噸螺旋霉素發(fā)酵生產(chǎn)工藝設(shè)計(jì)

1、目錄目錄 引言.- 2 - 1 菌種的選育.- 3 - 1.1 材料與方法.- 4 - 1.1.1 出發(fā)菌株.- 4 - 1.1.2 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件.- 4 - 1.1.3 發(fā)酵效價(jià)測(cè)定.- 5 - 1.1.4 誘變處理.- 5 - 1.1.5 豆油耐性變種的選育.- 5 - 1.1.6 纈氨酸誘導(dǎo)變種的選育.- 5 - 1.2 預(yù)計(jì)結(jié)果.- 5 - 1.2.1 豆油耐性變種的選育.- 5 - 1.2.2 纈氨酸誘導(dǎo)變種的篩選.- 6 - 1.2.3 菌株 XC 4-18 的遺傳穩(wěn)定性.- 6 - 1.2.4 菌株 XC 4-18 與菌株 XC 1-19 的生產(chǎn)水平比.- 6 - 1.3 原

2、因分析.- 6 - 2 種子的擴(kuò)大化培養(yǎng).- 6 - 2.1 孢子制備.- 7 - 2.2 種子制備.- 7 - 2.3 種子培養(yǎng).- 7 - 2.4 種子質(zhì)量的控制.- 8 - 2.5 種子質(zhì)量的控制措施.- 8 - 3 培養(yǎng)基的設(shè)計(jì).- 8 - 3.1 碳源.- 9 - 3.2 氮源.- 9 - 3.3 無(wú)機(jī)鹽和微量元素.- 9 - 3.4 生長(zhǎng)因子.- 10 - 3.5 水.- 10 - 3.5 前體物.- 10 - 4 滅菌.- 10 - 4.1 連續(xù)滅菌流程及設(shè)備.- 11 - 4.1.1 流程的選擇.- 11 - 4.2 連續(xù)滅菌的操作.- 12 - 4.3 連續(xù)滅菌的計(jì)算.- 1

3、3 - 5 空氣除菌.- 14 - 5.1 空氣預(yù)處理與設(shè)備.- 15 - 5.2 油水分離與設(shè)備.- 15 - 5.3 生產(chǎn)規(guī)模設(shè)置.- 16 - 6 發(fā)酵過(guò)程中的控制參數(shù).- 17 - 6.1 發(fā)酵主要操作方式.- 17 - 6.2 發(fā)酵過(guò)程中的代謝變化參數(shù).- 18 - 6.2.1 物理參數(shù).- 18 - 6.2.2 化學(xué)參數(shù).- 19 - 6.2.3 生物參數(shù).- 20 - 6.2.4 發(fā)酵終點(diǎn)的判斷.- 20 - 7 相關(guān)計(jì)算.- 21 - 7.1 發(fā)酵罐的工藝尺寸.- 21 - 8 下游加工.- 23 - 8.1 發(fā)酵液預(yù)處理.- 24 - 8.2 過(guò)濾.- 24 - 8.3 醋酸

4、丁酯提取.- 24 - 8.4 水洗.- 25 - 8.5 水提.- 25 - 8.6 脫丁酯.- 25 - 8.7 結(jié)晶.- 25 - 8.8 產(chǎn)品檢測(cè).- 26 - 8.9 干燥包裝.- 26 - 參考文獻(xiàn).- 26 - 年產(chǎn)三百噸螺旋霉素發(fā)酵生產(chǎn)工藝設(shè)計(jì)年產(chǎn)三百噸螺旋霉素發(fā)酵生產(chǎn)工藝設(shè)計(jì) 引言引言 螺旋霉素，英文名 Spiramycin。白色或微黃色粉末，微有味；微吸濕； 易溶于乙醇、丙醇、丙酮和甲醇，難溶于水。具有強(qiáng)大的體內(nèi)抗菌作用和抗菌 后效應(yīng)（PAE） ，能夠增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的吞噬作用，廣泛分布于體內(nèi)。本品在組織 細(xì)胞內(nèi)濃度較紅霉素高，而副作用小于紅霉素。可用于治療由革蘭陽(yáng)性菌和某 些

5、革蘭陰性菌引起的耳、鼻、喉和呼吸道感染。該品系多組分大環(huán)內(nèi)酯類抗生 素，作用機(jī)制、抗菌譜與紅霉素相似，抗 肺組織菌作用與紅霉素相似或略遜， 但比其具有更長(zhǎng)的抗生素后效應(yīng)（PAE） 。與紅霉素有交叉耐藥。對(duì)革蘭陽(yáng)性菌 和一些革蘭陰性菌如鏈球菌、腦膜炎雙球菌、百日咳桿菌、梭狀芽胞桿菌等包 括對(duì)青霉素、鏈霉素、四環(huán)素、氯霉素耐藥菌均有效。對(duì)立克次體等有效。 在抗感染藥物市場(chǎng)中，大環(huán)內(nèi)酯類抗生素和頭孢菌素類、喹諾酮類、青霉 素類一起，成為四大主力軍團(tuán)。而螺旋霉素及其衍生物長(zhǎng)期以來(lái)一直占據(jù) 35% 左右的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素市場(chǎng)份額，正處于銷售成熟期。全國(guó)有螺旋霉素及其 衍生物的制劑生產(chǎn)企業(yè)近 100 家，

6、有穩(wěn)固的市場(chǎng)，有固定的銷售渠道，有叫得 響的品牌，有價(jià)格低廉的優(yōu)勢(shì)，相信今后市場(chǎng)銷售額還會(huì)穩(wěn)步上升。 后市發(fā)展?jié)摿薮螅耗壳?，我?guó)仍為發(fā)展中國(guó)家，13 億人口的人均年用藥 金額不到 10 美元，與發(fā)達(dá)國(guó)家 60 美元100 美元的用藥水平相比差距很大。 今后，隨著人民生活水平的逐步提高，醫(yī)療保障體系的日趨完善，對(duì)藥品的總 體需求還將不斷擴(kuò)大，醫(yī)藥市場(chǎng)這個(gè)蛋糕必將越做越大，螺旋霉素及其衍生物 市場(chǎng)銷售額也必定水漲船高。 1 1 菌種的選育菌種的選育 螺旋霉素的產(chǎn)生菌是生二素鏈霉菌(S.azmbo-faeiensis),在合成培養(yǎng)基上 氣生菌絲生長(zhǎng)快,白轉(zhuǎn)灰色,基內(nèi)菌絲為微黃色至微灰色,可溶色素淡

7、黃褐色。孢 子絲長(zhǎng),螺旋霉素形,松緊不一,孢子卵圓至球形。國(guó)產(chǎn)鏈霉菌新品種 L799,其孢 子長(zhǎng)方形,孢子表面有疣狀凸起并帶有粗短小刺。在大多數(shù)培養(yǎng)基上產(chǎn)生菌絲淡 紫灰,基內(nèi)菌絲呈葡萄紫。其孢子形成慢且不易保藏,因此要選擇適宜的保藏方 法和條件,以保證孢子的存活率。 菌種選擇：本設(shè)計(jì)采用的是中國(guó)微生物資源庫(kù)菌種保藏中心的產(chǎn)二素鏈霉 菌鏈霉，在實(shí)驗(yàn)室其發(fā)酵效價(jià)可達(dá)到 15003000u/mL。 根據(jù)螺旋霉素的生物合成途徑對(duì)螺旋霉素產(chǎn)生菌產(chǎn)二素鏈霉菌進(jìn)行推理選 育, 并獲得了高產(chǎn)菌株。首先在紫外線誘變的基礎(chǔ)上,篩選豆油耐性變株得到菌 株 XC 2-37, 其發(fā)酵效價(jià)較出發(fā)菌株 XC 1-29 提高

8、 9%。通過(guò)培養(yǎng)基優(yōu)化, 菌株 XC 2-37 的發(fā)酵效價(jià)提高 61.8% 。再以紫外線處理菌株 XC2-37,并篩選纈氨酸 誘導(dǎo)變株, 得到菌株 XC 3-11,其發(fā)酵效價(jià)較菌株 XC 2-37 提高 20%。菌株 XC 3-11 經(jīng)自然分 離得到菌株 XC 4-18, 發(fā)酵效價(jià)達(dá)到 4500u/ml,為原始出發(fā)菌 株 XC 1-29 的 2. 25 倍。傳代試驗(yàn)表明菌株 XC 4-18 的高產(chǎn)遺傳特性穩(wěn)定。 菌株 XC 4-18 應(yīng)用于 50m3發(fā)酵罐進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，與原始出發(fā)菌株 XC 1-29 相 比,發(fā)酵效價(jià)和發(fā)酵指數(shù)分別提高 84.9%和 43.6%。 螺旋霉素 ( spiramy

9、cin, SPM )為十六元大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,其內(nèi)酯環(huán)的生 物合成是由 5 分子乙酸、1 分子丙酸、1 分子丁酸和 1 分子未知前體(二碳單位)組 成。支鏈氨基酸,如纈氨酸等,經(jīng)分解代謝可產(chǎn)生乙酸、丙酸、丁酸, 作為 SPM 生物合成的前體?，F(xiàn)根據(jù) SPM 生物合成途徑對(duì) SPM 產(chǎn)生菌產(chǎn)二素鏈霉菌進(jìn)行推 理選育,并獲得了高產(chǎn)菌種。 1.11.1 材料與方法材料與方法 1.1.11.1.1 出發(fā)菌株出發(fā)菌株 產(chǎn)二素鏈霉菌( Strep tomy cesam bofaciens )XC 1-29。 1.1.21.1.2 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件 斜面培養(yǎng)基：含淀粉,豆餅粉,MgSO4，N

10、aCl,CaCO3 ,瓊脂; 以溫度 280.5,相對(duì)濕度 30%-50%，培養(yǎng) 12d。 平板培養(yǎng)基：含淀粉, KNO3,K2HPO4,MgSO4 ,NaCl，F(xiàn)eSO4,瓊脂;培養(yǎng)條件同 斜面（以溫度 280.5,相對(duì)濕度 30%-50%，培養(yǎng) 12d。 ） 。 種子培養(yǎng)基：含淀粉,豆餅粉,蛋白胨,玉米漿,KH2PO4,NaCl,CaCO3;以溫度 280.5,220r/min 培養(yǎng) 40h。 發(fā)酵培養(yǎng)基：含淀粉，葡萄糖,玉米漿魚(yú)粉，酵母粉, NH4NO3,KH2PO4,MgSO4,NaCl,CaCO3,豆油;以溫度 280.5,接種量 8% ,220r/min 培養(yǎng) 96h。 1.1.3

11、1.1.3 發(fā)酵效價(jià)測(cè)定發(fā)酵效價(jià)測(cè)定 杯碟法,檢定菌為藤黃八疊球菌 28001。 1.1.41.1.4 誘變處理誘變處理 將產(chǎn)二素鏈霉菌 XC 1-29 新鮮斜面孢子制成單孢子懸浮液，吸取 5ml 于無(wú) 菌平板中。置于波長(zhǎng) 253.7nm，功率 30W，紫外燈之下 30m 處，開(kāi)蓋，震蕩照射 60s。 1.1.51.1.5 豆油耐性變種的選育豆油耐性變種的選育 用豆油代替分離培養(yǎng)基中的淀粉, 將誘變存活孢子涂布于這一培養(yǎng)基上, 篩選豆油耐性變株(Oil)。 1.1.61.1.6 纈氨酸誘導(dǎo)變種的選育纈氨酸誘導(dǎo)變種的選育 將誘變存活孢子涂布在含 L-纈氨酸分離培養(yǎng)基中, 篩得纈氨酸誘導(dǎo)變種 (V

12、al)。 1.21.2 預(yù)計(jì)結(jié)果預(yù)計(jì)結(jié)果 1.2.11.2.1 豆油耐性變種的選育豆油耐性變種的選育 產(chǎn)二素鏈霉菌 XC1-29 經(jīng) UV 誘變后的存活孢子,適當(dāng)稀釋后涂布于含豆油 的平板培養(yǎng)基上,UV 誘變和不誘變孢子也分別稀釋涂于不含豆油的平板培養(yǎng)基 上作對(duì)照。以上 3 組各挑一定量菌落移種斜面,經(jīng)二級(jí)發(fā)酵后測(cè)定效價(jià),比較 SPM 生產(chǎn)能力。 結(jié)果表明:豆油耐性變株的發(fā)酵效價(jià)高于自然分離株與 UV 誘變株其中豆油 耐性突變株 XC 2-37 的發(fā)酵效價(jià)較出發(fā)菌株 XC 1-29 提高 9%。通過(guò)培養(yǎng)基優(yōu) 化，菌株 XC 2-37 的發(fā)酵效價(jià)又提高 6.8%. 1.2.21.2.2 纈氨酸誘

13、導(dǎo)變種的篩選纈氨酸誘導(dǎo)變種的篩選 以菌株 XC 2-37 為出發(fā)菌株，通過(guò) UV 誘變處理，并在含 L-纈氨酸的平板 培養(yǎng)基上篩選纈氨酸誘導(dǎo)變種，UV 誘變和未誘變菌株作對(duì)照。 結(jié)果表明：纈氨酸誘導(dǎo)變株的發(fā)酵效價(jià)高于自然分離株與紫外誘變株。 其 中纈氨酸誘導(dǎo)變株 XC 3-11 的發(fā)酵效價(jià)較出發(fā)菌株 XC 2-37 提高 20% 。菌株 XC 3-11 經(jīng)自然分離得到菌株 XC 4-18, 發(fā)酵效價(jià)達(dá)到 4500u/ml,比菌株 XC 3-11 提高 6.7% 。菌株 XC 4-18 的發(fā)酵效價(jià)是原始出發(fā)菌株的 2.25 倍。 1.2.31.2.3 菌株菌株 XCXC 4-184-18 的遺傳

14、穩(wěn)定性的遺傳穩(wěn)定性 用群體連續(xù)傳代的方法考察菌株 XC4-18 的傳代穩(wěn)定性,其生產(chǎn)能力波動(dòng)幅 度小, 說(shuō)明菌株 XC 4-18 的高產(chǎn)遺傳特性穩(wěn)定。 1.2.41.2.4 菌株菌株 XCXC 4-184-18 與菌株與菌株 XCXC 1-191-19 的生產(chǎn)水平比的生產(chǎn)水平比 菌株 XC 4-18 與菌株 XC 1-29 應(yīng)用于 50m3發(fā)酵罐的生產(chǎn)。菌株 XC 4-18 的發(fā)酵效價(jià)和發(fā)酵指數(shù)分別較出發(fā)菌株 XC 1-29 提高 84.9%和 43.6% 。 1.31.3 原因分析原因分析 螺旋霉素為大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,其內(nèi)酯環(huán)由五個(gè)乙酸，一個(gè)丙酸，一個(gè)丁酸 和一個(gè)未知前體構(gòu)成。在發(fā)酵培養(yǎng)基中

15、加入短鏈脂肪酸能刺激產(chǎn)二素鏈霉菌 SPM 的生物合成。都有分解能產(chǎn)生乙酸、丙酸、丁酸等短鏈脂肪酸, 豆油耐性 變種能提高菌株利用脂肪酸的能力, 因此能提高 SPM 產(chǎn)量。 纈氨酸等氨基酸代謝可產(chǎn)生乙酸、丙酸、丁酸,能刺激 SPM 的生物合成。 纈氨酸誘導(dǎo)變種能多產(chǎn)前體，導(dǎo)致 SPM 增產(chǎn)。 2 2 種子的擴(kuò)大化培養(yǎng)種子的擴(kuò)大化培養(yǎng) 工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模越大，每次發(fā)酵所需的種子就越多。要使小小的微生物在幾 十小時(shí)的較短時(shí)間內(nèi)，完成如此巨大的發(fā)酵轉(zhuǎn)化任務(wù)，那就必須具備數(shù)量巨大 的微 生物細(xì)胞才行。菌種擴(kuò)大培養(yǎng)的目的就是要為每次發(fā)酵罐的投料提供相當(dāng) 數(shù)量的代謝旺盛的種子。種子擴(kuò)大培養(yǎng)的任務(wù)，不但要得到純而壯

16、的菌體而且 還要獲得活力旺盛的、接種數(shù)量足夠的菌體。 的種子制備一般包括兩個(gè)過(guò)程，即在 固體培養(yǎng)基上生產(chǎn)大量孢子的孢子制 備和在液體培 養(yǎng)基中生產(chǎn)大量菌絲的種子制備過(guò)程。 養(yǎng)基中生產(chǎn)大量菌絲的 種子制備過(guò)程。 2.12.1 孢子制備孢子制備 孢子制備是種子制備的開(kāi)始，是發(fā)酵生產(chǎn)的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。孢子的質(zhì)量、 數(shù)量對(duì)以后菌絲的生長(zhǎng)、繁殖和發(fā)酵產(chǎn)量都有明顯的影響。不同菌種的孢子制 備工藝有其不同的特點(diǎn)。 霉菌的孢子培養(yǎng)，一般以大米、小米、玉米、 麩皮、麥粒等天然農(nóng)產(chǎn)品為 培養(yǎng)基。這是由于這些農(nóng)產(chǎn)品中的營(yíng)養(yǎng)成分較適合霉菌的孢子繁殖，而且這類 培養(yǎng)基的表面積較大，可獲得大量的孢子。霉菌的培養(yǎng)一般為 25

17、28，培養(yǎng) 時(shí)間為 4 14 天。 2.22.2 種子制備種子制備 種子制備是將固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)出的孢子或菌體轉(zhuǎn)入到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)， 使其繁殖成大量菌絲或菌體的過(guò)程。 搖瓶種子制備：某些孢子發(fā)芽和菌絲繁殖速度緩慢的菌種，需將孢子經(jīng) 搖瓶培養(yǎng)成菌絲后再進(jìn)入種子罐，這就是搖瓶種子。搖瓶相當(dāng)于微縮了的種子 罐，其培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件與種子罐相似。搖瓶種子進(jìn)罐，常采用母瓶、子 瓶?jī)杉?jí)培養(yǎng) 種子罐種子制備：種子罐種子制備的工藝過(guò)程，因菌種不同而異，一般 可分為一級(jí)種子、二級(jí)種子和三級(jí)種子的制備。孢子(或搖瓶菌絲)被接入到體 積較小的種子罐中，經(jīng)培養(yǎng)后形成大量的菌絲，這樣的種子稱為一級(jí)種子，把 一級(jí)種子

18、轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵，稱為二級(jí)發(fā)酵。把一級(jí)種子轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵， 稱為二級(jí)發(fā)酵。 螺旋霉素的種子制備需采用種子罐種子植被的方式，并采用二級(jí)發(fā)酵的方 式。 接種齡：接種處于對(duì)數(shù)期的細(xì)菌。 接種量：接種量定為 8%。 2.32.3 種子培養(yǎng)種子培養(yǎng) 種子培養(yǎng)要求一定量的種子，在適宜的培養(yǎng)基中，控制一定的培養(yǎng)條件和 培養(yǎng)方法，從而保證種子正常生長(zhǎng)。工業(yè)微生物培養(yǎng)法分為靜置培養(yǎng)和通氣培 養(yǎng)兩大類型。 液體深層種子罐從罐底部通氣，送入的空氣由攪拌槳葉分散成微小氣泡以 促進(jìn)氧的溶解。這種由罐底部通氣攪拌的培養(yǎng)方法，相對(duì)于由氣液界面靠自然 擴(kuò)散使氧溶解的表面培養(yǎng)法來(lái)講，稱為液體深沉培養(yǎng)。 其特點(diǎn)是容易按照生產(chǎn)菌

19、種對(duì)于代謝的營(yíng)養(yǎng)要求以及不同生理時(shí)期的通氣、 攪拌、溫度與培養(yǎng) 基中氫離子濃度等條件，選擇最佳培養(yǎng)條件。故采用液體深 沉培養(yǎng)法。 2.42.4 種子質(zhì)量的控制種子質(zhì)量的控制 培養(yǎng)基：與發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基類似。因?yàn)槭擎咦优囵B(yǎng)，所以須去掉其中的 豆油，動(dòng)物蛋白 NY 等，以使其成為單一氮源的培養(yǎng)基。 培養(yǎng)溫度和濕度：要獲得高質(zhì)量的孢子，其最適溫度區(qū)間很狹窄，必須保 證在最適范圍。培養(yǎng)溫度：28。查閱資料的其相對(duì)濕度應(yīng)當(dāng)保持在 40%50% 之間。 通氣量：生二素鏈霉菌為嚴(yán)格的好養(yǎng)菌，因其采用的是二級(jí)種子發(fā)酵罐， 故通氣量定為 1/1.5. 斜面冷藏時(shí)間：冷藏時(shí)間為不超過(guò)七到八天。 2.52.5 種子

20、質(zhì)量的控制措施種子質(zhì)量的控制措施 菌種穩(wěn)定性的檢查：取少量保藏菌種置于滅菌生理鹽水中，逐級(jí)稀釋，在 含有瓊脂培養(yǎng)記得雙碟上劃線培養(yǎng)，菌液稀釋度以雙碟上所生長(zhǎng)的菌落不至過(guò) 密為宜。挑選出形態(tài)整齊、孢子豐滿的菌落進(jìn)行搖瓶試驗(yàn)，測(cè)定其生產(chǎn)能力， 以不低于其原有生產(chǎn)活力為原則，并取生產(chǎn)能力高的菌種備用。 無(wú)雜菌檢查：種子液顯微鏡觀察，肉湯或瓊脂斜面接入種子培養(yǎng)液進(jìn)行無(wú) 菌試驗(yàn)和對(duì)種子液進(jìn)行生化分析。其中無(wú)菌試驗(yàn)是判斷雜菌的主要依據(jù)。 3 3 培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)培養(yǎng)基的設(shè)計(jì) 發(fā)酵培養(yǎng)基成分為水、淀粉 7.0%、黃豆粉餅 1.5%、動(dòng)物蛋白 NY0.5%、糊 精 1.2%、玉米漿 0.7%、碳酸鈣、硝酸銨、氯化

21、鈉、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、硫酸 銨等。根據(jù)螺旋霉素產(chǎn)生菌的代謝情況,在發(fā)酵 96 h 或 120 h,以 10.5 比例 補(bǔ)加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)提高發(fā)酵單位。 成分小罐%（g/mL） 黃豆餅粉 玉米漿 1.5 0.7 淀粉7.0 NaCl0.3 CaCO30.5 （NH4）2SO40.12 豆油0.8 糊精1.2 3.13.1 碳源碳源 凡是構(gòu)成微生物細(xì)胞和代謝產(chǎn)物中碳素的營(yíng)養(yǎng)并提供能量的物質(zhì)均稱為， 并提供能量的物質(zhì)碳源。目前發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)中多用魚(yú)粉或黃豆粉餅，黃 豆粉餅的優(yōu)點(diǎn)是原材料質(zhì)量穩(wěn)定，染菌率低，但發(fā)酵效價(jià)相對(duì)較低，以魚(yú)粉作 氮源發(fā)酵效價(jià)相對(duì)較高，但魚(yú)粉質(zhì)量質(zhì)量不穩(wěn)定。發(fā)酵條件研究發(fā)現(xiàn):不同

22、碳源 中以淀粉最好,糊精次之,最差是蔗糖和乳糖;不同氫源中以魚(yú)粉最好,輔加氫源 中以硝酸鐵最好。對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行改進(jìn)，在黃豆粉餅中加入動(dòng)物蛋白 NY，提高發(fā) 酵水平。 3.23.2 氮源氮源 凡是構(gòu)成微生物細(xì)胞和代謝產(chǎn)物中氮素的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)均稱為氮源，氮源可分 為有機(jī)氮源和無(wú)機(jī)氮源。上文提到的動(dòng)物蛋白 NY,以及黃豆粉餅和一些無(wú)機(jī)氮 源，如硝酸銨。 3.33.3 無(wú)機(jī)鹽和微量元素?zé)o機(jī)鹽和微量元素 無(wú)機(jī)鹽（mineral salt）和微量元素(trace element, microelement)是 生理活性物質(zhì)的組成成分或具有生理調(diào)節(jié)作用，磷（核酸） 、硫、鐵（細(xì)胞色素） 、鎂、鈣（調(diào)節(jié)細(xì)胞膜透性）

23、 、錳、銅、鋅（輔酶或激活劑） 、鈷、鉀、鈉（調(diào) 節(jié)滲透壓） 、氯。一般低濃度起促進(jìn)作用，高濃度起抑制作用。 3.43.4 生長(zhǎng)因子生長(zhǎng)因子 生長(zhǎng)因子是指氨基酸、核苷酸、維生素、脂肪酸等菌體必須地生理活性物質(zhì)。在這種 天然培養(yǎng)集中已然含有無(wú)需添加。 3.53.5 水水 誰(shuí)是生命活動(dòng)不可或缺的物質(zhì)，是細(xì)胞的主要成分，良好的介質(zhì)，營(yíng)養(yǎng)傳遞的道體， 調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)。 3.53.5 前體物前體物 在抗生素發(fā)酵過(guò)程中加入前提物可以控制菌體合成抗生素的方向和增加抗 生素的產(chǎn)量。在螺旋霉素發(fā)酵中不同的前體物對(duì)發(fā)酵有不同的影響。 本設(shè)計(jì)用正丙醇（3C）作為前體物，加量在 0.668%1.000%之間，分次加 入

24、，每隔十六小時(shí)加一次。 4 4 滅菌滅菌 滅菌是指利用物理或化學(xué)方法殺滅或除去物料及設(shè)備中的一切有生命物質(zhì) 的過(guò)程。常用的滅菌方法有：化學(xué)滅菌法，電磁波射線滅菌法，干熱滅菌法， 濕熱滅菌法，過(guò)濾除菌法，火焰滅菌法。因本設(shè)計(jì)是針對(duì)大型工業(yè)發(fā)酵的設(shè)計(jì)， 因此一般采用蒸汽濕熱滅菌法。 在發(fā)酵工業(yè)中，對(duì)培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備的滅菌，廣泛采用濕熱滅菌法。工廠 里，蒸汽比較容易獲得，控制操作條件方便，是一種簡(jiǎn)單又廉價(jià)有效的滅菌方 法。用濕熱滅菌的方法處理培養(yǎng)基，其加熱溫度和受熱時(shí)間與滅菌程度和營(yíng)養(yǎng) 成分的破壞都有關(guān)系。營(yíng)養(yǎng)成分的減少將影響菌種的培養(yǎng)和產(chǎn)物的生成，所以 滅菌程度和營(yíng)養(yǎng)成分的破壞成為滅菌工作的主要矛

25、盾。 4.1 連續(xù)滅菌流程及設(shè)備連續(xù)滅菌流程及設(shè)備 培養(yǎng)基的分批滅菌就是將配置好的培養(yǎng)基放在發(fā)酵罐或其他裝置中，通入 蒸汽將培養(yǎng)基和所用設(shè)備一起進(jìn)行加熱滅菌的過(guò)程。而規(guī)模較小發(fā)酵罐往往采 用分批滅菌的方法，又叫實(shí)罐滅菌。工業(yè)生產(chǎn)中大規(guī)模的滅菌應(yīng)盡量采用高溫 短時(shí)間的連續(xù)滅菌。連續(xù)滅菌具有以下特點(diǎn)： 與分批發(fā)酵相比培養(yǎng)液受熱時(shí)間短，可縮短發(fā)酵周期，同時(shí)培養(yǎng)基成分 破壞較少。 產(chǎn)品質(zhì)量交易控制。 蒸汽負(fù)荷均勻，鍋爐利用率高，才做方便。 適宜采用自動(dòng)控制。 降低勞動(dòng)強(qiáng)度。 培養(yǎng)基經(jīng)連續(xù)加熱、維持和冷卻后進(jìn)入發(fā)酵罐。 4.1.14.1.1 流程的選擇流程的選擇 流程可分為：連消塔噴淋冷卻流程、噴射加熱

26、真空冷卻流程、板式換 熱器滅菌流程本設(shè)計(jì)采用連消塔噴淋冷卻流程。 具體步驟：配好的培養(yǎng)基打入連消塔與蒸汽直接混合，達(dá)到滅菌溫度后進(jìn) 入維持罐，維持一定時(shí)間后經(jīng)噴淋冷卻器至一定溫度后進(jìn)入發(fā)酵罐。連續(xù)滅菌 的基本設(shè)備一般包括： 配料預(yù)熱罐，將配好的料液預(yù)熱到 6070 ，以避免滅菌時(shí)由于料液 與蒸汽溫度相差過(guò)大而產(chǎn)生水汽撞擊聲； 連消塔，連消塔的作用主要是使高溫蒸汽與料液迅速接觸混合，并使料 液的溫度很快升高到滅菌溫度； 維持罐，連消塔加熱的時(shí)間很短，光靠這段時(shí)間的滅菌是不夠的； 冷卻管，從維持罐出來(lái)的料液要進(jìn)行冷卻管冷卻，生產(chǎn)上一般采用冷卻 水噴淋冷卻，冷卻到 4050 后，輸送到預(yù)先已滅菌過(guò)的

27、罐中。 相較于其他兩種連續(xù)滅菌流程來(lái)說(shuō)連消塔-噴淋冷卻流程滅菌較徹底，而噴 射加熱-真空冷卻流程中由于真空的影響，再蒸發(fā)室下要安裝一臺(tái)出料泵，或?qū)?蒸發(fā)室置于離發(fā)酵罐液面 10m 以上的高度，否則物料就不能流進(jìn)發(fā)酵罐而進(jìn)入 真空系統(tǒng)，這就帶來(lái)了不方便，尤其是對(duì)于已經(jīng)滅菌好的培養(yǎng)基來(lái)說(shuō)，出料的 泵的密封要求很高才能避免重新污染。故此不采用。 而板式換熱器流程進(jìn)行連續(xù)滅菌時(shí)加熱和冷卻 比噴射式連續(xù)滅菌長(zhǎng)，滅菌 過(guò)程中的所需設(shè)備多，操作較為麻煩，染菌機(jī)會(huì)多。故此不采用。 4.24.2 連續(xù)滅菌的操作連續(xù)滅菌的操作 培養(yǎng)基在采用連續(xù)滅菌時(shí)，發(fā)酵罐應(yīng)該在連續(xù)滅菌前先進(jìn)行空罐滅菌，通 常先把發(fā)酵罐的空氣過(guò)

28、濾器滅菌并用空氣吹干。加熱器、維持罐及冷卻設(shè)備也 應(yīng)先行滅菌。組成培養(yǎng)基的不同成分可以在不同的溫度下分開(kāi)進(jìn)行滅菌，以減 少培養(yǎng)基受熱破壞的程度。連續(xù)滅菌時(shí)，培養(yǎng)基在短時(shí)間內(nèi)被加熱到 131 ， 短時(shí)間保溫 8min 后，被快速冷卻，在進(jìn)入早已滅菌完畢的發(fā)酵罐 （1）配料 配料罐用于培養(yǎng)基的配置。然后將培養(yǎng)基用泵打入預(yù)熱桶中。 、 （1）預(yù)熱 預(yù)熱桶的作用一是定容，而是預(yù)熱。預(yù)熱的目的是使培養(yǎng)基在 后續(xù)的加熱過(guò)程中能快速的升到指定的滅菌溫度，同時(shí)避免太多的冷凝水帶入 培養(yǎng)基，還可減少震動(dòng)和噪聲。一般可將培養(yǎng)基預(yù)熱到 7090 . （3）預(yù)熱好的培養(yǎng)基由連消泵打入加熱器。加熱器也稱連消塔，使培養(yǎng)基

29、 與蒸汽混合并迅速達(dá)到滅菌溫度。加熱采用的蒸汽壓力一般為 0.450.8MPa， 其目的是使培養(yǎng)基在較短時(shí)間（2030s）里快速升溫。加熱器有塔式加熱器和 噴射加熱器兩種。 （4）保溫 保溫是將培養(yǎng)基維持滅菌溫度一段時(shí)間，使殺滅微生物的主要 過(guò)程。其設(shè)備有維持罐和管事罐兩種。保溫設(shè)備一般采用保溫材料包裹，但不 直接通入蒸汽。 （5）降溫 升降溫快是連續(xù)滅菌的主要特征之一，為避免培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分 的破壞，保溫后的培養(yǎng)基需要迅速降溫至接近培養(yǎng)溫度（4050 ）.國(guó)內(nèi)大 多采數(shù)用噴淋冷卻設(shè)備，也有采用螺旋板式換熱器、板式換熱器、真空冷卻器 等。反應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)基的特點(diǎn)、處理量、場(chǎng)地特性選用噴淋冷卻設(shè)備。

30、4.34.3 連續(xù)滅菌的計(jì)算連續(xù)滅菌的計(jì)算 連續(xù)滅菌包括升溫、保溫和降溫三個(gè)階段，滅菌主要是在保溫過(guò)程中實(shí)現(xiàn) 的，在升溫后期也有一定的滅菌作用。 此發(fā)酵罐內(nèi)裝培養(yǎng)基 835.713=278.57,在 131下進(jìn)行連續(xù)滅菌，設(shè)每毫 升培養(yǎng)基中含耐熱的芽孢為 107個(gè)，培養(yǎng)基體積流量 G10m3/h=0.17 m3/min 滅菌時(shí)間的計(jì)算 ：連續(xù)滅菌時(shí)間的確定應(yīng)參考理論滅菌時(shí)間作適當(dāng)延長(zhǎng)或 縮短。發(fā)酵罐采用 300m3容積。在 131 下進(jìn)行分批滅菌，此溫度下的滅菌速 度常數(shù)為 0.25 s-1。 則培養(yǎng)基中活微生物： N0 =278.57106107=2.81015個(gè) 經(jīng)過(guò) 時(shí)間滅菌后培養(yǎng)基中的

31、活微生物： Ns0.001 個(gè) 根據(jù)： Lgk=14845/T 36.127 =14845/(273+121)36.127 =1.55 得 k=0.0281s-1 理論滅菌時(shí)間 =1/kln （N0/ Ns） =1/0.0281ln（2.81015/0.001）=692.07s =11.5min 實(shí)際滅菌取理論滅菌時(shí)間的兩倍 23min，約為 1h。 以下是關(guān)于滅菌保溫時(shí)間的計(jì)算： C0=107個(gè)/ml CS=0.001/278/106/103=3.610-15 =ln（C0/CS）/k=81S 在維持罐內(nèi)的物料會(huì)有反混，為保險(xiǎn)起見(jiàn)，實(shí)際維持時(shí)間取理論滅菌時(shí)間 的 5 倍。 =815=405s

32、=6.75min 維持罐的體積的計(jì)算： 維持罐的體積 V=G實(shí) 培養(yǎng)基體積流量 G10m3/h=0.17 m3/min 則 V =0.17 m3/min6.75min=1147.5L 維持罐的 H/D 一般為 1.21.5，裝料系數(shù)為 0.850.9（取裝料系數(shù)為 0.85） 則維持罐的實(shí)際體積： V實(shí)=2m3 5 5 空氣除菌空氣除菌 空氣是由氮?dú)?、氧氣、二氧化碳、惰性氣體、水蒸氣以及懸浮在空氣中的 塵埃等組成的混合物?？諝獬?jīng)?？梢詸z測(cè)到一些細(xì)菌及其芽孢、酵母、真 菌和病毒。 無(wú)菌空氣的制備：原理及簡(jiǎn)單過(guò)程：微生物體積很小，空氣中附著在塵埃 上的微生物大小為 0.55m。過(guò)濾介質(zhì)可以除去

33、游離的微生物和附著在其他 物質(zhì)上的微生物。其原理在于空氣通過(guò)過(guò)濾介質(zhì)時(shí)，顆粒在離心場(chǎng)產(chǎn)生沉降， 同時(shí)慣性碰撞產(chǎn)生摩擦黏附，顆粒的布朗運(yùn)動(dòng)使微粒之間相互集聚成大顆粒， 顆粒接觸介質(zhì)表面，直接被截留。氣流速度越大，慣性越大，截留效果越好。 慣性碰撞截留起主要作用，另外靜電引力也有一定作用。 無(wú)菌空氣的制備一般是把吸入的空氣先經(jīng)過(guò)壓縮機(jī)前的過(guò)濾器過(guò)濾，再進(jìn) 入空氣壓縮機(jī)，從空氣壓縮機(jī)出來(lái)的空氣（一般壓力在 1.96105Pa 以上，溫 度 120150） ，先冷卻到適當(dāng)?shù)臏囟龋?025）除去油和水，再加熱至 3035，最后通過(guò)總過(guò)濾器和分過(guò)濾器除菌，從而獲得潔凈度、壓力、溫度 和流量都符合要求的無(wú)菌

34、空氣。具有一定壓力的無(wú)菌空氣可以克服在預(yù)處理、 過(guò)濾除菌及有關(guān)設(shè)備、管道、閥門匯總的壓力損失，并在培養(yǎng)過(guò)程中能夠使發(fā) 酵罐維持一定的罐壓。 因此，過(guò)濾除菌的流程必須有供氣設(shè)備空氣壓縮機(jī)，對(duì)空氣提供足夠 的能量，同時(shí)還要具有高效的過(guò)濾除菌設(shè)備以除去空氣中的微生物顆粒。要保 持過(guò)濾器在比較高的效率下進(jìn)行過(guò)濾，并維持一定的氣流速度和不受油、水的 干擾，則要有一系列的加熱、冷卻及分離和除雜設(shè)備來(lái)保證。 5.15.1 空氣預(yù)處理與設(shè)備空氣預(yù)處理與設(shè)備 采風(fēng)塔：在工廠的上風(fēng)頭，高度一般在 20m 左右，設(shè)計(jì)流速 8m/s?？山ㄔ?空壓機(jī)的屋頂上。 粗過(guò)濾器：安裝在空壓機(jī)吸入口前，前置過(guò)濾器。作用是截留空氣

35、中較大 的灰塵，保護(hù)壓縮機(jī)，減輕總過(guò)濾器的負(fù)擔(dān)，也能起到一定除菌作用。介質(zhì)為 泡沫塑料（平板式）或無(wú)紡布（折疊式） ，流速 0.10.5 m/s。要求是阻力小， 容灰量大。 空氣壓縮機(jī)：作用是提供空氣流動(dòng)的動(dòng)力。常用往復(fù)式、螺桿式、渦輪式 空壓機(jī)。 空氣貯罐：消除壓縮空氣的脈動(dòng)，用于往復(fù)式空壓機(jī)。螺桿和渦輪式提供 均勻連續(xù)空氣可省去。設(shè)置在空壓站附近。 冷卻器：空氣壓縮機(jī)出口氣溫一般在 120，必需冷卻。在潮濕季節(jié)，除 濕?？諝饫鋮s器的傳熱系數(shù)為 105W/(m2)。采用雙程或四程結(jié)構(gòu)，兩級(jí)串聯(lián) 使用。第一級(jí)循環(huán)水冷卻，第二級(jí)低溫水（9）冷卻。設(shè)置在發(fā)酵車間外。壓 縮空氣每經(jīng)過(guò) 1m 管道，溫

36、度下降 0.51.0。 5.25.2 油水分離與設(shè)備油水分離與設(shè)備： 氣液分離設(shè)備：除去空氣中油和水，保護(hù)過(guò)濾介質(zhì)。旋風(fēng)分離器和絲網(wǎng)除 沫器兩類。 旋風(fēng)分離器：利用離心沉降原理。結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，阻力小，分離效率高。壓縮 空氣的速度 1525m/s，切線方向進(jìn)入旋風(fēng)分離器，在環(huán)隙內(nèi)做圓周運(yùn)動(dòng)，水 滴或固體顆粒被甩向器壁，而收集。完全除去 20m 以上離子，對(duì) 10m 離子 的分離效率為 6070。 絲網(wǎng)除沫器：利用慣性攔截原理。對(duì) 1m 以上的霧滴除去率 98。 空氣加熱設(shè)備：空氣相對(duì)濕度仍然為 100，需要降到 70以下，才能 進(jìn)入空氣過(guò)濾器。列管式換熱器，空氣走管程，蒸汽走殼程。套夾式加熱器， 空

37、氣走管程，蒸汽走夾套 空氣過(guò)濾介質(zhì)與設(shè)備：要求除菌效率高，耐受高溫高壓，不易被油水污染， 阻力小，成本低，易更換。常用的介質(zhì)有棉花、活性炭、玻璃棉、超細(xì)比例纖 維紙、石棉濾板等。 纖維及顆粒介質(zhì)過(guò)濾器：圓筒形，直徑 2.53m?？讖?1015mm。空氣從 下方進(jìn)入，上方引出。常用介質(zhì)棉花、玻璃纖維、活性炭等?？諝饬魉?0.20.3m/s?？勺鳛榭傔^(guò)濾器?？傔^(guò)濾器每月滅菌一次。應(yīng)該有備用過(guò)濾器， 滅菌時(shí)交換使用。 5.35.3 生產(chǎn)規(guī)模設(shè)置生產(chǎn)規(guī)模設(shè)置 二、三級(jí)過(guò)濾器，第一級(jí)為總過(guò)濾器，二、三級(jí)為分過(guò)濾器。 空氣過(guò)濾除菌的工藝流程: (1)空氣凈化的一般流程如下：空氣吸入口粗過(guò)濾器空氣壓縮機(jī)一

38、級(jí)空氣冷卻器二級(jí)空氣冷卻器分水器空氣儲(chǔ)罐旋風(fēng)分離器絲網(wǎng)除沫 器空氣加熱器總空氣過(guò)濾器分空氣過(guò)濾器無(wú)菌空氣。 (2)為了獲得無(wú)菌空氣，一般采用三個(gè)主要工段。第一個(gè)工段提高空氣的 潔凈度：前過(guò)濾器可減少壓縮機(jī)活塞和氣缸的磨損，減少介質(zhì)負(fù)荷。第二個(gè)工 段除去空氣中油和水：采用分級(jí)冷卻，一級(jí)冷卻采用 30左右的水使空氣冷卻 到 4050，二級(jí)冷卻器采用 9冷水或 1518地下水，使空氣冷卻到 2025。冷卻后，空氣濕度提高了 100，濕度處于露點(diǎn)以下，油和水凝結(jié) 成油滴和水滴，在空氣貯藏罐內(nèi)沉降大液滴。旋風(fēng)分離器分離 5m 以上的液滴。 絲網(wǎng)除沫器分離 5m 以下液滴。第三個(gè)工段獲得無(wú)菌空氣：分離油水后的空氣 濕度仍然達(dá) 100，溫度稍下降，就會(huì)產(chǎn)生水滴，使介質(zhì)吸潮。加熱提高