DNA重組技術(shù)的基本過程.ppt

1、第一章 DNA重組技術(shù),討論4個(gè)問題： 1.什么是基因工程基因工程的概念。 2.為什么能進(jìn)行基因工程基因工程的原理和技術(shù)。（包括3大理論和3大技術(shù)準(zhǔn)備） 3.怎樣進(jìn)行基因工程3大步驟（DNA體外重組，重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞后擴(kuò)增和表達(dá)，基因工程后處理） 4.基因工程的應(yīng)用和前景對(duì)于醫(yī)學(xué)來(lái)說即生產(chǎn)基因工程產(chǎn)品、開展基因治療等。,第一節(jié) 概 述,一.現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)發(fā)展的特點(diǎn) （一）科學(xué)技術(shù)加速發(fā)展和急劇變革 1.當(dāng)代科學(xué)發(fā)展成指數(shù)增長(zhǎng)趨勢(shì)，全世界發(fā)表科技論文60008000/天，平均1篇/10.8秒問世。 2.人類科技知識(shí)在19世紀(jì)半衰期是50年，現(xiàn)在是35年（終身教育學(xué)習(xí)）。 3.1973年，Co

2、hen Group第一次實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌遺傳性狀的轉(zhuǎn)移terr+nersrterrner ，導(dǎo)致基因工程技術(shù)誕生，至今不到30年，人類已經(jīng)擁有了克隆羊、豬等等的技術(shù)，可以復(fù)制一個(gè)生命體。（克隆羊多利19972003，體細(xì)胞克隆，胚胎細(xì)胞克?。?Psclol,tetr,Rb-3,ner,sr,tetr,ner,tetr ner,O,tetr,ner,Cohen Group第一次實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌遺傳性狀轉(zhuǎn)移示意圖,一.現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)發(fā)展的特點(diǎn) (二)科學(xué)技術(shù)發(fā)展的綜合化 1.19世紀(jì)中葉，科學(xué)和技術(shù)是二者分離的，它們各有獨(dú)自文化傳統(tǒng)，它們的發(fā)展往往是脫節(jié)的。 2.科學(xué)回答“是什么”“為什么”，技術(shù)回答“做什么”

3、“怎么做”。當(dāng)今科技發(fā)展已經(jīng)密不可分，科學(xué)里包含技術(shù)，技術(shù)里體現(xiàn)科學(xué)。 3.當(dāng)代科技發(fā)展有兩種形式：一是突破，二是融合。突破是線性的，即從研究開發(fā)新一代的科技成果取代原有一代科技成果。融合是非線性的，即混合原有不同的科技領(lǐng)域，進(jìn)而發(fā)展新產(chǎn)品，造成革命性市場(chǎng)，它們是互補(bǔ)和合作的結(jié)果。,二基因工程的概念 （一）基因（gene）：從化學(xué)上來(lái)說，指的是一段DNA或RNA順序，該順序可以產(chǎn)生或影響某種表型（genotype，phenotype），可以由于突變生成等位基因變異體（體細(xì)胞父源和母源；正常和突變基因）；從遺傳學(xué)上來(lái)說，基因代表一個(gè)遺傳單位，一個(gè)功能單位，一個(gè)突變單位。 （二）基因工程（gene

4、tic engineering）：在體外通過人工剪、接，將不同來(lái)源的DNA分子組成一個(gè)雜合DNA分子(DNA分子重組體)，然后導(dǎo)入宿主細(xì)胞去復(fù)制擴(kuò)增或表達(dá)。因?yàn)橥ㄟ^人工設(shè)計(jì),得到一定的設(shè)計(jì)方案，故稱為基因工程。由于整個(gè)操作在分子水平上進(jìn)行，所以也稱分子克隆。,二基因工程的概念 1.“基因剪刀” ：剪取DNA的酶就像一把“基因剪刀”。 2.“縫紉針” ：連接不同來(lái)源DNA分子的酶就像一根“縫紉針”，使二者連在一起。 3.“交通工具”：使用載體好比一輛車子。 4.“乘客”：有用基因如IL2好比使乘客，車子把乘客送進(jìn)宿主細(xì)胞中去繁衍生息，生產(chǎn)我們需要的產(chǎn)品或開展基因治療（IL2/LAK抗癌）。,我們

5、應(yīng)該記住他們 1.第一個(gè)實(shí)現(xiàn)DNA重組的人Berg 1972年，Berg用E.coR切割SV40DNA和 phageDNA，經(jīng)過連接組成重組的DNA分子。Berg是第一個(gè)實(shí)現(xiàn)DNA重組的人。,Paul Berg,SV40, phage,我們應(yīng)該記住他們 2.第一個(gè)取得基因工程成功的人Cohen 1973年，Cohen Group將E. coli 的tetr質(zhì)粒psclol和nersrR6-3質(zhì)粒體外限制酶切割，連接成一個(gè)新的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化E. coli，在含四環(huán)素和新霉素的平板上篩選出了terrNer，實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌遺傳性狀的轉(zhuǎn)移。這是基因工程史上的第一個(gè)克隆化并取得成功的例子，這一年被定為基因工程誕

6、生的元年。,三基因工程克隆技術(shù)人類對(duì)自然的干預(yù) （一）“多利”羊的誕生,“多利”羊誕生的技術(shù)路線,維爾穆特和克隆羊“多利”在一起,克隆羊“多利”,（二）胚胎細(xì)胞克隆和體細(xì)胞克隆的比較 項(xiàng)目 胚胎細(xì)胞克隆 體 細(xì) 胞 克 隆 供體細(xì)胞 胚胎細(xì)胞（核） 體細(xì)胞（核） 受體細(xì)胞 去核未受精的卵細(xì)胞 去核未受精的卵細(xì)胞 發(fā)育場(chǎng)所 母體宮腔 母體宮腔 關(guān)鍵區(qū)別 克隆的是子代（多生了一個(gè)） 復(fù)制的是自己（復(fù)制了一個(gè)） （三）克隆技術(shù)是一把雙刃劍,三基因工程克隆技術(shù)人類對(duì)自然的干預(yù),用克隆技術(shù)復(fù)制人類的假想圖,四基因工程三大理論，三大技術(shù)準(zhǔn)備 （一）理論上的三大發(fā)現(xiàn) 1. 20世紀(jì)40年代，Avery發(fā)現(xiàn)了

7、生物遺傳物質(zhì)的化學(xué)本質(zhì)是DNA。超越時(shí)代的科學(xué)成就往往不易被人們接受，Avery當(dāng)時(shí)并未贏得陣陣掌聲，他的論文事隔10年以后才公開發(fā)表。 2. 20世紀(jì)50年代，Watson-crick提出了DNA結(jié)構(gòu)的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，搞清楚了生物遺傳物質(zhì)的分子機(jī)制。 3. 20世紀(jì)60年代，確定了遺傳信息的傳遞方式：DNARNAPr,破譯了全部遺傳密碼，43。,（二） 技術(shù)上的三大發(fā)明 1“基因剪刀”限制性內(nèi)切酶的發(fā)明 1970年，Smith和Wilcox在流感嗜血桿菌（Haemophilus inffuenzae）分離純化了Hind，取得了突破，打破了基因工程的禁錮，迎來(lái)了改造生物的春天，為基因工程奠定了

8、最為重要的技術(shù)基礎(chǔ)。 2載體(“交通工具車子”) 直到1973年Cohen才能將質(zhì)粒作為基因工程載體使用（至今一直是基因工程最重要最廣泛使用的載體）。這是基因工程的第二個(gè)技術(shù)準(zhǔn)備。,（二） 技術(shù)上的三大發(fā)明 3逆轉(zhuǎn)錄酶 1970年Baltimove和Temin等同時(shí)各自發(fā)現(xiàn)了逆轉(zhuǎn)錄酶，打破了遺傳學(xué)（生物學(xué)）中心法則，使真核基因的制備成為可能。 真核基因組龐大而復(fù)雜，不易制得基因圖譜。即使有了基因圖譜，因?yàn)檎婧嘶蛴袃?nèi)含子，不能在原核表達(dá)系統(tǒng)剪接出mRNA，沒有成熟的mRNA就不能得到相應(yīng)得產(chǎn)物。經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄mRNAcDNA (complementory DNA)文庫(kù)要比基因組文庫(kù)小得多，所以篩選

9、陽(yáng)性克隆就方便得多。,以上理論和技術(shù)的武裝，基因工程的臨盆降生指日可待，Berg和Cohen兩位科學(xué)的“助產(chǎn)士”，把基因工程接到了人間。,五與基因工程相關(guān)的概念 （一）克隆（clone,cloning） 1.原意是指單細(xì)胞純系無(wú)性繁殖。 2.現(xiàn)代概念是將實(shí)驗(yàn)得到的人們所需的微量基因結(jié)構(gòu)，引入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中去。在合適的生理環(huán)境中進(jìn)行無(wú)性繁殖，從而利用宿主的生理機(jī)制繁衍人們所需要的基因結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行表達(dá)。由于整個(gè)操作在分子水平上進(jìn)行，所以稱為分子克?。╩olecular cloning）。,五與基因工程相關(guān)的概念 （一）克隆（clone,cloning） 3. 這個(gè)術(shù)語(yǔ)的幾種含義： （1）作為名詞

10、 帶有相同插入順序的重組DNA分子的1個(gè)群體。 基因型（genetype）相同的細(xì)胞或生物體的一個(gè)群體。 最常用的是描述一個(gè)微生物的一個(gè)菌落，這些微生物帶有插入了特定DNA片斷的載體分子。 （2）作為動(dòng)詞，是“去克隆”，即利用體外DNA重組技術(shù)將一個(gè)特定的基因或DNA順序插入一個(gè)載體分子。,（二）重組DNA技術(shù)(DNA recombination technique) 重組DNA技術(shù)是用酶學(xué)的方法將不同來(lái)源的DNA在體外切割，連接組成一個(gè)雜合的DNA分子的技術(shù)?；蚬こ贪―NA重組技術(shù)。 （三）生物工程（Biologic engineering） 生物工程是更大范圍內(nèi)生產(chǎn)及產(chǎn)品的工程技術(shù)，是

11、現(xiàn)代生物學(xué)中一切工程技術(shù)的總稱，包括： 1.遺傳工程：基因工程，物理化學(xué)誘變；細(xì)胞融合；花粉培育；有性雜交等。 2發(fā)酵工程 3酶學(xué)工程 4細(xì)胞工程,第二節(jié) 基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ),Enzymes,常用的工具酶（tool enzymes）： 1.限制性核酸內(nèi)切酶（resriction enzymes,restriction endonadease) 2.DNA連接酶（DNA ligase,ligase) 3.逆轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase) 4.DNA聚合酶(DNA polymerase,DNA pol) 5.核酸酶(nuclease) 6.末端轉(zhuǎn)移酶(terminal tra

12、nsferase) 7.堿性磷酸酶(BAP或CIP) 以1和2最為常用，最為重要。工具酶現(xiàn)已商品化。,第二節(jié) 基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ),1.限制性核酸內(nèi)切酶（Restriction endonuclease） 限制性核酸內(nèi)切酶是一類能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列（48bp），并由此處切割DNA雙鏈的核酸內(nèi)切酶。來(lái)源于原核生物，屬于核酸內(nèi)切酶，即在核酸分子鏈的內(nèi)部制造切口的酶。 1.1限制與修飾現(xiàn)象 細(xì)菌的限制和修飾系統(tǒng)（R/M體系），是細(xì)菌的一種自我保護(hù)作用。,第二節(jié) 基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ),限制性內(nèi)切酶將侵入細(xì)菌體內(nèi)的外源DNA切成小片斷,（1）限制（Restriction）,細(xì)菌自身的

13、DNA堿基被甲基化酶甲基化修飾所保護(hù)，不能被自身的限制性內(nèi)切酶識(shí)別切割。 Dam甲基化酶： GATC 腺嘌呤N6位置引入甲基 Dcm甲基化酶： CCAGG或CCTGG序列在第二個(gè)C上C5位置上引入甲基,（2）修飾（Modification）,1.2限制性內(nèi)切酶的類型,I型限制性內(nèi)切酶 首先由M. Meselson和R. Yuan在1968年從大腸桿菌 B株和 K株分離的，如 EcoB和 EcoK。 （1）識(shí)別位點(diǎn)序列：未甲基化修飾的特異序列。,EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC,I 型限制性內(nèi)切酶 II 類限制性內(nèi)切酶 III類限制性內(nèi)切酶,第二節(jié) 基因工程的

14、酶學(xué)基礎(chǔ),（3）作用機(jī)理：需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。,（2）切割位點(diǎn)：在距離特異性識(shí)別位點(diǎn)約10001500 bp處隨機(jī)切開一條單鏈。,Recognize site,cut,1-1.5kb,第二節(jié) 基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ),II類限制性內(nèi)切酶 首先由H.O. Smith和K.W. Wilcox在1970年從流感嗜血菌中分離出來(lái)。分離的第一個(gè)酶是Hind 。 （1）識(shí)別位點(diǎn)序列：未甲基化修飾的雙鏈DNA上的特殊靶序列（多數(shù)是回文序列），與DNA的來(lái)源無(wú)關(guān)。 （2）切割位點(diǎn)：識(shí)別位點(diǎn)處。切開雙鏈DNA，形成粘性末端（sticky end）或平末端（blunt end）。,第二節(jié) 基因

15、工程的酶學(xué)基礎(chǔ),（3）粘性末端：含有幾個(gè)核苷酸單鏈的末端。,GAATTC,CTTAA G,G AATTC,CTTAAG,5-,-3,3-,-5,5-,-3,3-,-5,5端凸出（如EcoR I切點(diǎn)）,第二節(jié) 基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ),CTGCAG,3端凸出（如Pst I切點(diǎn)）,GACGTC,5-,-3,3-,-5,5-,-3,3-,-5,CTGCA G,G ACGTC,第二節(jié) 基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ),（4）粘性末端的意義 連接便利 i）不同的DNA雙鏈：只要粘性末端堿基互補(bǔ)就可以連接，這比連接兩個(gè)平齊末端容易的多。 ii）同一個(gè)DNA分子內(nèi)連接：通過兩個(gè)相同的粘性末端可以連接成環(huán)形分子。 5末端標(biāo)記：凸

16、出的5末端可用DNA多核苷酸激酶進(jìn)行32P標(biāo)記。 凸出的3端可以通過末端轉(zhuǎn)移酶添加幾個(gè)多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。 補(bǔ)平成平齊末端：粘性末端可以用DNA聚合酶補(bǔ)平成平齊末端。,第二節(jié) 基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ),（5）同裂酶（Isoschizomers)：識(shí)別位點(diǎn)的序列相同的限制性內(nèi)切酶。 完全同裂酶：識(shí)別位點(diǎn)和切點(diǎn)完全相同。如Hind 和Hsu I。,Hind 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-5 Hsu I 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-5, 不完全同裂酶：識(shí)別位點(diǎn)相同，但切點(diǎn)不同。如Xma I 和 Sma I。,第二節(jié) 基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ),（6）同尾酶

17、(Isocaudamers）：識(shí)別的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamH I、Bgl 、Bcl I、Xho 等。,5-GGATCC-3 3-CCTAGG-5,BamH I,Bcl I,5-TGATCA-3 3-ACTAGT-5,5-AGATCT-3 3-TCTAGA-5,Bgl ,5-UGATCY-3 3-YCTAGU-5,Xho ,U代表嘌呤；Y代表嘧啶。,第二節(jié) 基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ),5-GATC-3 3-CTAG-5,Sau 3A,同尾酶的粘性末端互相結(jié)合后形成的新位點(diǎn)一般不能再被原來(lái)的酶識(shí)別。,？,5-G 3-CCTAG,GATCT-3 A-5,BamH I,Bgl ,5-GGA

18、TCT-3 3-CCTAGA-5,BamH I,Bgl ,Sau 3A,（7）限制酶的酶活性：限制性內(nèi)切酶的識(shí)別和酶切活性一般在一定的溫度、離子強(qiáng)度、pH等條件下才表現(xiàn)最佳切割能力和位點(diǎn)的專一性。因此，一般使用專一的反應(yīng)緩沖液。,星號(hào)（*）活性：如果改變反應(yīng)條件就會(huì)影響酶的專一性和切割效率，稱為星號(hào)（*）活性。 EcoR I和BamH I等都有*活性。,第二節(jié) 基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ),在低鹽、高pH（8）時(shí)可識(shí)別和切割,GAATTA、AAATTC、GAGTTC等,EcoR I： GAATTC,（8）s型限制性內(nèi)切酶 移動(dòng)切割（shifted cleavage)：在離它的不對(duì)稱識(shí)別位點(diǎn)一側(cè)的特定距離

19、處切割DNA雙鏈。長(zhǎng)度為 4-7bp ，切割位點(diǎn)可能在識(shí)別位點(diǎn)一側(cè)的 20bp 范圍內(nèi)。,GACGCNNNNN,Hga I,CTGCGNNNNNNNNNN,5,3,第二節(jié) 基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ),1.3 III類限制性內(nèi)切酶 在完全肯定的位點(diǎn)切割DNA，但反應(yīng)需要ATP、 Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。它們的識(shí)別位點(diǎn)分別是 AGACC 和 CAGCAG ，切割位點(diǎn)則在下游 24-26bp 處。在基因工程操作中用途不大。,EcoP1: AGACC,EcoP15: CAGCAG,第二節(jié) 基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ),2. DNA連接酶 2.1 DNA連接酶（ligase)的發(fā)現(xiàn) 從細(xì)菌DNA環(huán)化現(xiàn)象推測(cè)，

20、必定存在一種能把兩條DNA雙鏈連接到一起的酶。,DNA復(fù)制一定有斷口，斷口一定由酶連接,第二節(jié) 基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ),2.2 DNA ligase的特點(diǎn) 兩種DNA連接酶（1）大腸桿菌連接酶：只能連接粘性末端。 （2）T4噬菌體的連接酶：不但能連接粘性末端，還能連接平末端。 連接條件（1）必須是兩條雙鏈DNA。 （2）DNA3端有游離的-OH， 5端有一個(gè)磷酸基團(tuán)（P）。（3）需要能量 動(dòng)物或噬菌體中：ATP 大腸桿菌中： NAD+,第二節(jié) 基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ),3. DNA聚合酶 3.1 基因工程中常用的DNA聚合酶 大腸桿菌DNA聚合酶 Klenow fragment T7 DNA聚合酶 T4

21、 DNA聚合酶 修飾過的T7 DNA聚合酶 逆轉(zhuǎn)錄酶,第二節(jié) 基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ),3.2常用的DNA聚合酶的特點(diǎn) 共同特點(diǎn) 把dNTPs連續(xù)地加到引物的3OH端。 主要區(qū)別 持續(xù)合成能力和外切酶活性不同。 T7 DNA聚合酶可以連續(xù)添加數(shù)千個(gè)dNTPs而不從模板上掉下來(lái)。 其它幾種DNA聚合酶只能連續(xù)添加10多個(gè)dNTPs就會(huì)從模板上解離下來(lái)。,第二節(jié) 基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ),常用DNA聚合酶的特性比較,第三節(jié) 載 體 一、載體的概念 1.要把一個(gè)有用的基因（目的基因研究或應(yīng)用基因）通過基因工程手段送到生物細(xì)胞（受體細(xì)胞），需要運(yùn)載工具（交通工具）攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞，這種運(yùn)載工具就叫做載體（

22、vector）。 2.凡來(lái)源于質(zhì)?；蚴删w的DNA分子，可以插入或克隆DNA片段統(tǒng)稱為vector。 3.基因工程所用的vector實(shí)際上是DNA分子，是用來(lái)攜帶目的基因片段進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA,二、載體的分類,說 明： 1.穿梭載體（sbuttle vector）： 指在兩種宿主生物體內(nèi)復(fù)制的載體分子，因而可以運(yùn)載目的基因（穿梭往返兩種生物之間，如：YEP，DIDB219 2.YAC：Yeast Artificial Chromsome 由酵母基因和PBR322質(zhì)粒衍生物構(gòu)成，對(duì)克隆大的真核基因十分有用，在HGP中發(fā)揮主要作用。 3.BAC ：細(xì)菌人工染色體。,三、基因工程載體的特點(diǎn) （一）

23、能獨(dú)立自主的復(fù)制 載體DNA分子中有一段不影響它們擴(kuò)增的非必需區(qū)域，如MCS，插在其中的外源DNA片段，能被動(dòng)的跟著載體一起復(fù)制/擴(kuò)增，就像載體的正常成分一樣。 （二）能便利的加以檢測(cè) 如載體的藥物抗性基因，多是抗生素抗性基因，將受體細(xì)胞放在含有該抗生素培養(yǎng)板上培養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)，只有攜帶這些抗性基因的載體分子的受體細(xì)胞才能存活。 （三）容易進(jìn)入宿主細(xì)胞中去，也易從宿主細(xì)胞中分離純化出來(lái)。,四、克隆載體和表達(dá)載體 所有的載體可以分成兩大類：克隆載體和表達(dá)載體。其中最常用的是質(zhì)粒載體。 （一）概念 1.克隆載體（cloning vector） 都有一個(gè)松弛的復(fù)制子，能帶動(dòng)外源基因，在宿主細(xì)胞中復(fù)制擴(kuò)增。

24、它是用來(lái)克隆和擴(kuò)增DNA片段（基因）的載體。 2.表達(dá)載體（Expression vector） 具有克隆載體的基本元件（ori，Ampr，MCS等）還具有轉(zhuǎn)錄/翻譯所必需的DNA順序的載體。為了有效的轉(zhuǎn)錄，必需有強(qiáng)大的能夠被宿主細(xì)胞識(shí)別的啟動(dòng)子，為了實(shí)現(xiàn)翻譯，克隆基因必需有合適的SD序列和RBS。這樣一個(gè)基因表達(dá)需要的具有表達(dá)和調(diào)控能力的載體稱表達(dá)載體。,（二）載體的元件及性質(zhì),（三）元件的類別和質(zhì)量 基因工程前考慮的4個(gè)問題： (1)基因工程的目的 克隆擴(kuò)增/表達(dá):生產(chǎn)產(chǎn)品 基因治療 (2)載體的容量 克隆片段的大小運(yùn)載多大重量的車子。 (3)受體細(xì)胞類型 真核/原核/穿梭。 (4)載體本

25、身及其元件的質(zhì)量 不能搞成“豆腐渣工程”，如P要“強(qiáng)大陣容”。,第四節(jié) 重組DNA技術(shù)的基本過程,基因工程包括3個(gè)步驟： 1 DNA重組 2 重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞克隆擴(kuò)增或表達(dá) 3 基因工程的后處理（downstream techniques of GE） 重組DNA技術(shù)的基本過程： 1 載體的選擇和制備分； 2 制備目的基因片段切； 3 DNA片段的重組連接接； 4 重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞轉(zhuǎn)； 5 轉(zhuǎn)化子的篩選篩； 6 重組子的篩選篩； 7 重組子的鑒定鑒； 8 克隆擴(kuò)增或表達(dá)擴(kuò)/表達(dá)； 9 基因工程的后處理分。,DNA重組技術(shù),DNA連接酶能把不同的DNA片段連接成一個(gè)整體,Pvu,DN

26、A重組操作過程示意圖,一、基因工程載體及其選用/制備/獲取/構(gòu)建 （一）載體的選擇 1.構(gòu)建DNA重組體的目的 2.載體的類型 3.選用質(zhì)粒載體的要求： 選分子量小的質(zhì)粒，即小載體不易損壞，在細(xì)菌里面拷貝數(shù)也多（也有大載體）； 一般使用松弛型質(zhì)粒在細(xì)菌里擴(kuò)增不受約束，一般10個(gè)以上的拷貝，而嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒10個(gè)。 必需具備一個(gè)以上的酶切位點(diǎn)，有選擇的余地； 必需有易檢測(cè)的標(biāo)記，多是抗生素的抗性基因。 （二）載體的制備 （三）載體的獲取,二、目的基因的制備和獲取 目的基因是所要研究或應(yīng)用的基因，也就是將要克隆或表達(dá)的基因或基因的一個(gè)片段。獲取目的基因是分子克隆中最重要的一步。 （一）目的基因制備的目

27、的 1. 克隆特定的基因或cDNA； 2. 構(gòu)建克隆或表達(dá)載體； 3. 構(gòu)建基因文庫(kù)：基因組DNA文庫(kù)和cDNA文庫(kù),第四節(jié) 重組DNA技術(shù)的基本過程,（二）目的基因常用的制備方法 1.限制酶切除 （1）從原核基因組DNA制備視基因組物理圖譜已知或未知，克隆方法不同。 （2）從真核基因組DNA制備染色體步移法（chromosome walking）。 （3）從已克隆的DNA片段制備直接酶切回收 2. PCR或RT/PCR方法制備目的基因 （1） 獲取已知基因 （2） 構(gòu)建RT/PCR文庫(kù)法獲取未知基因 3.計(jì)算機(jī)克?。杭蠢肎enBank信息，利用不同種屬同源性設(shè)計(jì)引物，嘗試獲取未知基因片段，這有賴于各種計(jì)算機(jī)軟件的應(yīng)用。 4.化學(xué)合成法：制備基因片段用DNA合成儀，對(duì)目的基因分段合成，連接，可以得到所需的目的基因。,三、DNA片斷的重組連接 目的基因和載體DNA是重組的基本構(gòu)件，DNA片斷的重組連接是目的基因與載體的連接。 獲得目的基因后必須將其放在一定的載體上才能進(jìn)入宿主細(xì)胞擴(kuò)增或表達(dá)。習(xí)慣上將目的基因與載體連接及其后續(xù)的轉(zhuǎn)化過程稱為克隆，可能是目的基因載體形成一個(gè)新的DNA重組分子（新的genotype），后者必然會(huì)產(chǎn)生一個(gè)新的菌體克?。╬henotype）。 限制酶剪切或機(jī)械剪切