生物化學(xué)課件：2 3 氨基酸和蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)

1、第2章 氨基酸和蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu),生物化學(xué),氨基酸和肽,蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)單元 氨基酸的結(jié)構(gòu)和分類 氨基酸的性質(zhì) 蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)純化與分析,氨基酸是蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)單元，已由蛋白質(zhì)的水解得到證明。 蛋白質(zhì)被酸、堿和酶水解，可以得到各種各樣的氨基酸。,一、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)單元,絕大多數(shù)的蛋白質(zhì)都是由20種氨基酸組成，這20種氨基酸被稱為基本氨基酸,自然界中存在的氨基酸有300余種，在動植物組織中可以分離得到2630種不同的氨基酸。 直到1965年才搞清楚，合成天然蛋白質(zhì)的原料只有20種氨基酸（ 稱為基本氨基酸， Primary amino acid）。,基本氨基酸的名稱與符號,Alanine丙氨酸Ala

2、A Arginine 精氨酸 Arg R Asparagine天冬酰胺 Asn N Aspartic acid天冬氨酸Asp D Cysteine半胱氨酸CysC Glutamine谷氨酰胺Gln Q Glutamic acid谷氨酸Glu E Glycine甘氨酸GlyG Histidine組氨酸HisH Isoleucine異亮氨酸IleI Leucine亮氨酸LeuL Lysine賴氨酸LysK Methionine甲硫氨酸/蛋氨酸MetM Phenylalanine苯丙氨酸PheF Proline脯氨酸ProP Serine絲氨酸SerS Threonine蘇氨酸ThrT Trypto

3、phan色氨酸TrpW Tyrosine酪氨酸TyrY Valine纈氨酸ValV,要求：記住每個氨基酸的 名稱及其簡寫,B,Z,Asx,Glx,一個小故事保你記住所有氨基酸！,六伴窮光蛋，酸谷天出門，死豬肝色臉，只攜一兩錢。 一本落色書，揀來精讀之。芳香老本色，不搶甘肅來。 六伴窮光蛋：硫、半、光、蛋半胱、光、蛋（甲硫）氨酸含硫氨 基酸酸谷天出門：酸、谷、天谷氨酸、天門冬氨酸酸性氨基酸死豬肝色臉：絲、組、甘、色絲、組、甘、色氨酸一碳單位來源的氨基酸只攜一兩錢：支、纈、異亮、亮纈、異亮、亮氨酸支鏈氨基酸一本落色書：異、苯、酪、色、蘇異亮、苯丙、酪、色、蘇氨酸生糖兼生酮揀來精讀之：堿、賴、精、組

4、賴氨酸、精氨酸、組氨酸堿性氨基酸芳香老本色：芳香、酪、苯、色酪、苯丙、色氨酸芳香族氨基酸 不搶甘肅來：脯、羥、甘、蘇、賴脯、羥脯、甘、蘇、賴氨酸不參與轉(zhuǎn)氨基的氨基酸,作為構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位，氨基酸中只有20種基本氨基酸是在生物界中普遍存在的，且它們具有相同的結(jié)構(gòu)通式。,不同氨基酸就在于R基團(tuán)不同,（一）L-氨基酸的基本結(jié)構(gòu),二、氨基酸的結(jié)構(gòu)與分類,側(cè)鏈基團(tuán),氨基酸不同就在于R基團(tuán)不同,-氨基酸的碳為不對稱碳原子,（二）20種基本氨基酸的結(jié)構(gòu)及其分類,按酸堿性質(zhì)分類（生理pH）,1. 中性AA（1個-NH3+和1個-COO-，15種）,2. 酸性AA（1個-NH3+和2個-COO-，2種）,3

5、. 堿性AA（2個-NH3+和1個-COO-，3種）,Asp、Glu,His、Lys 、 Arg,脂肪族氨基酸,1. 中性AA（1個-NH3+和1個-COO-）,亞氨基酸,芳香族氨基酸,苯丙氨酸 （Phe,F）,酪氨酸 （Tyr,Y）,色氨酸 （Trp,W）,1. 中性AA（1個-NH3+和1個-COO-）,醇類氨基酸,1. 中性AA（1個-NH3+和1個-COO-）,絲氨酸 （Ser,S）,蘇氨酸 （Thr,T）,1. 中性AA（1個-NH3+和1個-COO-）,1. 中性AA（1個-NH3+和1個-COO-）,酰胺類氨基酸,天冬酰胺 （Asn,N）,谷氨酰胺 （Gln,Q）,生理pH范圍內(nèi)

6、 酰胺基不被質(zhì)子化,天冬氨酸 （Asp,D）,谷氨酸 （Glu,E）,2. 酸性AA（1個-NH3+和2個-COO-）,3. 堿性AA（2個-NH3+和1個-COO-）,賴氨酸 （Lys,K）,精氨酸 （Arg,R）,組氨酸 （His,H）,極性AA,非極性AA（9種）,按R基團(tuán)的極性分類,Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、 Met、Phe、Trp,必需氨基酸（8種） ：指人體不能合成，必須從食物中攝?。?Ile, Met, Val, Leu, Trp, Phe, Thr, Lys 半必需氨基酸（2種） ：指人體可以合成但合成量不能滿足人體需要（特別是嬰幼兒）：His，Arg 非

7、必需氨基酸：指人體可以合成的氨基酸：其余十種。,按氨基酸是否能在人體內(nèi)合成分類,一 家 攜 兩 三 本 書 來,需搭配膳食以保證營養(yǎng)均衡,旋光異構(gòu)體：化學(xué)性質(zhì)相同、物理性質(zhì)（旋光性除外） 相同， 生物功能不同,（三）氨基酸的旋光異構(gòu)體,氨基酸有D-型及L-型,氨基酸的D-型或L-型以甘油醛為參考,L-型：-氨基位 于-碳左邊 D-型：-氨基位于-碳右邊,D：Dextrorotatory （右旋） L： Levorotatory （左旋）,L-和D-型氨基酸的判斷（看CAR的走向）,將H原子靠近自己，觀察CAR的走向，逆時針為L-型，順時針為D-型。,L-型,D-型,C：carboxyl gro

8、up A：amino group R：residue,Thr含兩個手性碳原子，有4 種立體異構(gòu)體，分別稱為- 、-，-別-、-別-氨基酸。,L-蘇氨酸 (L-threonine),D-蘇氨酸 (D-threonine),L-別-蘇氨酸 (L-allo-threonine),D-別-蘇氨酸 (D-allo-threonine),蘇氨酸（Thr）有 種旋光異構(gòu)體,旋光異構(gòu)體數(shù)目為 2n（n為不對稱碳原子數(shù)目）,？,半胱氨酸（Cysteine）和胱氨酸（Cystine）,胱氨酸的光學(xué) 異構(gòu)體有？種,胱氨酸有三種立體異構(gòu)體：L-胱氨酸、 D-胱氨酸、 內(nèi)消旋胱氨酸。,外消旋物：D-型和L-型的等摩爾混

9、合物； 如：L-胱氨酸和D-胱氨酸是外消旋物,內(nèi)消旋物：分子內(nèi)消旋,氨基酸的旋光性受溶液的pH影響很大，因為在不同條件下氨基和羧基的解離狀態(tài)不同。,pH對L-亮氨酸(a)和L-組氨酸(b) 的比旋光度的影響,L-亮氨酸,L-組氨酸,氨基酸的構(gòu)型 除甘氨酸之外，所有的氨基酸都存在L-型和D-型分子構(gòu)型 天然蛋白質(zhì)中的氨基酸都是L-型分子 氨基酸的旋光性 除甘氨酸外，氨基酸均含有一個手性-碳原子，因此都具有旋光性。 比旋光度是氨基酸的重要物理常數(shù)之一，是鑒別各種氨基酸的重要依據(jù),（四）重要的不常見氨基酸,1. 非編碼氨基酸 在少數(shù)蛋白質(zhì)中分離出一些不常見的氨基酸，這些氨基酸都是由相應(yīng)的基本氨基酸修

10、飾而來的，也稱修飾氨基酸。從各種生物分離到的氨基酸已達(dá)250種以上，大量出現(xiàn)在膠原蛋白，結(jié)締組織中。,2. 非蛋白氨基酸 不組成蛋白質(zhì)，呈游離或結(jié)合態(tài)的氨基酸，約150種，具有多種生理功能,修飾氨基酸,結(jié)締組織,膠原蛋白,凝血酶,胱氨酸（Cystine） ：廣泛地存在于蛋白質(zhì)中，由兩個Cys的巰基氧化脫氫形成的二硫鍵連接而成。,（1） L-氨基酸的衍生物 L-瓜氨酸和L-鳥氨酸是合成精氨酸的中間產(chǎn)物。,非蛋白氨基酸,（2）D-氨基酸 D-Phe是短桿菌肽S的組分， D-Glu存在于肽聚糖中。,非蛋白氨基酸,泛酸的前體,神經(jīng)遞質(zhì),（3）、-氨基酸 -Ala是泛酸的前體，-氨基丁酸是傳遞神經(jīng)沖動的

11、化學(xué)介質(zhì)。,非蛋白氨基酸,硒代半胱氨酸,1986年發(fā)現(xiàn)的編碼氨基酸（UGA） 存在于含硒蛋白質(zhì)中 簡寫：Sec，U,（第21種編碼氨基酸）,2000年5月24日Science上同時發(fā)表的2篇論文，表明在某些古細(xì)菌和真細(xì)菌中。通常作為終止密碼的UAG編碼了第22種氨基酸吡咯賴氨酸。,吡咯賴氨酸,（第22種編碼氨基酸）,Pyrrolysine (Pyl),三、氨基酸的理化性質(zhì),1. 氨基酸的一般物理性質(zhì) 2. 氨基酸的光吸收性 3. 氨基酸的酸堿性質(zhì) 4. 氨基酸的化學(xué)反應(yīng),形態(tài)：均為白色結(jié)晶或粉末，不同氨基酸的晶型結(jié)構(gòu)不同。 溶解性：一般都溶于水，不溶或微溶于醇，不溶于丙酮，在稀酸和稀堿中溶解性

12、好。 熔點：氨基酸的熔點一般都比較高，一般都大于200，超過熔點以上氨基酸分解產(chǎn)生胺和二氧化碳。,1. 氨基酸的一般物理性質(zhì),2. 氨基酸的光吸收,20種基本氨基酸,紫外吸收,Tyr、Phe、Trp的側(cè)鏈含有苯環(huán)共軛雙鍵，在220-300nm近紫外區(qū)有吸收。,AA在280nm有最大光吸收，可利用此性質(zhì)采用紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)的含量,3. 氨基酸的酸堿性質(zhì)與兩性解離,氨基酸在晶體狀態(tài)或水溶液中以兼性離子(zwitterions)或偶極離子(dipolar ion)形式存在。 一個氨基酸分子上可以即有正電荷又有負(fù)電荷，稱為兩性電解質(zhì)(ampholyte),氨基酸解離方式取決于所處環(huán)境的pH,氨

13、基酸凈電荷為零時的溶液pH的為該氨基酸的等電點（isoelectric point)，以符號pI 表示,氨基酸等電點的計算,側(cè)鏈不含可解離基團(tuán)的中性氨基酸： pI = (pK1 + pK2 ) / 2 即：氨基酸的pI值等于該氨基酸的兩性離子狀態(tài)兩側(cè)的基團(tuán) pK值之和的二分之一。等電點值與離子濃度無關(guān)，只取決于兼性離子兩側(cè)基團(tuán)的pK值。,側(cè)鏈含有可解離基團(tuán)的氨基酸： 酸性氨基酸：pI = (pK1 + pKR-COOH) / 2 堿性氨基酸：pI = (pK2 + pKR-NH3+) / 2,賴氨酸,+,COOH的pK值在2.0左右， 當(dāng)pH3.5，COOH以COO- 形式存在。 NH2的pK

14、值在9.4左右， 當(dāng)pH8.0時，-NH2 以NH3+ 形式存在。 pH值在3.5-8.0范圍內(nèi)時，氨基酸是兩性離子存在,氨基酸在溶液中的帶電狀態(tài),(1). 由-NH2與-COOH共同參與的反應(yīng) 茚三酮的顏色反應(yīng) 成肽反應(yīng) (2). -NH2參與的反應(yīng) 與亞硝酸反應(yīng) 與甲醛反應(yīng) 酰化反應(yīng) 烷化反應(yīng) 西弗堿反應(yīng),(3). -COOH參與的反應(yīng) 成鹽反應(yīng) 成酯反應(yīng) 酰鹵化反應(yīng) 疊氮反應(yīng) (4). 氨基酸的側(cè)鏈基團(tuán)的反應(yīng),4. 氨基酸的重要化學(xué)反應(yīng),-氨基酸與水合茚三酮溶液共熱，引起氨基酸脫氨、脫羧，生成藍(lán)紫色化合物（Pro呈黃色），最大吸收峰在470nm（ Pro 440nm）處。 由于吸收峰值與

15、氨基酸的含量存在正比關(guān)系，因此可作為氨基酸定量分析或定性分析。,與茚三酮(ninhydrin)的反應(yīng)：,(1). 由-NH2與-COOH共同參與的反應(yīng), 成肽反應(yīng),(1). 由-NH2與-COOH共同參與的反應(yīng),(2). -NH2參與的反應(yīng), 與亞硝酸的反應(yīng) (Van Slyke定氮),一分子游離氨基形成一分子氮氣，因此可以用來定氮，這是Van slyke（范斯來克）定氮法的原理。, 酰基化反應(yīng),-氨基與酰氯或酸酐在弱堿溶液中發(fā)生作用時，氨基被酰基化。 ?；噭┰诙嚯暮偷鞍踪|(zhì)的人工合成中被用作氨基的保護(hù)試劑,(2). -NH2參與的反應(yīng),鄰苯二甲酸酐,芐氧甲酰氯（Cbz-Cl）,對甲苯磺酰氯

16、(Tos-Cl), ?；磻?yīng),(2). -NH2參與的反應(yīng),與丹磺酰氯反應(yīng),丹磺酰氯 (DNS-Cl，5-二甲氨基萘磺酰氯),DNS-氨基酸是熒光物質(zhì)，在紫外光激發(fā)后發(fā)黃色熒光,可用于鑒定多肽的N末端氨基酸殘基，靈敏度高, 烷基化反應(yīng),(2). -NH2參與的反應(yīng),氨基酸氨基的一個H鍵可被烴基（包括環(huán)烴及其衍生物）取代,2,4-二硝基氟苯（DNFB） （Sanger試劑）,苯異硫氰酸酯（PITC） （Edman試劑）,用來鑒定多肽的NH2末端氨基酸,與2,4-二硝基氟苯反應(yīng)（Sanger反應(yīng)）,+,弱堿,氨基酸,2,4-二硝基氟苯,DNP-氨基酸 (黃色),用于鑒定蛋白質(zhì)和多肽的N末端氨基酸

17、殘基,無水HF,PITC,（苯乙內(nèi)酰硫脲-aa）,（苯氨基硫甲酰-aa）,與苯異硫氰酸酯的反應(yīng)（Edman反應(yīng)）,Edman 降解,在Edman試劑上加發(fā)色基團(tuán)： 二甲氨基偶氮苯-ITC (DABITC),目前絕大部分被直接測定的蛋白序列是通過Edman降解反應(yīng)取得的。 為紀(jì)念Edman的貢獻(xiàn)，1988年世界蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析大會設(shè)立了Edman獎，以鼓勵蛋白質(zhì)序列測定方法領(lǐng)域作出貢獻(xiàn)的科學(xué)家。 遺憾的是Edman未能獲得Nobel獎,1952年丹麥人Linderstrom-Lang最早提出蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可以分成四個層次:,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)層次,血紅蛋白,一、蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu),1969年，國際純化學(xué)

18、與應(yīng)用化學(xué)委員會（IUPAC）規(guī)定： 蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)指蛋白質(zhì)多肽鏈中氨基酸的排列順序，包括二硫鍵的位置。 維持一級結(jié)構(gòu)的作用力為共價鍵（主要為肽鍵、二硫鍵），故一級結(jié)構(gòu)也稱為共價結(jié)構(gòu)。,1. 一級結(jié)構(gòu)（Primary structure）定義,一級結(jié)構(gòu),2. 一級結(jié)構(gòu)研究內(nèi)容與意義,HbA -鏈：Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys HbS -鏈：Val-His-Leu-Thr-Pro-Val -Glu-Lys,HbA (adult hemoglobin),HbS (sickle-cell hemoglobin),Glu（極性） Val（非極性）,鐮刀狀紅細(xì)胞性貧血

19、,根據(jù)細(xì)胞色素C的種屬差異建立的進(jìn)化樹,不同生物與人的細(xì)胞色素c的AA差異,1. 蛋白質(zhì)的兩性解離,蛋白質(zhì)分子除兩端的氨基和羧基可解離外，側(cè)鏈中某些基團(tuán)，在一定的溶液pH條件下都可解離成帶負(fù)電荷或正電荷的基團(tuán)。 可解離基團(tuán)AA：Asp、Glu、Lys、Arg、His、Tyr、Cys 蛋白質(zhì)與氨基酸、多肽一樣具有兩性解離的性質(zhì)，也具有特定的等電點（pI）。,蛋白質(zhì)純化與分析,蛋白質(zhì)溶液處于等電點時，溶解度最??；粘度、滲透壓、導(dǎo)電能力也降為最低值。,2. 蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì),由于蛋白質(zhì)分子量很大，在水溶液中形成1-100nm的顆粒，因而具有膠體溶液的特征。,透析法和超濾法,水化層,（1）蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)

20、定的因素 電荷層：蛋白質(zhì)在非等電點狀態(tài)時帶同種電荷，在顆粒表面形成電荷層，同性電荷互斥，使分子不能聚集。 水化層：可溶性蛋白質(zhì)分子表面分布著大量極性氨基酸殘基，對水有很高的親和性，通過水合作用在蛋白質(zhì)顆粒表面形成水化層，其可防止分子互碰而聚集 。,（2）蛋白質(zhì)的沉淀作用 如果加入適當(dāng)?shù)脑噭┦沟鞍踪|(zhì)分子消除相同電荷（處于等電點狀態(tài)）或除去水化層，蛋白質(zhì)膠體溶液就不再穩(wěn)定，而將產(chǎn)生沉淀。,鹽析法: 大量的中性鹽（(NH4)2SO4，NaCl），使蛋白質(zhì)脫去水化膜而聚集沉淀。,蛋白質(zhì)的沉淀方法,在蛋白質(zhì)溶液中加入大量中性鹽，使蛋白質(zhì)從溶液中沉淀析出，稱為鹽析。（不會使蛋白質(zhì)產(chǎn)生變性） 低濃度的鹽溶液

21、加入蛋白質(zhì)溶液中，會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的溶解度增加，該現(xiàn)象稱為鹽溶。,在蛋白質(zhì)的鹽析中，以硫酸銨最為常用，硫酸銨在水中的溶解度大而且溫度系數(shù)小(在25 時，溶解度為767 gL；0時，溶解度為697 gL)、不使蛋白質(zhì)變性,有機(jī)溶劑沉淀法： 破壞水化膜（PEG、丙酮、乙醇等） 重金屬鹽沉淀：pHpI時帶負(fù)電荷，重金屬離子（Hg2+. Pb2+. Cu2+ 等）與Pr結(jié)成不溶性沉淀。 長期從事重金屬作業(yè)的人應(yīng)多吃高蛋白食品，以防止重金屬離子被機(jī)體吸收后造成對機(jī)體的損害。 等電點沉淀法：破壞雙電層，等電點時溶解度最低, 生物堿試劑和某些酸類： 生物堿試劑一般為弱酸性物質(zhì)，如單寧酸、苦味酸、三氯乙酸等。 生

22、物堿試劑沉淀蛋白質(zhì)的機(jī)理：在酸性條件下，蛋白質(zhì)帶正電，可以與生物堿試劑的酸根離子結(jié)合而產(chǎn)生沉淀。,“柿石癥”的產(chǎn)生就是由于空腹吃了大量的柿子，柿子中含有大量的單寧酸，使腸胃中的蛋白質(zhì)變性凝固而成為不能被消化的“柿石”,可逆沉淀 在發(fā)生沉淀反應(yīng)時，蛋白質(zhì)雖已沉淀析出，但它的分子空間結(jié)構(gòu)并未發(fā)生顯著變化，基本上保持原有的性質(zhì)，沉淀因素除去后，能再溶于水溶液中。這種作用稱為可逆沉淀反應(yīng)。 大多數(shù)蛋白質(zhì)的鹽析作用或利用等電點的沉淀。,（3）沉淀類型,不可逆沉淀/變性沉淀 在發(fā)生沉淀反應(yīng)時，蛋白質(zhì)分子空間構(gòu)象遭到破壞，這時蛋白質(zhì)已發(fā)生變性，變性蛋白質(zhì)的沉淀不能再溶解于原來溶劑或水溶液中的作用稱為不可逆沉

23、淀或變性沉淀。 重金屬鹽、生物堿試劑，有機(jī)溶劑、加熱、超聲波等都能使蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆沉淀反應(yīng)。,蛋白質(zhì)變性后，有時由于維持溶液穩(wěn)定的條件仍然存在而并不沉淀，例如：在強酸堿中變性的蛋白質(zhì)在強酸堿溶液中仍存在電荷效應(yīng)，所以不表現(xiàn)為沉淀現(xiàn)象。 沉淀的蛋白質(zhì)也未必都變性。,* 蛋白質(zhì)的凝固作用 (protein coagulation) 蛋白質(zhì)變性后的絮狀物加熱可變成比較堅固的凝塊，此凝塊不易再溶于強酸和強堿中。,蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng) 蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)主要與其定性、定量測定有關(guān)： 1. 茚三酮反應(yīng) 2. 雙縮脲反應(yīng),蛋白質(zhì)的紫外吸收特征 蛋白質(zhì)溶液能在近紫外區(qū)（280nm處）有光吸收： 色（Trp） 酪（

24、Tyr） 苯丙（Phe）,二、蛋白質(zhì)的分離純化,蛋白質(zhì)分離純化的總目標(biāo)： 增加目的蛋白的純度或酶的比活 蛋白質(zhì)分離純化的基本原則： 選擇合適的材料 了解目的蛋白的穩(wěn)定性 探索有效的抽提法和濃縮法 建立一套分離、純化方法的組合 以較好的方法保存,1. 蛋白質(zhì)的分離和純化步驟,一、初(粗)提 組織、細(xì)胞破碎 緩沖液提取。 二、粗分級分離 （粗純化） 鹽析 有機(jī)溶劑沉淀 等電點沉淀,三、細(xì)分級分離 （精純化） 分子篩層析 親和層析 疏水/反相層析 離子交換層析 電泳等 四、結(jié)晶,蛋白質(zhì)的前處理,將組織和細(xì)胞破碎 動物組織和細(xì)胞：電動搗碎機(jī)（waring blender) 勻漿器（homogenize

25、r) 超聲波處理（ultrasonication) 植物組織和細(xì)胞： 石英砂+提取液，研磨 纖維素酶處理 細(xì)菌：超聲波震蕩、與砂研磨、高壓擠壓、溶菌酶處理 差速離心法收集細(xì)胞的某一組分 如何提取膜蛋白：超聲波或去污劑使膜解聚，然后用適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)提取。,鹽析 有機(jī)溶劑沉淀 等電點沉淀 超濾濃縮等,2. 蛋白質(zhì)的性質(zhì)與分離純化方法,利用透析袋（半透膜）把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開的方法。,半透膜阻留pr分子，而讓小的溶質(zhì)分子和水通過，以達(dá)到除去蛋白質(zhì)溶液中小分子（鹽、低分子酸等）,透析 (dialysis),依據(jù)分子大小的純化方法,依據(jù)分子大小的純化方法,超 濾,超（過）濾：是利用外加壓或離心使

26、水和其他分通過半透膜，蛋白質(zhì)留在膜上。,蛋白質(zhì)顆粒沉降不僅決定于它的大小也取決于它的密度。 顆粒沉降到與自身密度相等的介質(zhì)梯度時，即停止不前。 在離心力的作用下，各種蛋白質(zhì)在不同密度介質(zhì)中形成獨立的區(qū)帶。,蔗糖密度梯度 聚蔗糖密度梯度,密度梯度離心,層析法/色譜法（chromatography）,蛋白質(zhì)分離常用的層析方法 凝膠過濾層析：利用各蛋白質(zhì)分子大小不同分離。 離子交換層析：利用各蛋白質(zhì)的電荷進(jìn)行分離 親和層析：利用蛋白質(zhì)與配體的親和力不同進(jìn)行分離 吸附層析/疏水層析：,柱中填充不溶的基質(zhì)顆粒，常用的有葡聚糖，樹脂等,凝膠顆粒為細(xì)微的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。 凝膠層析的原理是分子篩效應(yīng)，如同過篩那

27、樣，它可以把蛋白質(zhì)按不同分子大小進(jìn)行分離。,根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同來分離純化蛋白質(zhì)的種方法,葡聚糖（Sephadex） 聚丙烯酰胺凝膠（Bio-Gel P） 瓊脂糖凝膠（Sepharose, Bio-Gel A）,凝膠過濾層析（分子篩層析）,交聯(lián)葡聚糖（Sephadex）,logMr = K1 - K2Ve,洗脫體積Ve：自加入樣品開始到該組分的洗脫峰峰頂（即收集液中該組分濃度最大時）出現(xiàn)時所流出的洗脫液體積。,凝聚過濾法測定蛋白質(zhì)分子量,利用離子交換基質(zhì)上的可解離基團(tuán)對各種蛋白結(jié)合力不同而達(dá)到分離目的的一種分離方法,支持基質(zhì)：纖維素，瓊脂糖,由于蛋白質(zhì)分子具有兩性性質(zhì)，所以可用陽離子交換劑，

28、也可用陰離子交換劑進(jìn)行蛋白的分離純化。,離子交換層析,陽離子交換層析原理,洗脫方法：改變鹽濃度和改變pH的方法,陰離子交換層析分離蛋白質(zhì),交聯(lián)葡聚糖離子交換劑,利用生物分子與配體之間所具有的專一而又可逆的親和作用，使生物分子分離純化的技術(shù) 這種分離純化方法專一性強，理論上可以從復(fù)雜的體系中一步提取所需的物質(zhì)。,親和層析 (affinity chromatography),酶與底物、抑制劑、效應(yīng)物及其結(jié)構(gòu)類似物 激素與受體蛋白 抗原與抗體 生物素與親和素（抗親和素蛋白） 糖與凝集素等,免疫親和層析：抗原抗體 凝集素親和層析：糖凝集素 金屬螯和層析：如NTA-Nipoly-His,免疫親和層析（,

29、金屬螯和層 析（,吸附法是利用各種吸附劑和蛋白質(zhì)結(jié)合能力（吸附能力）的不同來分離蛋白質(zhì)。 極性：硅膠、氧化鋁（離子吸引和氫鍵） 最廣泛最有效：羥基磷灰石（hydroxyapatite)，即結(jié)晶磷酸鈣Ca10(PO4)6(OH)2，與DNA的親和力最高，可分離蛋白質(zhì)、核酸 非極性：苯基瓊脂糖、辛基瓊脂糖（范德華力、疏水作用）,吸附層析,疏水作用層析和反相HPLC,疏水層析和反相HPLC 1 原理：利用蛋白質(zhì)疏水性的差異進(jìn)行分離。 2 介質(zhì)： HPLC： 苯基：分離蛋白質(zhì) C18：分離肽段 常壓介質(zhì)： 疏水性由弱到強：丙烷基 戊烷基 苯基 辛烷基,HPLC的原理與常規(guī)的層析原理是一樣的，只不過它所

30、使用的基質(zhì)顆粒更小，基質(zhì)填充比常規(guī)下的層析柱更致密。 HPLC中，由計算機(jī)控制的泵將蛋白質(zhì)樣品和洗脫液輸送至層析柱，層析柱是由不銹鋼制造的，每平方英寸可以承受幾百磅的壓力。計算機(jī)控制樣品和溶劑的流速，可任意地選擇洗脫條件，以保證高重復(fù)性。 利用高壓液相層析可以大大提高速度、分辨率和靈敏度。,高壓液相色譜是一種多用途的層析方法，可以根據(jù)特定類型分子的大小、極性等的不同將其分離開來。,高壓液相色譜層析（HPLC）,泵的結(jié)構(gòu),層析系統(tǒng),層析系統(tǒng)主要由泵、色譜柱、檢測器等組成,HPLC層析系統(tǒng),凝膠電泳（gel electrophoresis）,電泳：帶電顆粒在電場中移動的現(xiàn)象。根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小和所

31、帶凈電荷的不同，利用其在電場中的遷移率差異進(jìn)行分離。,蛋白質(zhì)分子在一定pH的溶液中可帶凈的負(fù)電荷或帶凈的正電荷，故可在電場中發(fā)生移動。 不同蛋白質(zhì)分子所帶電荷量不同，且分子大小也不同，故在電場中的移動速度也不同，據(jù)此可分離蛋白,按裝置上分： 平板電泳（水平式、垂直式） 圓盤電泳：玻璃管中進(jìn)行的凝膠電泳 按支持物分： 紙電泳（或薄膜電泳，如醋酸纖維素膜） 凝膠電泳（聚丙烯酰胺、瓊脂糖凝膠）,常見的電泳方法,凝膠電泳 用凝膠（聚丙烯酰胺、瓊脂糖）作支持物的電泳方法,聚丙烯酰胺凝膠： 單體丙烯酰胺(Acr) N,N-甲叉雙丙烯酰胺(Bis),聚合形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠,以該凝膠為支持物的稱為聚丙烯酰胺凝

32、膠電泳(PAGE),PAGE分為：連續(xù)系統(tǒng) 不連續(xù)系統(tǒng)（濃縮膠、分離膠）,電荷效應(yīng),在pH8.9的分離膠中，各種帶凈電荷不同的蛋白質(zhì)有不同的遷移率。 凈電荷多，則遷移快；反之，則慢。 因此，各種蛋白質(zhì)按電荷多少、相對分子質(zhì)量及形狀，以一定順序排成一個個區(qū)帶，因而稱為區(qū)帶電泳。,分子篩效應(yīng),蛋自質(zhì)進(jìn)入同一孔徑的分離膠后，分子小且為球狀的蛋白質(zhì)分子所受阻力小，移動快；反之，則阻力大，移動慢，從而將各種蛋白質(zhì)開。 大小和形狀不同的蛋白質(zhì)通過一定孔徑分離膠時，受阻滯的程度不同而表現(xiàn)出不同的遷移率，這就是分子篩效應(yīng)。 這種分子篩效應(yīng)不同于柱層析中的分子篩效應(yīng)，后者是大分子先從凝膠顆粒間的縫隙流出，小分子

33、后流出。,垂直板電泳,電泳裝置,圓盤電泳示意圖,SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE） 測定分子量,1967年，Shapiro等人發(fā)現(xiàn)，在聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)中加入一定量的十二烷基硫酸鈉（SDS），則蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于蛋白質(zhì)的分子量，而與所帶電荷無關(guān)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分子量在15200 kDa之間時，樣品的遷移率與其分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系，符合如下方程式： lg Mr = b mR + K (m R 為相對遷移率，b為斜率，K為截距) 當(dāng)條件一定時，b與K均為常數(shù)。,SDS（十二烷基硫酸鈉）是一種陰離子去污劑，可破壞蛋白質(zhì)氫鍵和疏水作用使蛋白質(zhì)變性。 SDS疏水尾巴與氨基酸疏水側(cè)鏈結(jié)合，使得蛋白質(zhì)伸展成長棒狀（短軸1.8nm），其長軸與肽鏈的