04120.08240.12360.16480.2060水浴45minA670nm/A0.0000.0780.

6、1830.2680.3560.4560.212 2）樣液測(cè)定 加畢，混勻，加熱45min。冷卻，測(cè)定各管670nm的吸光度，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線求得未知RNA的含量。六實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象與結(jié)論 1.RNA的提取實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象：加入NaOH進(jìn)行攪拌后呈棕黃色粘稠物。離心后明顯分層，沉淀為棕黃色，上層溶液呈黃色粘稠狀，似蛋清。向上清液加入乙醇后呈淡黃色渾濁，靜置后沉淀為白色，上清液為黃色。過(guò)濾洗滌后呈白色粉末狀沉淀。稱取酵母粉：8.01gRNA粗品：0.4234g 2.RNA的含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象：加熱后從0號(hào)至5號(hào)溶液由黃色至黃綠色依次加深，6號(hào)溶液顏色為淡黃綠色。稱量RNA樣品：0.0101g稱量標(biāo)準(zhǔn)RNA：0.0103

7、g按要求繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如下： 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)線線性回歸的結(jié)果為y=2.2184x-0.005，其中R2=0.9989，接近于1，表明線性回歸效果很好。 根據(jù)結(jié)果測(cè)得y=0.212，代入原方程得：x=0.0980mg，即該試管中RNA的含量為0.0980mg。 可知其純度為： 7 實(shí)驗(yàn)總結(jié)1. 過(guò)濾時(shí),洗滌不能帶水,否則沉淀粘在濾紙上取不下來(lái)。2.有時(shí)絮狀沉淀出現(xiàn)較慢,可放十多分鐘。3.利用等電點(diǎn)控制RNA析出時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格控pH。4.稀堿法提取的RNA為變性RNA，可用于RNA組分鑒定及單核苷酸制備，不能作為RNA生物活性實(shí)驗(yàn)材料。5.有很多操作細(xì)節(jié)需要相當(dāng)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)耐瓿桑热缢r(shí)間，離心時(shí)間，沉淀取上清液

8、等，只有小心翼翼充分細(xì)心的做好這些細(xì)節(jié)工作，產(chǎn)率會(huì)有一定的提高八思考題 1.本實(shí)驗(yàn)為何選用酵母為生產(chǎn)原料？在分離純化的實(shí)驗(yàn)選材上有哪些主要原則？ 答：因?yàn)榻湍讣?xì)胞中核酸的含量非常高，且主要是RNA，其含量可達(dá)2.67%10.0%。而DNA的含量較少，在測(cè)定RNA的含量時(shí)DNA對(duì)測(cè)定的影響非常小，故選取酵母為生產(chǎn)原料。在分離純化的實(shí)驗(yàn)選材上應(yīng)該注意以下幾點(diǎn)：待分離物質(zhì)再材料中的含量要高；提取方法要簡(jiǎn)便；雜質(zhì)要少，保證提取后提取物的純度。如果是用于規(guī)?；a(chǎn)的話，必不可少的一個(gè)就是要考慮材料的價(jià)格。 2.大量的乙醇洗滌在工業(yè)生產(chǎn)上有否危險(xiǎn)隱患？廠家是如何考慮的。 答：廢舊的乙醇可以凈化以后回收再利用。乙醇是易揮發(fā)物質(zhì)和燃品，有很大的安全隱患。乙醇洗滌有很多的好處，可以脫去色素，脂溶性雜質(zhì)，還可以使RNA分子脫水，易于烘干。由于RNA分子在乙醇溶液中水化層被破壞，磷酸基團(tuán)暴露出來(lái)，并與Na結(jié)合，最終使RNA沉淀，增加產(chǎn)率。因此乙醇洗滌時(shí)必須的。 2.RNA提取過(guò)程中的關(guān)鍵步驟及注意事項(xiàng)有哪些？ 答：過(guò)濾時(shí)，洗滌不能帶水，否則沉淀粘在濾紙上取不下來(lái)；有時(shí)絮狀沉淀出現(xiàn)較慢，可放十多分鐘；利用等電點(diǎn)控制RNA析出時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格控制p