液相色譜使用教程..參考課件.ppt

1、高效液相色譜儀使用淺析 泰鴿安全科技有限公司分析檢測中心,泰鴿安全科技有限公司,1,高效液相色譜法,概述 高效液相色譜法的發(fā)展 在所有色譜技術(shù)中，液相色譜法（liquid chromatography，LC）是最早（1903年）發(fā)明的，但其初期發(fā)展比較慢，在液相色譜普及之前，紙色譜法、氣相色譜法和薄層色譜法是色譜分析法的主流。到了20世紀(jì)60年代后期，將已經(jīng)發(fā)展得比較成熟的氣相色譜的理論與技術(shù)應(yīng)用到液相色譜上來，使液相色譜得到了迅速的發(fā)展。特別是填料制備技術(shù)、檢測技術(shù)和高壓輸液泵性能的不斷改進(jìn)，使液相色譜分析實(shí)現(xiàn)了高效化和高速化。具有這些優(yōu)良性能的液相色譜儀于1969年商品化。從此，這種分離效

2、率高、分析速度快的液相色譜就被稱為高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC），也稱高壓液相色譜法或高速液相色譜法。氣相色譜只適合分析較易揮發(fā)、且化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的有機(jī)化合物，而HPLC則適合于分析那些用氣相色譜難以分析的物質(zhì)，如揮發(fā)性差、極性強(qiáng)、具有生物活性、熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)?，F(xiàn)在，HPLC的應(yīng)用范圍已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過氣相色譜，位居色譜法之首。,2,高效液相色譜法的類型,廣義地講，固定相為平面狀的紙色譜法和薄層色譜法也是以液體為流動相，也應(yīng)歸于液相色譜法。不過通常所說的液相色譜法僅指所用固定相為柱型的柱液相色譜法。通常將液相色譜法按分離機(jī)理分

3、成吸附色譜法、分配色譜法、離子色譜法和凝膠色譜法四大類。其實(shí)，有些液相色譜方法并不能簡單地歸于這四類。表1列舉了一些液相色譜方法。按分離機(jī)理，有的相同或部分重疊。但這些方法或是在應(yīng)用對象上有獨(dú)特之處，或是在分離過程上有所不同，通常被賦予了比較固定的名稱。,3,高效液相色譜法的類型,高效液相色譜法按分離機(jī)制的不同分為液固吸附色譜法、液液分配色譜法（正相與反相）、離子交換色譜法、離子對色譜法及分子排阻色譜法。 1液固色譜法 使用固體吸附劑，被分離組分在色譜柱上分離原理是根據(jù)固定相對組分吸附力大小不同而分離。分離過程是一個吸附解吸附的平衡過程。常用的吸附劑為硅膠或氧化鋁，粒度510m。適用于分離分子

4、量2001000 的組分，大多數(shù)用于非離子型化合物，離子型化合物易產(chǎn)生拖尾。常用于分離同分異構(gòu)體。,4,高效液相色譜法的類型,2.液液色譜法 使用將特定的液態(tài)物質(zhì)涂于擔(dān)體表面，或化學(xué)鍵合于擔(dān)體表面而形成的固定相，分離原理是根據(jù)被分離的組分在流動相和固定相中溶解度不同而分離。分離過程是一個分配平衡過程。 涂布式固定相應(yīng)具有良好的惰性；流動相必須預(yù)先用固定相飽和，以減少固定相從擔(dān)體表面流失；溫度的變化和不同批號流動相的區(qū)別常引起柱子的變化；另外在流動相中存在的固定相也使樣品的分離和收集復(fù)雜化。由于涂布式固定相很難避免固定液流失，現(xiàn)在已很少采用?，F(xiàn)在多采用的是化學(xué)鍵合固定相，如C18、C8、氨基柱、

5、氰基柱和苯基柱。,5,高效液相色譜法的類型,液液色譜法按固定相和流動相的極性不同可分為正相色譜法(NPC)和反相色譜法(RPC)。 正相色譜法 采用極性固定相(如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相)；流動相為相對非極性的疏水性溶劑(烷烴類如正已烷、環(huán)已烷），常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調(diào)節(jié)組分的保留時(shí)間。常用于分離中等極性和極性較強(qiáng)的化合物(如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等）。 反相色譜法 一般用非極性固定相（如C18、C8）；流動相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機(jī)溶劑以調(diào)節(jié)保留時(shí)間。適用于分離非極性和極性較弱的化合物。RPC 在現(xiàn)代液相色譜中應(yīng)用最

6、為廣泛，據(jù)統(tǒng)計(jì)，它占整個HPLC 應(yīng)用的80%左右。,6,正相色譜法與反相色譜法比較表,7,高效液相色譜法的類型,3離子交換色譜法 固定相是離子交換樹脂，常用苯乙烯與二乙烯交聯(lián)形成的聚合物骨架，在表面未端芳環(huán)上接上羧基、磺酸基（稱陽離子交換樹脂）或季氨基（陰離子交換樹脂）。被分離組分在色譜柱上分離原理是樹脂上可電離離子與流動相中具有相同電荷的離子及被測組分的離子進(jìn)行可逆交換，根據(jù)各離子與離子交換基團(tuán)具有不同的電荷吸引力而分離。 緩沖液常用作離子交換色譜的流動相。,8,高效液相色譜法的類型,4離子對色譜法 又稱偶離子色譜法，是液液色譜法的分支。它是根據(jù)被測組分離子與離子對試劑離子形成中性的離子對

7、化合物后，在非極性固定相中溶解度增大，從而使其分離效果改善。主要用于分析離子強(qiáng)度大的酸堿物質(zhì)。,9,高效液相色譜法的類型,5排阻色譜法 固定相是有一定孔徑的多孔性填料，流動相是可以溶解樣品的溶劑。小分子量的化合物可以進(jìn)入孔中，滯留時(shí)間長；大分子量的化合物不能進(jìn)入孔中，直接隨流動相流出。它利用分子篩對分子量大小不同的各組分排阻能力的差異而完成分離。常用于分離高分子化合物，如組織提取物、多肽、蛋白質(zhì)、核酸等。,10,表1 HPLC按分離機(jī)理的分類,11,HPLC在不同領(lǐng)域的主要應(yīng),HPLC幾乎在所有學(xué)科領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用，可以用于絕大多數(shù)物質(zhì)成分的分離分析，它和氣相色譜都是應(yīng)用最廣泛的儀器分析技術(shù)，

8、HPLC在部分領(lǐng)域的主要分析對象物質(zhì)列于表2,12,表2 HPLC在各領(lǐng)域的主要應(yīng)用,13,高效液相色譜法的流程,液相色譜儀流程圖,2,1,4,5,6,7,3,流動相容器,高壓輸液泵,進(jìn)樣器,色譜柱,檢測器,工作站,廢液瓶,14,液相色譜儀工作流程,現(xiàn)在的液相色譜儀一般都做成一個個單元組件，然后根據(jù)分析要求將各所需單元組件組合起來。最基本的組件是高壓輸液泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測器和數(shù)據(jù)系統(tǒng)（記錄儀、積分儀或色譜工作站）。 液相色譜儀的工作過程：輸液泵將流動相以穩(wěn)定的流速（或壓力）輸送至分析體系，在色譜柱之前通過進(jìn)樣器將樣品導(dǎo)入,流動相將樣品帶入色譜柱,在色譜柱中各組分因在固定相中的分配系數(shù)或吸

9、附力大小的不同而被分離，并依次隨流動相流至檢測器，檢測到的信號送至數(shù)據(jù)系統(tǒng)記錄、處理或保存。,15,液相色譜分離模式的選擇,分離方式是按固定相的分離機(jī)理分類的，選定了固定相（色譜柱）基本上就確定了分離方式。當(dāng)然，即使同一根色譜柱，如果所用流動相和其它色譜條件不同，也可能成為不同的分離方式。選擇分離方式大體上可以參照圖3,16,高效液相色譜法的運(yùn)用范圍,氣相色譜法適用于分析相對分子質(zhì)量較小，容易揮發(fā)成氣體的物質(zhì)。 氣相色譜法控制溫度可達(dá)300，熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)在此溫度下將發(fā)生分解，但高沸點(diǎn)物質(zhì)在此溫度下也不能完全氣化 高沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性差的有機(jī)化合物、以及相對分子質(zhì)量大(大于400)的有機(jī)物(約占

10、有機(jī)物總數(shù)的70%80%)，均不宜應(yīng)用氣相色譜法進(jìn)行分析，但可以應(yīng)用高效液相色譜法進(jìn)行分析。,17,高效液相色譜法的運(yùn)用范圍,高效液相色譜法在常溫下進(jìn)行分離與分析，不會導(dǎo)致被測物質(zhì)的熱分解，其流動相是液體，所以只要試樣能制備成溶液，原則上都可以用高效液相色譜法分離與分析，如離子型化合物、不穩(wěn)定天然產(chǎn)物以及氨基酸、蛋白質(zhì)等高分子化合物均可用高效液相色譜法獲得較好的分離效果。,18,高效液相色譜法的運(yùn)用范圍,高效液相色譜分離方法的選擇 選擇的基本依據(jù) 相對分子質(zhì)量的大?。?對于相對分子質(zhì)量在200以下、易揮發(fā)、熱穩(wěn)定性好的化合物，可采用氣相色譜法； 相對分子質(zhì)量在2002000的化合物，可用液-固

11、色譜法、液-液色譜法、離子交換色譜法 相對分子質(zhì)量大于2000的試樣，適宜用凝膠色譜法進(jìn)行分離,19,高效液相色譜法的運(yùn)用范圍,試樣的溶解性 能迅速溶于水的樣品，可采用反相液-液色譜法； 若試樣全部或大部分能溶于HCl或NaOH溶液，表示試樣屬于離子型化合物，可采用離子交換色譜法來分離； 溶于非水溶性溶劑(如己烷、異辛烷、苯、甲苯等烴類)的試樣，可選用液-固吸附色譜法3溶于二氯甲烷或三氮申烷的試祥，選用常規(guī)的液-液色譜(正相色譜)法和吸附色譜法； 溶于甲醇等溶劑的試樣，則可以用反相液-液色譜法進(jìn)行分離與分析。,20,液 相 色 譜 分 析,主 要 液 相 色 譜 方 法 特 性,21,液 相

12、色 譜 分 析,次 要 液 相 色 譜 方 法 特 性,22,步 驟,準(zhǔn) 備,開 機(jī),清關(guān) 潔機(jī),分測 析試,23,LC-15C系統(tǒng)組成,本系統(tǒng)由LC-15C送液單元 CTO-15C柱溫箱 SPD-15C紫外可見雙波長檢測器 色譜數(shù)據(jù)工作站和電腦等組成，另外還包括打印機(jī)、不間斷電源等輔助設(shè)備。,LC-15C液相色譜儀,24,第一步 準(zhǔn) 備,1 、準(zhǔn)備所需的流動相，用合適的0.45m濾膜過濾，超聲脫氣20min。 2 、根據(jù)待檢樣品的需要更換合適的洗脫柱（注意方向）和定量環(huán)。 3、 配制樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液（也可在平衡系統(tǒng)時(shí)配制），用合適的0.45m濾膜過濾。（注意：濾膜有水性與有機(jī)兩種，選擇合適的）

13、 4 、檢查儀器各部件的電源線、數(shù)據(jù)線和輸液管道是否連接正。,25,第二步 開 機(jī),檢查儀器各部件。 打開儀器電源開關(guān)、泵和檢測器開關(guān)。 泵和檢測器自檢結(jié)束后，打開電腦顯示器、主機(jī)，最后打開色譜工作站,26,第三步 分析測試,（一）設(shè)置參數(shù) 1、 波長設(shè)定： 2 、流速設(shè)定： 3 、流動相比例設(shè)定： 4、 梯度設(shè)定：,27,（二）更換流動相并排氣泡,1： 將吸濾器放入裝有準(zhǔn)備好的流動相的儲液瓶中； 2 ：順時(shí)針轉(zhuǎn)動泵的排液閥180，打開排液閥； 3 ：運(yùn)行泵，泵以3ml/min的流速沖洗5min（可設(shè)定）后泵流速設(shè)為0ml/min； 4 ：將排液閥逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)適度擰緊，關(guān)閉排液閥。 5 ：如管路

14、中仍有氣泡，則重復(fù)以上操作直至氣泡排盡。,28,（三）平衡系統(tǒng),檢查各管路連接處是否漏液，如漏液應(yīng)予以排除。 觀察泵控制屏幕上的壓力值，壓力波動應(yīng)不超過1MPa。如超過則可初步判斷為柱前管路仍有氣泡，按檢查管路后再操作。用檢驗(yàn)方法規(guī)定的流動相沖洗系統(tǒng)，一般最少需6倍柱體積的流動相。 觀察基線變化。如果沖洗至基線漂移0.01mV/min，噪聲為0.001mV時(shí)，可認(rèn)為系統(tǒng)已達(dá)到平衡狀態(tài)，可以進(jìn)樣。,29,（四）進(jìn) 樣,1 、進(jìn)樣前按檢測器balance鍵調(diào)零，按軟件中 零點(diǎn)校正 按鈕校正基線零點(diǎn)，再按一下 查看基線 按鈕使其彈起。 2 、用試樣溶液清洗注射器，并排除氣泡后抽取適量即可進(jìn)樣了。 3

15、、測定的對照溶液和樣品供試溶液每份至少注樣2次 。,30,（五）譜圖的判斷及結(jié)果計(jì)算,1、系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)： 分離度：一般應(yīng)1.5。 重復(fù)性：兩次譜圖的峰面積應(yīng)相差不的過1%。 理論塔板數(shù)：應(yīng)規(guī)定的理論塔板數(shù)目。 拖尾因子：0.95T1.05 保留時(shí)間：對照與樣品的主成分保留時(shí)間應(yīng)大致一致。 RSD： 精密度3% 。 2、結(jié)果計(jì)算 外標(biāo)法 內(nèi)標(biāo)法,31,第四步 清洗管路及關(guān)機(jī),1、分析完畢后，先關(guān)檢測器，再用經(jīng)濾過和脫氣的適當(dāng)溶劑清洗色譜系統(tǒng)，正相柱一般用正已烷，反相柱如使用過含鹽流動相，則先用水（5%甲醇），然后用甲醇-水沖洗，各種沖洗劑一般沖洗1530分鐘，最后用甲醇保留色譜柱，特殊情況應(yīng)延

16、長沖洗時(shí)間。 2、 沖洗完畢后，逐步降低流速至0，關(guān)泵，進(jìn)樣器也應(yīng)用相應(yīng)溶劑沖洗，可使用進(jìn)樣閥所附專用沖洗接頭。 3 、關(guān)斷電源，作好使用登記，內(nèi)容包括日期、檢品、色譜柱、流動相、柱壓，使用小時(shí)數(shù)，儀器完好狀態(tài)等。,32,注意事項(xiàng),（一）流動相 由于高效液相色譜中流動相是液體，它對組分有親和力， 并參與固定相對組分的競爭。因此，正確選擇流動相直接影 響組分的分離度。對流動相溶劑的要求是： （1）溶劑對于待測樣品，必須具有合適的極性和良好的選 擇性。 （2）溶劑要與檢測器匹配。對于紫外吸收檢測器，應(yīng)注意 選用檢測器波長比溶劑的紫外截止波長要長。所謂溶劑的紫 外截止波長指當(dāng)小于截止波長的輻射通過溶

17、劑時(shí)，溶劑對此 輻射產(chǎn)生強(qiáng)烈吸收，此時(shí)溶劑被看作是光學(xué)不透明的，它嚴(yán) 重干擾組分的吸收測量。,33,常用流動相的紫外截止波長,34,注意事項(xiàng),（3） 高純度。由于高效液相靈敏度高，對流動相溶劑的純度也要求高。不純的溶劑會引起基線不穩(wěn)，或產(chǎn)生“偽峰” 痕量雜質(zhì)的存在，將使截止波長值增加50100nm。 （4）化學(xué)穩(wěn)定性好。不能選與樣品發(fā)生反應(yīng)或聚合的溶劑。 （5）低粘度。若使用高粘度溶劑，勢必增高壓力，不利于分離。常用的低粘度溶劑有丙酮、乙醇、乙晴等。但粘度過于低的溶劑也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它們易在色譜柱或檢測器內(nèi)形成氣泡，影響分離.,35,注意事項(xiàng),（二）色譜柱 1.流動相或溶劑的化學(xué)腐

18、蝕性不能太強(qiáng). 2.避免樣品微粒在柱頭沉積. 3.防止過高壓力沖擊色譜柱. 4.流動相pH大于7時(shí)要使用保護(hù)柱. 5.正確制備樣品,在樣品注射器前加裝針式過濾器. 6.色譜柱不用卸下前: a.必須洗去緩沖液. b.防止產(chǎn)生微生物 c.用大于10%的有機(jī)溶劑充滿整個色譜柱. d.柱卸下后用柱堵頭將色譜柱首尾密封.,36,必須做! 溶劑和水的前處理：過濾,設(shè)備和材料：溶劑過濾器、真空泵、0.45u或更 細(xì)的水性濾膜和有機(jī)濾膜 過濾的方法：用加了濾膜的溶劑過濾器和真空泵 抽濾 過濾的目的：除去溶劑中的微小顆粒，避免堵塞 色譜柱，尤其是使用無機(jī)鹽配制 的緩沖液。,37,必須做! 溶劑和水的前處理：脫氣,脫