生物化工專(zhuān)業(yè)實(shí)驗(yàn)

1、生物工程(技術(shù))專(zhuān)業(yè)實(shí)驗(yàn),指導(dǎo)教師：高曉蓉 孜力汗,課程內(nèi)容,理論講解（4學(xué)時(shí)） 自釀紅葡萄酒（4學(xué)時(shí)） 生物堿分離提取（8學(xué)時(shí)） 酒精發(fā)酵工藝試驗(yàn)（16學(xué)時(shí)） 基因工程重組蛋白的表達(dá)與分離純化（18學(xué)時(shí)）,實(shí)驗(yàn)一 紅葡萄酒釀制工藝實(shí)驗(yàn),葡萄酒的營(yíng)養(yǎng),葡萄酒中已知有約600種對(duì)人體有益的成分，其維生素含量比鮮牛奶高一倍以上，同時(shí)含有人體所必需的13種微量元素（鈣、鎂、磷、鈉、鉀、氯、硫、鐵、銅、鋁、鋅、碘和鈷）。 含有刺激嗅覺(jué)神經(jīng)和味蕾的醋酸、單寧酸等物質(zhì)，可增進(jìn)食欲，其中一些元素還能防止人體內(nèi)某些病菌的繁殖。在國(guó)外，是食用海味、生吃蔬菜時(shí)不可缺少的飲料。 一種稱(chēng)為resveratrol的物質(zhì)

2、可以預(yù)防癌癥，在含有這種物質(zhì)的70種植物中，以葡萄中的含量最為豐富，葡萄酒中以紅葡萄酒中為最多。 調(diào)節(jié)人體新陳代謝，促進(jìn)血液循環(huán)，防止膽固醇增加，同時(shí)還能利尿、激發(fā)肝功能和防止衰老的作用。長(zhǎng)期飲用可防止壞血病、貧血、眼角膜炎，降低血脂、促進(jìn)消化。,紅葡萄原料破碎后，皮渣和葡萄汁混合發(fā)酵，將葡萄糖轉(zhuǎn)化為酒精的過(guò)程。同時(shí)葡萄果粒中的有機(jī)酸、維生素、微量元素及單寧、色素等多酚類(lèi)化合物，浸取轉(zhuǎn)移到葡萄原酒中。紅葡萄原酒經(jīng)過(guò)貯藏、澄清和穩(wěn)定處理，即成為精美的紅葡萄酒。,實(shí)驗(yàn)原理,主要工藝流程,葡萄去壞、除梗、破碎,主發(fā)酵 （前發(fā)酵、酒精發(fā)酵，不需密封）,分離殘?jiān)c酒液,裝密封容器陳釀發(fā)酵 （后發(fā)酵、蘋(píng)-

3、乳酸發(fā)酵，隔絕空氣）,澄清或過(guò)濾,裝瓶飲用,實(shí)驗(yàn)材料,葡萄 制作葡萄酒的關(guān)鍵，7分葡萄3分釀造。 受生長(zhǎng)氣溫、降雨量、土壤等氣候條件決定。釀紅葡萄酒的葡萄品種有赤霞珠、品麗珠、美樂(lè)、西拉、黑比諾等，最好不用食用葡萄釀酒。 紅葡萄酒的顏色來(lái)源于葡萄皮肉所含色素，所以必須選用顏色深（紫黑），成熟度高的新鮮、干凈的紅葡萄。 葡萄酒酵母 耐受高溫、酒精的能力強(qiáng)，在自然發(fā)酵的過(guò)程中得以大量繁殖，并能順利地完成酒精發(fā)酵過(guò)程。,實(shí)驗(yàn)步驟,一、第一階段 (主發(fā)酵) 要準(zhǔn)備的工具和容器：食品級(jí)帶旋蓋的PVC塑料桶幾個(gè)，滅菌紗布等（各組準(zhǔn)備） 葡萄的分選：選擇完全成熟的新鮮葡萄除爛、去梗、破碎，盡快放入準(zhǔn)備好的容

4、器中不要超過(guò)容器總?cè)萘康?/3。每組5斤（包括品嘗和實(shí)驗(yàn)） 加蔗糖 每天攪拌兩到三次，這時(shí)蓋子不用蓋太緊?？吹桨l(fā)酵結(jié)束的跡象（氣泡減少或消失，皮渣有沉淀，桶溫與環(huán)境溫度差值減小或殘?zhí)沁_(dá)到5g/L以下）就開(kāi)始考慮倒桶以防酒體“還原”。此階段最好控制在7天內(nèi)完成。,加糖,越少加越好，葡萄的甜度夠就不加（達(dá)到制作12度葡萄酒的濃度值230克/升），否則就要補(bǔ)齊糖度。從理論上講，加入17g/L蔗糖可以提高1度酒。最終葡萄酒口味以含糖量小于4g/L風(fēng)味良好。 通過(guò)比重計(jì)測(cè)量糖度值后查表得出，然后再套用如下公式： 加糖量克數(shù) = 葡萄汁升數(shù)（希望得到的成酒度數(shù)根據(jù)測(cè)出的葡萄汁比重查表得到相應(yīng)的成酒的度數(shù)）

5、18（或17或19） 注：17克是用去皮渣的汁液來(lái)計(jì)算的，18克是按帶皮渣的來(lái)計(jì)算的，19克是根據(jù)保證酒精度這個(gè)要求以及實(shí)踐教訓(xùn)（1.16的教訓(xùn)系數(shù)，彌補(bǔ)在發(fā)酵過(guò)程中糖的損失171.16=19.72）作出的。,二、第二階段（陳釀發(fā)酵） 將酒體和皮渣用導(dǎo)管抽出（紗布過(guò)濾）倒入準(zhǔn)備好的第二階段容器中，大約100斤葡萄出25升酒左右。 第一階段屬半開(kāi)放式發(fā)酵，第二階段要嚴(yán)格單向密封。因?yàn)榈诙A段的蘋(píng)乳酸發(fā)酵也會(huì)有CO2析出，同時(shí)又不希望葡萄酒被氧化，所以需要單向密封，讓氣體只出不進(jìn)。 蘋(píng)-乳酸自然發(fā)酵條件為：PH3.2以上，酒精度12度以下，溫度22-25度之間，還有一個(gè)重要因素就是所用葡萄存在活性

6、乳酸菌種。以上條件只要有一個(gè)不滿足發(fā)酵就不會(huì)進(jìn)行。因此成功與否是不確定的。,三、貯藏葡萄酒的貯藏要求全密封容器，儲(chǔ)藏酒時(shí)要將酒加滿罐、避光，溫度控制在10-20度無(wú)異味的房間內(nèi)。,蘋(píng)乳酸發(fā)酵,蘋(píng)果酸是雙羧基酸，口味比較尖酸。紅葡萄酒的后發(fā)酵過(guò)程，也叫蘋(píng)果酸乳酸發(fā)酵過(guò)程。這個(gè)過(guò)程是在乳酸細(xì)菌的作用下，將蘋(píng)果酸分解成乳酸和CO2的過(guò)程。經(jīng)過(guò)蘋(píng)果酸乳酸發(fā)酵的紅葡萄酒，尖酸降低，果香醇香加濃，口感柔協(xié)肥碩，才稱(chēng)得上名副其實(shí)的紅葡萄酒。,思考題,為什么不能將葡萄洗的太干凈？ 前酵過(guò)程中為什么進(jìn)行適當(dāng)?shù)臄嚢瑁?請(qǐng)描述一下自己釀造的紅葡萄酒的味道？,實(shí)驗(yàn)二 黃柏中小檗堿的提取和鑒定,黃柏為蕓香科植物黃皮樹(shù)(

7、Phellodendron Chinese Schneid.)及黃柏(Phellodendron amurense Rupr.)除去栓皮的干燥樹(shù)皮。味苦、性 寒。能清熱燥濕，瀉火解毒，退虛熱。其主要成分 為小檗堿(berberine)，含量約1.4%-4%（黃皮樹(shù)根 中含量較高）。,小檗堿：屬生物堿，緩溶于水，冷乙醇溶解度不大，但易溶于熱水或熱乙醇，難溶有機(jī)溶劑。 小檗堿主要以鹽酸鹽形式存在。在冷水中溶解度小，較易溶于沸水。提取和分離過(guò)程中沉淀反應(yīng)和顯色反應(yīng)可用于生物堿的檢測(cè)和鑒定。,提取鹽酸小檗堿常用的方法,酸水法 石灰乳法（可操作性強(qiáng)） 醇提法 超聲提取法（時(shí)間短、生產(chǎn)成本高）,生物堿的色

8、譜檢識(shí),柱色譜：濕法裝柱。吸附劑（固定相）為中性氧化鋁。洗脫劑（流動(dòng)相）為95%乙醇，收集鮮黃色帶。 硅膠薄層色譜：利用硅膠的吸附作用，生物堿極性小， Rf值小大；極性大， Rf值小。 展開(kāi)劑是關(guān)鍵。不能與分離物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)；若Rf值小，可在氯仿中加入甲醇等極性大的溶劑。,比移值（ Rf值） 在薄層色譜中，組分的遷移距離(a)與展開(kāi)劑的遷移距離(b)之比稱(chēng)為比移值(Rf)。 Rf= 硅膠板屬于正相色譜，展開(kāi)劑極性越大，洗脫能力越強(qiáng)，比移值就越大。調(diào)整展開(kāi)劑極性，良好的分離， Rf值應(yīng)在0.150.75之間。,a,b,溶劑前沿,展開(kāi)后斑點(diǎn),起始線,滲漉：黃柏皮粗粉100g（石灰乳加少量水研磨，濃度

9、為終體積1%）攪拌均勻，溶脹30分鐘后，再加入6倍量水浸漬60分鐘。 鹽析：收集滲漉液，加入滲漉液總體積20%（W/V）的食鹽，攪拌后放置，抽濾。 精制：沉淀溶于20倍量沸水中，趁熱過(guò)濾。濾液加濃鹽酸調(diào)至pH 2-3，放置，過(guò)濾。80烘干即得鹽酸小檗堿精制品。 柱色譜：70g中性氧化鋁，加入95%乙醇調(diào)成漿狀，濕法裝柱，不能有氣泡和裂縫。樣品的乙醇體積要少，收集鮮黃色帶。 薄層色譜鑒定：展開(kāi)劑中氯仿和甲醇的比例。,注意事項(xiàng),黃柏中富含粘液質(zhì), 石灰乳能使其變性沉淀,1%的Ca (OH) 2濃度較適宜。 20% NaCl 溶液鹽析產(chǎn)率較高。 一定用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值。 分離柱液面盡量水平。 展開(kāi)劑

10、中氯仿和甲醇的比例由Rf值確定，對(duì)初始的9：1比例適當(dāng)調(diào)整,實(shí)驗(yàn)三 酒精發(fā)酵工藝綜合試驗(yàn),實(shí)驗(yàn)內(nèi)容（工藝流程）,實(shí)驗(yàn)原理,淀粉類(lèi)物質(zhì)在液化酶和糖化酶等雙酶或多酶作用下，水解成還原性單糖物質(zhì)。 酵母菌在厭氧條件下可發(fā)酵己糖形成乙醇，其生化過(guò)程主要是: 第一階段己糖通過(guò)糖酵解途徑(EMP途徑)分解成丙酮酸。 第二階段丙酮酸由脫羧酶催化生成乙醛和二氧化碳，乙醛進(jìn)一步被還原成乙醇。 葡萄糖發(fā)酵成乙醇的總反應(yīng)式為：C6H12O62C2H5OH+2CO2+能量,淀粉質(zhì)原料是生產(chǎn)酒精的主要原料。我國(guó)發(fā)酵酒精的80%是用淀粉質(zhì)原料生產(chǎn)的，其中薯類(lèi)原料約占45%，玉米等谷物原料約占35%。本實(shí)驗(yàn)是以玉米粉為原料

11、生產(chǎn)發(fā)酵用單糖。 淀粉是多糖中最易分解的一種，由許多葡萄糖基團(tuán)聚合而成。天然淀粉具有直鏈淀粉和支鏈淀粉兩種結(jié)構(gòu)，它們?cè)谛再|(zhì)和結(jié)構(gòu)上有差異。在大多數(shù)植物淀粉中，直鏈淀粉含量為2030。,實(shí)驗(yàn)三（一）雙酶法制備糖化醪,直鏈淀粉是-D葡萄糖通過(guò)1，4糖苷鍵連接而成的聚合物，分子量32400162000。溶解于7080的溫水,遇碘呈深藍(lán)色。 支鏈淀粉是D葡萄糖通過(guò)1，4糖苷鍵及1，6糖苷鍵（在分支點(diǎn)上）連接而成的聚合物。其分子量較直鏈淀粉的大，可達(dá)107。支鏈淀粉不溶解于溫水,遇碘呈藍(lán)紫。,淀粉的糊化,指淀粉受熱后，淀粉顆粒膨脹、晶體結(jié)構(gòu)消失、互相接觸變成糊狀液體，即使停止攪拌，淀粉也不會(huì)再沉淀的現(xiàn)象

12、。經(jīng)糊化的淀粉稱(chēng)為-淀粉。 糊化目的：打破淀粉顆粒的晶體結(jié)構(gòu)，使淀粉酶能直接作用于淀粉。,淀粉的液化,-淀粉酶能從分子內(nèi)部切開(kāi)-1，4糖苷鍵，但不能水解-1，6糖苷鍵及其附近幾個(gè)-1，4糖苷鍵。當(dāng)-淀粉酶作用于淀粉糊時(shí)，能使其黏度迅速下降，故又稱(chēng)液化酶，此過(guò)程也稱(chēng)為淀粉的液化。 直鏈淀粉經(jīng)該酶水解的最終產(chǎn)物為葡萄糖和麥芽糖。支鏈淀粉的水解產(chǎn)物除葡萄糖、麥芽糖外，還有具有-1，6鍵的極限糊精和含有4個(gè)或更多葡萄糖殘基的帶鍵的低聚糖。,淀粉的糖化,葡萄糖淀粉酶能從淀粉的非還原末端逐個(gè)切下葡萄糖，它既能水解-1，6糖苷鍵，又能水解-1，4糖苷鍵。由于形成的產(chǎn)物幾乎都是葡萄糖，因此該酶又稱(chēng)為糖化酶。,

13、糊化：玉米粉：水=1：5 ，pH值5.56.0 （水600ml） 注意：隨時(shí)攪拌，補(bǔ)水，記錄粘度最大時(shí)溫度 液化：-淀粉酶，9597，1.5小時(shí)，隨時(shí)補(bǔ)水 糖化：58-60,pH值4.44.6，加入糖化酶，60糖化10小時(shí)以上 過(guò)濾：補(bǔ)足水分，4層紗布過(guò)濾，調(diào)節(jié)濾液pH在5.0左右 滅菌：在體積為250ml培養(yǎng)瓶中裝入100ml糖化醪液（6瓶），瓶口封8層紗布蓋牛皮紙，滅菌。,空白滴定：斐林甲、乙液各5ml和水20ml， 5ml水做空白樣品。250ml三角瓶中，用0.1%標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液滴定，所耗標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液毫升數(shù)記為V空。 試樣滴定：5ml發(fā)酵液代替空白，記下所用標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液毫升數(shù)為V實(shí)。

14、 * 若殘?zhí)呛芨?，滴定不出，將試樣稀釋后再滴?* 沸騰狀態(tài)下，3分鐘內(nèi)滴完，每次滴定均重復(fù)3次以上 還原糖（g/ml）=,實(shí)驗(yàn)三（二）廉-愛(ài)濃法定糖,糖化醪總糖,實(shí)際生產(chǎn)中用于酒精發(fā)酵的幾乎全是酒精酵母，俗稱(chēng)酒母。本實(shí)驗(yàn)所用的酵母是白鳳武教授課題組研發(fā)的自絮凝釀酒酵母。 酵母生長(zhǎng)培養(yǎng)基的配制：葡萄糖3%，酵母粉0.4%，蛋白胨0.3%。每個(gè)250ml培養(yǎng)瓶中含100ml培養(yǎng)基,每組至少配制6瓶,28-30下?lián)u床震蕩培養(yǎng)24小時(shí), 肉眼可見(jiàn)酵母顆粒。 每瓶培養(yǎng)基倒出，剩余的酵母倒入滅菌的糖化醪液中，瓶口封8層紗布蓋塑料布（用針扎小眼），28-30下發(fā)酵48小時(shí)以上。,實(shí)驗(yàn)三（三）釀酒酵母培養(yǎng)及

15、接種,廉-愛(ài)濃法測(cè)定殘余還原糖、總糖含量 測(cè)定發(fā)酵液酒精含量：250ml三角瓶中加入100ml發(fā)酵液和100ml水，加熱蒸餾至蒸出液近100ml，用水補(bǔ)足至100ml。20溫度下用酒度計(jì)直接讀酒精度（V/V），若溫度不在20，查酒精-溫度更正表，記下酒精度。 計(jì)算糖利用率、淀粉出酒率,實(shí)驗(yàn)三（四）糖化醪液的酒精發(fā)酵,發(fā)酵過(guò)程中除主要生成乙醇外，還生成少量的其他副產(chǎn)物，包括甘油、有機(jī)酸（主要是琥珀酸）、雜醇油（高級(jí)醇）、醛類(lèi)、酯類(lèi)等。 理論上1mol葡萄糖可產(chǎn)生2mol乙醇；即180克葡萄糖產(chǎn)生92克乙醇，得率為51.5%，可是實(shí)際得率沒(méi)有這么高。因酵母菌體的積累約需2% 的葡萄糖，另外2%的葡

16、萄糖用于形成甘油，0.5%用于形成有機(jī)酸，0.2%用于形成雜醇油。因此實(shí)際上只有約47的葡萄糖轉(zhuǎn)化成乙醇。乙醇發(fā)酵中大部分能量仍?xún)?chǔ)存于乙醇之中，所釋放的226kJ自由能中除67kJ(29)用于形成ATP外，其余能量以熱的形式散發(fā)。,實(shí)驗(yàn)四基因工程重組蛋白的表達(dá)與分離純化,實(shí)驗(yàn)原理,將外源基因克隆在含有l(wèi)ac啟動(dòng)子的pET-30表達(dá)載體中，讓其在E.coli中表達(dá)。先讓宿主菌生長(zhǎng)，lacI產(chǎn)生的阻遏蛋白與lacI操縱基因結(jié)合，從而不能進(jìn)行外源基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，此時(shí)宿主菌正常生長(zhǎng)。然后向培養(yǎng)基中加入lac操縱子的誘導(dǎo)物IPTG(異丙基硫代-D-半乳糖 )，阻遏蛋白不能與操縱基因結(jié)合，則DNA外源基

17、因大量轉(zhuǎn)錄并高效表達(dá)。表達(dá)蛋白可經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)。,原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng),非融合表達(dá)蛋白載體pKK223-3 分泌型克隆表達(dá)載體PIN系統(tǒng) 融合蛋白載體pGEMX系統(tǒng) 融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)pET系統(tǒng)等,選擇標(biāo)志的編碼序列； 可控轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子； 轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列(轉(zhuǎn)錄終止子，核糖體結(jié)合位點(diǎn)RBS)； 一個(gè)多限制酶切位點(diǎn)接頭； 宿主體內(nèi)自主復(fù)制的序列,原核表達(dá)載體,外源基因在原核生物中表達(dá)的注意事項(xiàng)：,（1） 通過(guò)表達(dá)載體將外源基因?qū)胨拗骶⒅笇?dǎo)宿主菌的酶系統(tǒng)合成外源蛋白： （2）外源基因不能帶有間隔序列（內(nèi)含子），因而必須用cDNA或化學(xué)合成的基因，不能用基因組DNA （3）必須利用原核細(xì)胞的強(qiáng)啟

18、動(dòng)子和S-D序列等調(diào)控元件調(diào)控外源基因的表達(dá) （4）外源基因與表達(dá)載體連接后，必須形成正確的開(kāi)放閱讀框架 （5）利用宿主菌的調(diào)控系統(tǒng)，調(diào)節(jié)外源基因的表達(dá)，防止表達(dá)的外源基因產(chǎn)物對(duì)宿主的毒害。,菌體活化（小瓶培養(yǎng)，過(guò)夜） 菌體培養(yǎng)（2%加入搖瓶擴(kuò)繁，2.5小時(shí)） 誘導(dǎo)表達(dá)（IPTG誘導(dǎo)1618小時(shí)） 菌體收集（離心） 細(xì)胞破碎（溶菌酶） 蛋白分離（75水浴1小時(shí)、多次離心） 蛋白純化（陰離子交換柱） 蛋白電泳（SDS-PAGE）,實(shí)驗(yàn)流程,LB液體培養(yǎng)基：1g蛋白胨（進(jìn)口），0.5g酵母粉（進(jìn)口）， 1g NaCl,加水至100ml，pH7.5。 （每組 20ml4瓶，用于活化菌種，600-1000ml分裝后用于菌種擴(kuò)繁與蛋白表達(dá)） 氨芐青霉素終濃度100ug/ml（母液100ug/l，1000） IPTG 終濃度為0.5mmol