分子生物學技術和食源性致病菌的快速檢測.ppt

1、分子生物學技術和食源性 致病菌的快速檢測,與細菌有關的一些分子生物學和 細胞生物學技術; PCR技術; 熒光PCR技術; 相關的一些分子生物學技術在食源性致病菌 的快速檢測技術中的應用; 5. 一實例分析個案,與細菌有關的一些分子生物學和 細胞生物學技術,核酸的抽提與純化(DNA, RNA, 質(zhì)粒DNA等) 相關核酸的鑒定(PCR, 限制性內(nèi)切酶和酶切技術及 產(chǎn)物分析, 重組技術, 探針, Southern blotting, Northern blotting, 芯片技術, 序列分析等) 蛋白質(zhì)的提取與純化 相關蛋白質(zhì)的鑒定(Western blotting, 抗原抗體復合物, 標記技術,芯

2、片技術, 序列分析等) 培養(yǎng)細胞技術(用于細菌毒素測定的MTT方法),核酸的抽提與純化,DNA-微量法(平衡酚, 氯仿,乙醇);大量法(堿 列解); 離心法 RNA 質(zhì)粒DNA -堿變性法, Kit-Qiagen公司 PCR產(chǎn)物- Kit 細菌-直接裂解:釋放出DNA,PCR-聚合酶鏈式反應 （Polymerase Chain Reaction, PCR）,在體外通過酶促反應進行一段特定DNA或RNA片段擴增的 技術為獲取目的DNA片段的一項常規(guī)技術(診斷和檢測) 原理:,PCR一般過程： 1.變性（denaturation）： 加熱使DNA雙螺旋的氫 鍵斷裂,雙鏈解離形成單 鏈DNA。 2.

3、退火（annealling）： 溫度降低時使引物和其 互補的模板在局部形成 雜交鏈。 3.延伸（extension）： 在DNA聚合酶和4種脫 氧核糖核苷酸及Mg2存在 的條件下，催化DNA鏈延 伸反應。,模板DNA 或RNA 一對寡核苷酸引物 4種脫氧核糖核苷酸(dNTPs) 熱穩(wěn)定的聚合酶(Taq)； Mg+緩沖液。,PCR-聚合酶鏈式反應體系,凝膠電泳：經(jīng)溴化乙錠染色，在紫外照射下可見橙紅色的特異DNA擴增帶并可以在圖象成像儀下成像。,PCR-聚合酶鏈式反應產(chǎn)物的檢測,M 1 2 3 4 5 6 7 8 N P,PCR-聚合酶鏈式反應技術的發(fā)展,不對稱PCR 反向PCR 多重PCR 差別

4、PCR 熒光PCR 錨式PCR 重組PCR PCR固相分析 免疫PCR 反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR) 原位PCR,熒光PCR技術(Real Time PCR),熒光是響應于一個短波光的激發(fā)， 一個長波長光被發(fā)射出來 每個熒光分子都有一個最有效的激發(fā)波長 -被激發(fā)的熒光分子越多，發(fā)射的熒光越強,熒光PCR技術(Real Time PCR),PCR + 熒光標記 + 監(jiān)測系統(tǒng),Non-specific DNA binding dyes SYBR Green I Ethidium Bromide Specific Hybridization Probes TaqManTM molecular bea

5、cons dual-oligo FRET pairs,熒光PCR技術(Real Time PCR),R,5 3,3,5,R,R,R,R,SYBR Green I 是一種結合于小溝中的雙鏈DNA染料, 與雙鏈DNA結合后, 其熒光大大增強.,R,R,R,497nm,520nm,熒光PCR技術(Real Time PCR),TaqMan: 雜交探針的互補區(qū)在引物間 5端連有一個熒光reporter, 通常是熒光素 3端連有一個Quencher,通常是TAMRA 熒光素被488 nm光激發(fā)，發(fā)射光為520 nm 520 nm 光能激發(fā)TAMRA，發(fā)射光為570 nm,R,Q,5 3,3,5,R=Re

6、porter Q=Quencher,probe,熒光PCR技術(Real Time PCR),分子 Beacons: 探針有核心的雜交區(qū) 探針有自互補末端 在未雜交時探針呈發(fā)夾狀 報道子, 熒光素在探針的 5 端 猝滅子在探針的3 端,FRET Probes,l,Detection,Extension Step,1. Strand Displacement System Silent,2. Polymerization Complete System Silent,1-5 bases,熒光PCR技術(Real Time PCR),閾值線,CT值,閾值線: 熒光閾值的缺省的設置是3-15個循環(huán)的

7、熒光信號的標準差的10倍. CT值: 各反應管內(nèi)的信號到達設定的閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù).,熒光PCR技術(Real Time PCR),閾值線 CT值,多重熒光PCR技術,FAM VIC HEX TET Cy3 Texas Red ROX Cy5 LC640 Cy5.5 LC705,490nm,660nm,R,限制性內(nèi)切酶和酶切技術及重組,限制性內(nèi)切酶是一類能識別雙鏈DNA分子中特異 核苷酸序列的DNA水解酶. 例如: EcoRI 可以識別 5.G AATTC.3 3.CTTAA G.5 粘性末端 T4連接酶: 重組 酶切與多態(tài)性分析技術,GFP-MIP重組結構,MIP,mip基因是軍團菌的巨嗜細

8、胞感染增強子基因，具高度保守性和嗜肺軍團菌種的特異性。表達的產(chǎn)物mip蛋白是迄今所公認的嗜肺軍團菌毒力因子之一，是嗜肺軍團菌所特有，因此用來鑒定軍團菌具有很強的特異性。,GFP-MIP重組結構,Southern blotting和Northern blotting技術,R6 GFP-ras,-Gp +Gp -Gp +Gp -Gp +Gp -Gp +Gp,4 10 4 10 days,raf (2.5 kb) Actin,28S 18S,主要步驟: DNA(RNA)提取 和純化; 凝膠電泳; 印跡轉(zhuǎn)移; 探針和雜交 顯色,芯片技術,主要步驟: 芯片的制備 DNA(RNA)提取 和純化; 探針的制

9、備 雜交 顯色 結果判讀,芯片技術,-Gp +Gp,芯片技術,T I II III IV C C,登革熱病毒檢測芯片: 通用探針的設計, 合成和篩選, 修飾 分型探針的設計, 合成和篩選, 修飾 預試驗, 樣品的處理; 雜交及洗滌, 條件優(yōu)化等 數(shù)據(jù)庫的建立 應用評價 與多重PCR技術的比較,DNA序列分析,雙脫氧測序(Sanger法) 化學測序(Maxam-Gilbert法) 同位素標記測序 市售商品或公司運作,DNA序列分析,Start-ATTAGACGTCCG A” T G C A ATTAG ATTA ATTAGACG ATTAGA ATTAGACGTCCG AT ATTAGAC AT

10、T ATTAGACGTC ATTAGACGT ATTAGACGTCG A T G C - ATTAGACGTCCG - ATTAGACGTC - ATTAGACGT - ATTAGACG - ATTAGAC - ATTAGA - ATTAG - ATTA - ATT - AT - A,測序凝膠,DNA序列分析(I),DNA序列分析(II),DNA序列分析(III),Western blotting技術,0 2 4 8 0 2 4 8 days,R6 GFP-ras,76 kD 44 kD 44 kD 42 kD,Anti-Raf-1,Anti-Erk,Anti-p-Erk,Anti-Actin

11、,Gp treatment,主要步驟: 蛋白質(zhì)的提取 和純化; SDS-聚丙酰胺 凝膠電泳; 印跡轉(zhuǎn)移; 抗體和雜交 顯色,膠體金檢驗法,氯化金在還原劑作用下, 可聚合成一定大小的金顆粒, 形成帶負電的疏水膠體溶液(膠體金). 膠體金標記就是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包埋過程. 由于金具有高電子密度的特性, 我們可以在顯微鏡下或是在有相應的配體處大量聚集時, 肉眼可見紫色的標記.,C T,C T,C T,C T,霍亂弧菌O1群(O139)快速檢測卡: T-霍亂弧菌O1群(O139)單克隆抗體 C-羊抗鼠抗體,細胞培養(yǎng)技術,細胞培養(yǎng)的一般過程(細胞, 培養(yǎng)基, 實驗室要求的條件等)

12、細胞的復蘇 細胞的傳代 細胞的收獲 細胞的凍存 細胞培養(yǎng)污染的防治 培養(yǎng)細胞的觀察等,MTT Assay,原理: 黃色的Tetrazolium Salt (MTT)在活細胞線粒體SDH酶的作用下, 生成藍色產(chǎn)物. 根據(jù)顏色的濃度來判定活細胞的數(shù)目, 從而推斷受試物的毒性大小.,MTT Assay,g,有關的一些分子生物學技術在食源性致病菌的快速檢測技術中的應用,PCR技術; 引物的設計(kit, 文獻, 自行設計, 原則, gene bank); PubMed: /entrez/query.fcgi 多重PCR; 熒光PCR; 分子分型及相關技術(結

13、合細菌特征基因PCR和限制性片斷長度多態(tài)性分析PCR-RFLP, 核糖體基因分型Ribotyping, 脈沖場電泳Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE), 同源性分析, 溯源和預警等,霍亂CtxA基因的PCR,霍亂CtxA基因的PCR,霍亂CtxA基因的PCR,1 gaattcccgg gttgtgggaa tgctccaaga tcatcgatga gtaatacttg cgatgaaaaa 61 acccaaagtc taggtgtaaa attccttgac gaataccaat ctaaagttaa aagacaatat 121 ttttcagg

14、ct atcaatctga tattgataca cataatagaa ttaaggatga attatgatta 181 aattaaaatt tggtgttttt tttacagttt tactatcttc agcatatgca catggaacac 241 ctcaaaatat tactgatttg tgtgcagaat accacaacac acaaatatat acgctaaatg 301 ataagatatt ttcgtataca gaatctctag ctggaaaaag agagatggct atcattactt 361 ttaagaatgg tgcaattttt caagta

15、gaag taccaggtag tcaacatata gattcacaaa 421 aaaaagcgat tgaaaggatg aaggataccc tgaggattgcatatcttact gaagctaaag 481 tcgaaaagtt atgtgtatgg aataataaaa cgcctcatgc gattgccgca attagtatgg 541 caaattaaga tataaaaaaa gcccacctca gtgggctttt ttgtggttcg atgatgagaa 601 gcaaccgttt tgcccaaaca tgtattactg caagtatgat gtttt

16、tattc cacatcctta 661 gtgcgtatta tgtatgttat gttaaattaa ggcataaaaa gaggtcgcaa accccaatct 721 gctccctatt cttaatccag cattaaacat aactgtattt accataaaat acctaataat 781 catatttatc atttgacaat gttaagtatg attattatgg acattggcac tgtacttacg 841 tcaattgtgt gcaccaaagt g,霍亂CtxA基因,PCR擴增毒力基因所用引物序列及擴增產(chǎn)物分子量,PCR擴增霍亂毒力基因及

17、擴增產(chǎn)物分子量,M 1 2 3 4,Zot ctxA tcpA ace,多重PCR,最早用于缺少基因片斷的檢測; 用于多基因的同時檢測或進行細菌的屬, 種,型以及特異 性基因段的同時檢測; 對豬鏈球菌2型: 檢索Genbank中豬鏈球菌的屬、種及毒力基因的基因序列，利用Primer 5.0軟件設計針對hemolysin gene（溶血素基因）、epf基因、NAD（P）H-dependent glutamate dehydrogenase gene（NAD（P）H依賴性谷氨酸鹽脫氫酶基因）、rmlACBD基因進行引物設計, 以后再按照國家CDC的有關指引補充了針對豬鏈球菌種特異性16S rRNA

18、片段和特異性莢膜多糖基因片段cps2J的特異引物.,多重PCR擴增霍亂毒力基因,M 1 2 3 4 5,Zot ctxA tcpA ace,1000 200,M 1 2 3 4,多重熒光PCR技術及應用,FAM VIC HEX TET Cy3 Texas Red ROX Cy5 LC640 Cy5.5 LC705,490nm,660nm,R,R,Q,5,3,probe,R,Q,5,3,R,Q,5,3,R,Q,5,3,多重熒光PCR技術及應用,沙門氏, 志賀氏; 霍亂弧菌; 副溶血性弧菌, 病原性大腸埃希菌(出血性大腸桿菌O157：H7，致病性大腸桿菌、產(chǎn)毒性大腸桿菌、侵襲性大腸桿菌)，變形桿菌

19、、溶血性鏈球菌、金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯菌、蠟樣芽孢桿菌、小腸結腸炎耶爾森菌; 空腸彎曲菌; 厭氧菌(空彎, 產(chǎn)氣莢膜梭菌, 肉毒梭菌);,分子分型及相關技術,意義: 1.歐洲和美國 等已成立了細菌分子分型國家電子網(wǎng)絡（PulseNet),包括沙門菌、志賀菌、彎曲菌、出血性大 腸桿菌O157：H7、李斯特菌、耶爾森菌和弧菌 ）; 2.國內(nèi)尚無細菌分子分型的數(shù)據(jù)庫和網(wǎng)絡運作系統(tǒng) ; 3.沒有在溯源、食源性疾病(食物中毒)疫情判斷和確認 及預警的實際工作中應用,分子分型及相關技術,近十年來發(fā)展并應用了多種以直接分析基因多態(tài)性為依據(jù)的高分辨率的分子分型系統(tǒng)，包括： 用低頻率（30%）的內(nèi)切酶

20、裂解DNA，通過脈沖場凝膠電泳（PFGE）將切成的大片段分開，根據(jù)條帶的大小及數(shù)量差異來分型的PFGE； 限制性酶切與Southern印跡雜交技術結合，采用rRNA或rDNA序列探針的核糖體基因分型（Ribotyping）； 以PCR為基礎的的限制性片段長度多態(tài)性分析（PCR-RFLP），擴增片段長度多態(tài)性分析（AFLP）、隨機擴增多態(tài)性DNA分析（RAPD）以及多位點序列分型（MLST） DNA測序。,常用基因分型方法的特點,RAPD分析霍亂弧菌的同源性,M 1 2 3 4 5 6 7,利用單一的任意序列的引物，隨機地擴增與靶序列完全或部分配對，以擴增出特異的DNA產(chǎn)物，然后進行瓊脂糖或聚丙

21、烯酰胺凝膠電泳檢測，根據(jù)電泳條帶的不同，即所謂的多態(tài)性就可進行基因定位、連鎖圖建立、品系(種)鑒別等方面。由于該技術具有快速靈敏，程序簡便等優(yōu)點, 因此在短時間內(nèi)，已廣泛應用于生物學研究領域.,聚類分析,凝膠成像系統(tǒng)得到RAPD圖像后，直接在其軟件中根據(jù)Marker及隨機擴增片段在凝膠中的位置計算不同擴增片段的分子量大小，然后采用SPSS統(tǒng)計軟件或其它聚類分析軟件，根據(jù)片段的分子量數(shù)據(jù)進行聚類分析。,同源性分析,M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18,M 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34,2500 2000 1000 750 500 2000 1000 750 500,例一,例二,利用SPSS軟件對前2圖進行聚類分析，根據(jù)遺傳距離的差異，將34株霍亂弧菌分成了2個 聚類群，每個聚類群內(nèi)部菌株的遺傳距離基本相同，反映了這2組菌株的親緣關系較近。,同源性分析,腸桿菌科細菌rRNA 基因的系統(tǒng)發(fā)育樹,16S,23S,核糖體基因分型R