發(fā)酵工藝原理第六章.ppt

1、1,第六章,生產(chǎn)菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)與保藏,2,定 義,種子擴(kuò)大培養(yǎng)：是指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處于休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，在經(jīng)過扁瓶或搖瓶及種子罐逐級放大培養(yǎng)而獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過程。這些純種培養(yǎng)物稱為種子。,3,作為種子的準(zhǔn)則,菌種細(xì)胞的生長活力強，移種至發(fā)酵罐后能迅速生長，遲緩期短； 生理形狀穩(wěn)定； 菌體總量及濃度能滿足大容量發(fā)酵罐的要求； 無雜菌污染； 保持穩(wěn)定的生產(chǎn)能力。,4,本章講述的內(nèi)容,第一節(jié) 種子的制備過程 第二節(jié) 種子質(zhì)量的控制 第三節(jié) 實例 第四節(jié) 菌種的保藏與復(fù)壯,5,第一節(jié) 種子的制備過程,種子制備的過程大致可分為： 實驗室種子制備階段 生產(chǎn)車間種

2、子制備階段,6,一、實驗室種子的制備,實驗室種子的制備一般采用兩種方式 對于產(chǎn)孢子能力強的及孢子發(fā)芽、生長繁殖快的菌種可以采用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)孢子，孢子可直接作為種子罐的種子，這樣操作簡便，不易污染雜菌。 對于產(chǎn)孢子能力不強或孢子發(fā)芽慢的菌種，可以用液體培養(yǎng)法。,7,（一）孢子的制備,1，細(xì)菌孢子的制備 細(xì)菌的斜面培養(yǎng)基多采用碳源限量而氮源豐富的配方。 培養(yǎng)溫度一般為37C。 細(xì)菌菌體培養(yǎng)時間一般為12天，產(chǎn)芽孢的細(xì)菌培養(yǎng)則需要510天。,8,2，霉菌孢子的制備 霉菌孢子的培養(yǎng)一般以大米、小米、玉米、麩皮、麥粒等天然農(nóng)產(chǎn)品為培養(yǎng)基。 培養(yǎng)的溫度一般為2528C。 培養(yǎng)時間一般為414天。,9,3

3、，放線菌孢子的制備 放線菌的孢子培養(yǎng)一般采用瓊脂斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含有一些適合產(chǎn)孢子的營養(yǎng)成分，如麩皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些無機(jī)鹽等。 培養(yǎng)溫度一般為28C。 培養(yǎng)時間為514天。,10,（二）液體種子制備,1，好氧培養(yǎng)： 對于產(chǎn)孢子能力不強或孢子發(fā)芽慢的菌種，如產(chǎn)鏈霉素的灰色鏈霉菌（S. griseus）、產(chǎn)卡那霉素的卡那鏈霉菌（S. Kanamuceticus）可以用搖瓶液體培養(yǎng)法。將孢子接入含液體培養(yǎng)基的搖瓶中，于搖瓶機(jī)上恒溫振蕩培養(yǎng)，獲得菌絲體，作為種子。 試管三角瓶搖床種子罐,11,2，厭氧培養(yǎng)：對于酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒等） 試管三角瓶卡式罐種子罐,12,二、生產(chǎn)車間種子制

4、備,實驗室制備的孢子或液體種子移種至種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)，種子罐的培養(yǎng)基雖因不同菌種而異，但其原則為采用易被菌利用的成分如葡萄糖、玉米漿、磷酸鹽等，如果是需氧菌，同時還需供給足夠的無菌空氣，并不斷攪拌，使菌（絲）體在培養(yǎng)液中均勻分布，獲得相同的培養(yǎng)條件。,13,1，種子罐的作用： 主要是使孢子發(fā)芽，生長繁殖成菌（絲）體，接入發(fā)酵罐能迅速生長，達(dá)到一定的菌體量，以利于產(chǎn)物的合成。,14,2，種子罐級數(shù)的確定 種子罐級數(shù)：是指制備種子需逐級擴(kuò)大培養(yǎng)的次數(shù)，取決于： 菌種生長特性、孢子發(fā)芽及菌體繁殖速度； 所采用發(fā)酵罐的容積,15,細(xì)菌：生長快，種子用量比例少，級數(shù)也較少，二級發(fā)酵。 茄子瓶種子罐發(fā)酵罐

5、霉菌：生長較慢，如青霉菌，三級發(fā)酵 孢子懸浮液一級種子罐（27C,40小時孢子發(fā)芽，產(chǎn)生菌絲 ）二級種子罐（ 27C,1024小時，菌體迅速繁殖，粗壯菌絲體）發(fā)酵罐 放線菌：生長更慢，采用四級發(fā)酵 酵母：比細(xì)菌慢，比霉菌，放線菌快，通常用一級種子,16,確定種子罐級數(shù)需注意的問題 種子級數(shù)越少越好，可簡化工藝和控制，減少染菌機(jī)會 種子級數(shù)太少，接種量小，發(fā)酵時間延長，降低發(fā)酵罐的生產(chǎn)率，增加染菌機(jī)會 雖然種子罐級數(shù)隨產(chǎn)物的品種及生產(chǎn)規(guī)模而定。但也與所選用工藝條件有關(guān)。如改變種子罐的培養(yǎng)條件，加速了孢子發(fā)芽及菌體的繁殖，也可相應(yīng)地減少種子罐的級數(shù)。,17,第二節(jié) 種子質(zhì)量的控制,一、影響孢子質(zhì)量

6、的因素及控制 培養(yǎng)基 培養(yǎng)條件 培養(yǎng)時間和冷藏時間,18,1，培養(yǎng)基,生產(chǎn)過程中經(jīng)常出現(xiàn)種子質(zhì)量不穩(wěn)定的現(xiàn)象，其主要原因是原材料質(zhì)量波動。 例如在四環(huán)素、土霉素生產(chǎn)中，配制產(chǎn)孢子斜面培養(yǎng)基用的麩皮，因小麥產(chǎn)地、品種、加工方法及用量的不同對孢子質(zhì)量的影響也不同。 蛋白胨加工原料不同如魚胨或骨胨對孢子影響也不同。 原材料質(zhì)量的波動，起它要作用的是其中無機(jī)離子含量不同，如微量元素Mg2+ 、Cu2+ 、Ba2+能刺激孢子的形成。磷含量太多或太少也會影響孢子的質(zhì)量。,19,水質(zhì)的影響：地區(qū)不同、季節(jié)變化和水源污染，均可造成水質(zhì)波動，影響種子質(zhì)量。 菌種在固體培養(yǎng)基上可呈現(xiàn)多種不同代謝類型的菌落，氮源品

7、種越多，出現(xiàn)的菌落類型也越多，不利于生產(chǎn)的穩(wěn)定。,20,措施 培養(yǎng)基所用原料要經(jīng)過發(fā)酵試驗合格才可使用 嚴(yán)格控制滅菌后培養(yǎng)基的質(zhì)量 斜面培養(yǎng)基使用前，需在適當(dāng)溫度下放置一定時間 供生產(chǎn)用的孢子培養(yǎng)基要用比較單一的氮源，作為選種或分離用的培養(yǎng)基則采用較復(fù)雜的有機(jī)氮源,21,2，培養(yǎng)條件,（1）溫度 溫度對多數(shù)品種斜面孢子質(zhì)量有顯著的影響。如土霉素生產(chǎn)菌種在高于37C培養(yǎng)時，孢子接入發(fā)酵罐后出現(xiàn)糖代謝變慢，氨基氮回升提前，菌絲過早自溶，效價降低等現(xiàn)象。一般各生產(chǎn)單位都嚴(yán)格控制孢子子斜面的培養(yǎng)溫度。,22,（2）濕度 制備斜面孢子培養(yǎng)基的濕度對孢子的數(shù)量和質(zhì)量有較大的影響。例如土霉素生產(chǎn)菌種龜裂鏈霉

8、菌，孢子制備時發(fā)現(xiàn)：在北方氣候干燥地區(qū)孢子斜面長得較快，在含有少量水分的試管斜面培養(yǎng)基下部孢子長得較好，而斜面上部由于水分迅速蒸發(fā)呈干疤狀，孢子稀少。在氣溫高含濕度大的地區(qū)，斜面孢子長得慢，主要由于試管下部冷凝水多而不利于孢子的形成。從表中看出相對濕度在40%45%時孢子數(shù)量最多，且孢子顏色均勻，質(zhì)量較好。,不同相對濕度對龜裂鏈霉菌斜面生長的影響,23,3，培養(yǎng)時間和冷藏時間,（1）培養(yǎng)時間 一般來說，衰老的孢子不如年輕的孢子，因為衰老的孢子已在逐步進(jìn)入發(fā)芽階段，核物質(zhì)趨于分化狀態(tài)。過于衰老的孢子會導(dǎo)致生產(chǎn)能力的下降。 措施：孢子培養(yǎng)的時間應(yīng)該控制在孢子量多、孢子成熟、發(fā)酵產(chǎn)量正常的階段終止培

9、養(yǎng)。,24,（2）冷藏時間 斜面冷藏對孢子質(zhì)量的影響與孢子成熟程度有關(guān)。如土霉素生產(chǎn)菌種孢子斜面培養(yǎng)4天左右即于4C冰箱保存，發(fā)現(xiàn)冷藏78天菌體細(xì)胞開始自溶。而培養(yǎng)5天以后冷藏，20天未發(fā)現(xiàn)自溶。 冷藏時間對孢子的生產(chǎn)能力也有影響。例如在鏈霉素生產(chǎn)中，斜面孢子在6 C冷藏兩個月后的發(fā)酵單位比冷藏一個月降低18%，冷藏3個月后降低35%。,25,4，接種量 接種量大小影響到培養(yǎng)基中孢子的數(shù)量，進(jìn)而影響菌體的生理狀況。,26,二、影響種子質(zhì)量的因素及控制,孢子的質(zhì)量 培養(yǎng)基 培養(yǎng)條件 種齡 接種量,27,1，培養(yǎng)基 營養(yǎng)成分適合種子培養(yǎng)的需要 選擇有利于孢子發(fā)芽和菌體生長的培養(yǎng)基； 營養(yǎng)上要易于被

10、菌體直接吸收和利用； 營養(yǎng)成分要適當(dāng)豐富和完全，氮源和維生素含量要高 營養(yǎng)成分要盡可能與發(fā)酵培養(yǎng)基相近。,28,2，培養(yǎng)條件 （1）溫度 （2）通氣量 在種子罐中培養(yǎng)的種子除保證供給易被利用的培養(yǎng)基外，有足夠的通氣量可以提高種子質(zhì)量。例如，青霉素的生產(chǎn)菌種在制備過程中將通氣充足和不足兩種情況下得到的種子分別接入發(fā)酵罐內(nèi)，它們的發(fā)酵單位可相差1倍。但也有例外，例如土霉素生產(chǎn)菌，一級種子罐的通氣量小對發(fā)酵有利。,29,3，種齡 種齡：是指種子罐中培養(yǎng)的菌絲體開始移入下一級種子罐或發(fā)酵罐時的培養(yǎng)時間。 通常種齡是以處于生命力極旺盛的對數(shù)生長期，菌體量還未達(dá)到最大值時的培養(yǎng)時間較為合適。時間太長，菌種

11、趨于老化，生產(chǎn)能力下降，菌體自溶；種齡太短，造成發(fā)酵前期生長緩慢。 不同菌種或同一菌種工藝條件不同，種齡是不一樣的，一般需經(jīng)過多種實驗來確定。嗜堿性芽孢桿菌生產(chǎn)堿性蛋白酶，12小時最好。,30,4，接種量 接種量：是指移入的種子液體積和接種后培養(yǎng)液體積的比例。 接種量的大小決定于生產(chǎn)菌種在發(fā)酵罐中生長繁殖的速度，采用較大的接種量可以縮短發(fā)酵罐中菌絲繁殖達(dá)到高峰的時間，使產(chǎn)物的形成提前到來，并可減少雜菌的生長機(jī)會。但接種量過大或者過小，均會影響發(fā)酵。過大會引起溶氧不足，影響產(chǎn)物合成；而且會過多移入代謝廢物，也不經(jīng)濟(jì)；過小會延長培養(yǎng)時間，降低發(fā)酵罐的生產(chǎn)率。 通常接種量，細(xì)菌15%，酵母菌510%

12、，霉菌715%，有時2025%,31,三、種子質(zhì)量的控制措施,種子質(zhì)量的最終指標(biāo)是考察其在發(fā)酵罐中所表現(xiàn)出來的生產(chǎn)能力。因此首先必須保證生產(chǎn)菌種的穩(wěn)定性，其次是提供種子培養(yǎng)的適宜環(huán)境保證無雜菌侵入，以獲得優(yōu)良種子。 菌種穩(wěn)定性的檢查 無（雜菌）檢查,32,四、種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),1，細(xì)胞或菌體 菌絲形態(tài)、菌絲濃度和培養(yǎng)液外觀（色素、顆粒等） 單細(xì)胞：菌體健壯、菌形一致、均勻整齊，有的還要求有一定的排列或形態(tài)； 霉菌、放線菌：菌絲粗壯、對某些染料著色力強、生長旺盛、菌絲分枝情況和內(nèi)含物情況好。,33,2，生化指標(biāo) 種子液的糖、氮、磷的含量和pH變化。,34,3，產(chǎn)物生成量 在抗生素發(fā)酵中，產(chǎn)物生成量是

13、考察種子質(zhì)量的重要指標(biāo)，因為種子液中產(chǎn)物生成量的多少間接反映種子的生產(chǎn)能力和成熟程度。,35,4，酶活力 種子液中某種酶的活力，與目的產(chǎn)物的產(chǎn)量有一定的關(guān)聯(lián)。,36,第三節(jié) 實例,一、谷氨酸發(fā)酵的菌種擴(kuò)大培養(yǎng) 斜面菌種一級種子培養(yǎng)二級種子培養(yǎng)發(fā)酵罐 1，斜面菌種的培養(yǎng) 菌種的斜面培養(yǎng)必須有利于菌種生長而不產(chǎn)酸，并要求斜面菌種絕對純，不得混有任何雜菌和噬菌體，培養(yǎng)條件應(yīng)有利于菌種繁殖，培養(yǎng)基以多含有機(jī)氮而不含或少含糖為原則。 (1) 斜面培養(yǎng)基組成 葡萄糖 0.1 蛋白陳 1.0 牛肉膏 1.0 氯化鈉 0.5 瓊脂 2.02.5 PH 7.07.2 （傳代和保藏斜面不加葡萄糖） (2) 培養(yǎng)條

14、件：3334，培養(yǎng)1824h,37,2， 一級種子培養(yǎng) 一級種子培養(yǎng)的目的在于大量繁殖活力強的菌體，培養(yǎng)基組成應(yīng)以少含糖分，多含有機(jī)氮為主，培養(yǎng)條件從有利于長菌考慮。 (1) 培養(yǎng)基組成 葡萄糖 2.5 尿素 0.5 硫酸鎂 0.04 磷酸氫二鉀 0.1 玉米漿 2.53.5(按質(zhì)增減) 硫酸亞鐵、硫酸錳 各2ppm pH 7.0,38,(2) 培養(yǎng)條件 用1000mL三角瓶裝入培養(yǎng)基200mI，滅菌后置于沖程76cm、頻率96次min的往復(fù)式搖床上振蕩培養(yǎng)12h，培養(yǎng)溫度3334 (3) 一級種子質(zhì)量要求 種齡：12h pH值：6.4 0.1 光密度：凈增OD值0.5以上 殘?zhí)牵?.5以下

15、無菌檢查：(-) 噬菌體檢查： (-) 鏡檢：菌體生長均勻、粗壯，排列整齊 革蘭氏陽性反應(yīng)。,39,3， 二級種子培養(yǎng) 為了獲得發(fā)酵所需要的足夠數(shù)量的菌體，在一級種子培養(yǎng)的基礎(chǔ)上進(jìn)而擴(kuò)大到種子罐的二級種子培養(yǎng)。種子罐容積大小取決于發(fā)酵罐大小和種量比例。 (1) 培養(yǎng)基組成,40,(2)培養(yǎng)條件 接種量：0.81.0 培養(yǎng)溫度：3234 培養(yǎng)時間：78h 通風(fēng)量 50L種子罐1:0.5 攪拌轉(zhuǎn)速340rmin； 250L種子罐1:0.3 攪拌轉(zhuǎn)速300r min 500L種子罐1:0.25 攪拌轉(zhuǎn)速230r min,41,(3)二級種子的質(zhì)量要求 種齡 78h pH 7.2左右 OD值 凈增0.

16、5左右 無菌檢查 (-) 噬菌體檢查(-),42,二、啤酒酵母的擴(kuò)大培養(yǎng),一般可采用三級擴(kuò)大培養(yǎng)，擴(kuò)大倍數(shù)：第1級到第2級為8-10倍，第2級到第3級為4-6倍。 1，實驗室擴(kuò)大培養(yǎng),43,2，車間擴(kuò)大培養(yǎng),44,第四節(jié) 菌種的保藏與復(fù)壯,一、菌種保藏的意義 菌種是從事微生物學(xué)以及生命科學(xué)研究的基本材料，特別是利用微生物進(jìn)行有關(guān)生產(chǎn)如抗生素、氨基酸、釀造等工業(yè)，更離不開菌種。所以菌種保藏是進(jìn)行微生物學(xué)研究和微生物育種工作的重要組成部分。其任務(wù)首先是使菌種不致死亡，同時還要盡可能設(shè)法把菌種的優(yōu)良特性保持下來而不致向壞的方面轉(zhuǎn)化。,45,二、菌種保藏的原理 菌種保藏主要是根據(jù)菌種的生理生化特點人工創(chuàng)造條件使孢子或菌體的生長代謝活動盡量降低，以減少其變異。一般可通過保持培養(yǎng)基營養(yǎng)成分在最低水平缺氧狀態(tài)，干燥和低溫，使菌種處于“體眠”狀態(tài)，抑制其繁殖能力。 一種好的保藏方法首先應(yīng)能長期保持菌種原有的優(yōu)良性狀不變，同時還需考慮到方法本身的簡便和經(jīng)濟(jì)，以便生產(chǎn)上能推廣使用。,46,三、菌種保藏的方法,斜面低溫保藏法：酵母菌 石蠟油封保藏法：酵母菌 砂土管保藏法：細(xì)菌，霉菌，防線菌 硅膠保藏法：細(xì)菌 冷凍干燥法：細(xì)菌，防線菌 液氮超低溫凍結(jié)法：細(xì)菌，真菌,47,四、菌種的衰退與復(fù)壯,1，菌種衰退：菌種經(jīng)過長期人工培養(yǎng)或保藏，由于自發(fā)突變的作用而引起某些優(yōu)良特性變?nèi)趸蛳У默F(xiàn)象。,