課件：人源性生物制品.ppt

二、人源性生物制品的種類,血液制品 尿液制品 胎盤制品 人體液細(xì)胞中的活性物質(zhì),血液制品的定義：由健康人血漿或特異免疫人血漿分離、提純或由重組DNA技術(shù)制成的血漿蛋白組份或血細(xì)胞組份制品，如人血白蛋白、人免疫球蛋白、人凝血因子、紅細(xì)胞濃縮物等，用于診斷、治療或被動(dòng)免疫預(yù)防。 原料：血漿 現(xiàn)有種類：人血白蛋白，人胎盤血白蛋白，靜脈注射用的免疫球蛋白等十幾種制品。,第二節(jié) 血液制品P102,NP123,血液的組成,50%60%,40%50%,91%92%,8%9%,白細(xì)胞,數(shù)量：(4 - 10)x109個(gè)/L,粒細(xì)胞,淋巴細(xì)胞,單核-巨噬細(xì)胞,一、血液制品的種類 全血 血液成分制品：紅細(xì)胞制劑，白細(xì)胞制劑，血小板制劑，血漿制劑 血漿蛋白制品,國(guó)際上大規(guī)模生產(chǎn)和推廣應(yīng)用的血液制品主要有三類： 白蛋白 各種免疫球蛋白（包括肌注、靜注和各種特異性免疫球蛋白） 凝血因子制劑（主要為F和F濃制劑）。,就我國(guó)目前的血液制品而言，還是以血漿中提純的血漿蛋白制劑為主。 血漿蛋白制品獲得途徑 從健康人血漿或從特異免疫人血漿分離、提純 用重組DNA技術(shù)制備重組血漿蛋白制劑。,廣義的血液成份制品指由全血分離制備而成的各種血液成分制品和血液衍生物制品?，F(xiàn)在血液成分制品主要是指以一單位全血為原料，用簡(jiǎn)單的物理方法，分離制備而成的制品，可直接用于臨床輸注而不需要作進(jìn)一步處理。屬于“單供者制品”這類制品主要有：紅細(xì)胞、血小板、血漿和冷沉淀等。,血液成份制品,血液衍生物,主要指血漿蛋白的衍生物。用復(fù)雜的物理和化學(xué)方法將由許多獻(xiàn)血員采集的混合血漿分離制備而成的血漿蛋白制品。主要有：白蛋白、免疫球蛋白和凝血因子制品等。,懸浮紅細(xì)胞(packed RBC) 洗滌紅細(xì)胞(washed RBC) 去甘油冷凍紅細(xì)胞(Frozen Deglyceride RBC) 新鮮冰凍血漿(Fresh Frozen Plasmce FFP) 冰凍血漿(Frozen Plasmce FP) 去病毒血漿 冷沉淀(cryoprecipitate) 單采血小板(platelet pheresis) 濃縮白細(xì)胞(WBC concertrate) 輻照血,血液成份制品的種類,某院2009年用血一覽表,是全血通過(guò)離心的方法將大部分血漿移去后，加入適量添加劑的紅細(xì)胞成分 主要成份：紅細(xì)胞、添加劑、穩(wěn)定的凝血因子，也含有白血球和血小板但無(wú)功能。 懸浮紅細(xì)胞由于移去了大部分血漿，可減少血漿引起的副作用。由于加入保存液，不僅能更好地保存紅細(xì)胞，還具有稀釋作用，使輸注更流暢。 功能：每單位MAP可提升Hb 5 g/L，可提高血液攜氧能力。 適應(yīng)癥：1、慢性貧血 2、急性失血,添加劑紅細(xì)胞（懸浮紅細(xì)胞、紅細(xì)胞懸液）,優(yōu)點(diǎn)：除去血液中95% 的白細(xì)胞, 可避免因白細(xì)胞凝集所致的發(fā)熱反應(yīng)及避免受血者產(chǎn)生白細(xì)胞抗體, 有效防止非溶血性發(fā)熱性輸血反應(yīng)的發(fā)生。 適用疾病: 臨床應(yīng)用于多次輸血或妊娠, 體內(nèi)產(chǎn)生抗白細(xì)胞或血小板抗體的患者 預(yù)計(jì)需要長(zhǎng)期或反復(fù)輸血的患者 反復(fù)出現(xiàn)原因不明的輸血發(fā)熱反應(yīng) 準(zhǔn)備做骨髓或器官移植的患者; 有免疫缺陷或免疫抑制的貧血患者,去白細(xì)胞的紅細(xì)胞懸液,主要成份：保留了70%以上紅細(xì)胞,去除98% 以上的血漿,90%以上的白細(xì)胞、血小板, 同時(shí)也去除了保存過(guò)程中產(chǎn)生的鉀、氨、乳酸等代謝產(chǎn)物, 功能：每單位可提升Hb 4 g/L。 適應(yīng)證：臨床用于因多次輸血而產(chǎn)生白細(xì)胞抗體的貧血病人，以及器官移植后病人，減少排斥反應(yīng)。,洗滌紅細(xì)胞,單采血小板,主要成份：?jiǎn)我还┭哐“鍧饪s液，含高純度、高濃度的血小板，少量白細(xì)胞 功能：提升血小板計(jì)數(shù) 適應(yīng)癥：防止和糾正血小板功能異常和血小板計(jì)數(shù)減少所造成的嚴(yán)重出血或具有出血傾向的疾病 1.血小板10-20109/L，白血病、癌癥、AA 2.血小板50109/L，具出血傾向的病人 3.血小板70109/L，接受外科手術(shù)的病人 4.血小板100109/L，需要腦部開刀的病人 5.先天性血小板機(jī)能無(wú)力癥,新鮮冰凍血漿 FFP,主要成份：血漿，含所有凝血因子，無(wú)白細(xì)胞和血小板。 功能：補(bǔ)充凝血因子 適應(yīng)癥：心臟手術(shù)后有出血現(xiàn)象或大手術(shù)后有出血現(xiàn)象；大量輸血造成的凝血因子稀釋；溶血性尿毒癥,冰凍血漿 FP,主要成份：血漿，含穩(wěn)定的凝血因子；缺乏因子、；無(wú)白細(xì)胞和血小板 功能：除因子、，其余皆可補(bǔ)充 適應(yīng)癥： 1.燙傷病人 2.Ig缺乏,新鮮冷凍血漿在1-6復(fù)融后留下冰渣狀不溶性成分，高速離心后獲得的白色沉淀物 主要成份：凝血因子、纖維蛋白原 適應(yīng)癥：輕型甲型血友病、血管性血友病、先天性或獲得性纖維蛋白原缺乏癥及因子缺乏癥病人。,冷沉淀,(三）血漿蛋白制品P105，NP126,血漿,水分 92%,蛋白質(zhì) 6-7%,白蛋白（Alb）+免疫球蛋白（IgG）=65%,免疫球蛋白（IgM）+纖維蛋白原（Fg）+補(bǔ)體（C3）+轉(zhuǎn)鐵蛋白（Tr）+巨球蛋白（a2M）+觸珠蛋白（Hp）+a1抗胰蛋白酶（a1AT）+血色素結(jié)合蛋白（Hpx）+a1-酸性糖蛋白G（a1AG）=25%,其它百余種微量蛋白質(zhì)和多肽成份=10%,組成人體血漿的成份：,1. 白蛋白類 2. 免疫球蛋白類 3. 凝血系統(tǒng)蛋白 4. 補(bǔ)體系統(tǒng)蛋白 5. 蛋白酶抑制物類 6.血漿運(yùn)載蛋白類 7.其他血漿蛋白制品,血漿蛋白制品種類：,（一）白蛋白類制劑P105，NP127,1、白蛋白的作用 （1）維持和調(diào)節(jié)血液滲透壓 白蛋白是血漿中含量最高的蛋白質(zhì)，約占血漿總蛋白的一半 多，易大量、高純度地提取。白蛋白產(chǎn)生的滲透壓大而粘度低 ，是最有效的血容擴(kuò)張劑。,（2）為組織提供營(yíng)養(yǎng) 白蛋白能結(jié)合陽(yáng)離子，也能結(jié)合陰離子，故能輸送性質(zhì)不同 的物質(zhì)，如脂肪酸、激素、金屬離子、酶和藥物 （3）運(yùn)輸和解毒 結(jié)合有毒物質(zhì)運(yùn)送至解毒器官，然后排出體外；,白蛋白在肝臟內(nèi)產(chǎn)生。每個(gè)肝細(xì)胞每秒鐘能合成約7000個(gè)白蛋白分子，正常人每天可合成白蛋白15g，而在失血的情況下，合成速率可提高2-3倍。故在肝功能正常，營(yíng)養(yǎng)充足的情況下，白蛋白損失后補(bǔ)充很快，一般喪失400ml血漿，1-2天即可恢復(fù)。,2、白蛋白制劑的種類,目前白蛋白類制劑主要有兩種：人血白蛋白和血漿蛋白成 分，兩者的區(qū)別主要在于含白蛋白的純度不同，前者為 96%以上，后者為83%以上。,（1）人血白蛋白,人血白蛋白是目前國(guó)際上使用最多的血液制品，是經(jīng)低溫乙醇法或經(jīng)批準(zhǔn)的其他分離方法，從健康人靜脈血漿中提純，并經(jīng)6010小時(shí)加溫滅活病毒后制成。有液體和凍干兩種劑型。,（2）血漿蛋白成分,是經(jīng)低溫乙醇或其它適當(dāng)?shù)姆椒ㄌ崛〉难獫{蛋白制劑，一般蛋白質(zhì)濃度為4%或5%，其中白蛋白占83%以上。,2：免疫球蛋白類制品P106，NP127,免疫球蛋白構(gòu)成機(jī)體防御感染的體液免疫系統(tǒng)。 免疫球蛋白種類：IgG、IgA、IgM、IgD、IgE。,正常人免疫球蛋白（肌注免疫球蛋白） 靜脈注射免疫球蛋白 特異性球蛋白,（1）正常人免疫球蛋白,又稱丙種球蛋白或多價(jià)免疫球蛋白(簡(jiǎn)稱丙球)，僅供肌肉注射用，所以又稱肌注免疫球蛋白制劑。是采用低溫乙醇法從大量混合血漿（藥典要求1000人份以上）中分離制得的免疫球蛋白濃縮劑。有液體劑型和凍干劑型兩種。,1、免疫球蛋白制劑的種類,主要作用： 主要用來(lái)預(yù)防一些病毒性感染，如甲肝、丙肝、麻疹等疾病的預(yù)防以及丙種球蛋白缺乏癥的治療。 但是國(guó)內(nèi)濫用正常免疫球蛋白的現(xiàn)象比較嚴(yán)重。一些人認(rèn)為經(jīng)常使用丙種球蛋白可以“增強(qiáng)抵抗力”或“有益無(wú)害”。事實(shí)上濫用丙球不但無(wú)益，而且可能產(chǎn)生免疫依賴等副作用。,是由對(duì)某些病原微生物具有高效價(jià)特異抗體的血漿制備的特異的高效價(jià)免疫球蛋白。與正常免疫球蛋白不 同，此類制劑必須具有至少一種高效價(jià)特異抗體，用 于臨床上特定疾病的預(yù)防和治療。 目前用于臨床的特異性免疫球蛋白有十余種，較常用的如乙肝免疫球蛋白、甲肝免疫球蛋白、破傷風(fēng)免疫球蛋白、狂犬免疫球蛋白、風(fēng)疹免疫球蛋白、抗Rh免疫球蛋白、水痘免疫球蛋白等。,（2）靜脈注射免疫球蛋白 （3）特異性免疫球蛋白,3. 補(bǔ)體系統(tǒng)蛋白制品P107，NP128,補(bǔ)體系統(tǒng)是機(jī)體的主要防御系統(tǒng)之一。 （1）補(bǔ)體系統(tǒng)在細(xì)胞吞噬、調(diào)理、趨化性、細(xì)胞凋亡過(guò)程中起重要作用。 （2）補(bǔ)體系統(tǒng)在自身性免疫疾病中，起著損傷機(jī)體的作用。,4. 凝血系統(tǒng)蛋白制品P107,凝血系統(tǒng)蛋白維持機(jī)體的正常凝血機(jī)制。分為： （1）凝血因子，凝血系統(tǒng)共有13種凝血因子 （2）抗凝血因子。抗凝血因子有纖溶酶原（Pg），當(dāng)它被尿激酶激活之后，就具有溶解血栓的作用。,13種凝血因子,因子1-纖維蛋白原（Fg） 因子2-凝血酶原（FII） 因子3-組織因子（FIII） 因子4-鈣離子 因子5-前加速素，易變因子（FV） 因子6- 因子7-前轉(zhuǎn)化素，穩(wěn)定因子（FVII） 因子8-抗血友病因子（AHF） 因子9-血漿凝血激酶成份（PTC） 因子10-Stuart因子（FX） 因子11-血漿凝血激酶前質(zhì) 因子12-接觸因子（FXII） 因子13-纖維蛋白穩(wěn)定因子（FSF）、激肽酶原（pK）、高分子量激肽酶原（HMW）、纖溶酶原（Pg）、蛋白C（PC）。,由于先天性遺傳缺陷，可發(fā)生各種凝血因子缺乏癥（質(zhì)和量的缺陷）。最常見的是甲型血友?。喝狈σ蜃?；其次是乙型血友?。喝狈σ蜃樱话l(fā)病率約為甲型血友病的1/4；丙型血友病：缺乏因子；一些肝病疾患可引起繼發(fā)性凝血因子缺乏，導(dǎo)致凝血機(jī)能障礙。這些疾患可選用相應(yīng)的凝血因子制劑來(lái)治療。,1、凝血因子類制劑P108,（1）凝血因子的作用,甲型血友病是染色體伴性隱性遺傳病，一般僅為男性患病， 由于血漿內(nèi)缺乏F：C而發(fā)生出血癥狀，臨床表現(xiàn)分為重型 、中型、輕型和亞臨床型，需輸用F制劑進(jìn)行治療,（2）生產(chǎn)方法 目前我國(guó)生產(chǎn)的凝血因子是將健康人新鮮冰凍血漿，經(jīng)批準(zhǔn)的生產(chǎn)工藝制得冷沉淀，然后分離、提純，并經(jīng)病毒滅活處理、凍干制成，稱為“人凝血因子”。,重組F制劑：,是利用基因工程重組技術(shù)獲得的，在美國(guó)已通過(guò)臨床研究，現(xiàn)已投放于市場(chǎng)，用于甲型血友病的治療,2、凝血因子及凝血因子制劑,（1）凝血因子的作用,乙型血友病是先天性的F質(zhì)量缺陷所引起，多為男性患病。乙型血友病可用F制劑進(jìn)行治療。,（2）生產(chǎn)方法 我國(guó)目前生產(chǎn)的凝血因子制劑主要是人凝血酶原復(fù)合物，是將健康人血漿經(jīng)低溫乙醇蛋白分離法或批準(zhǔn)的其它分離方法分離純化，并經(jīng)病毒滅活處理、凍干制成。,(2) 凝血酶原復(fù)合物濃縮劑P108,為一組維生素K依賴性凝血因子、因子、因子、因子 的混合物，主要為因子。 應(yīng)用：多種原因所致出血,(3) 纖維蛋白原制劑,一種糖蛋白，是血漿黏滯性的主要決定因素。 存在于組分 中。 用于低纖維蛋白原血癥治療，可有效糾正因纖維蛋白原缺乏所致的出血。,（4）組織纖溶酶原激活劑,是一種單鏈多肽。 激活纖溶酶原轉(zhuǎn)變纖溶酶，纖溶酶水解纖維蛋白凝塊（纖維蛋白性血栓）成為纖維蛋白降解產(chǎn)物，從而溶解血栓。,（5）蛋白酶抑制劑類制品,1-抗胰蛋白酶：一種糖蛋白。它是血清中最主要的蛋白酶抑制劑，對(duì)凝血酶、尿激酶等其他酶也有抑制作用；也是一種急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，在炎癥性疾患時(shí)，1抗胰蛋白酶可透過(guò)毛細(xì)血管進(jìn)入組織液，在炎癥局部往往濃度很高，對(duì)急性炎性疾病有一定限制作用。,抗凝血酶 ：一種由肝臟產(chǎn)生的糖蛋白，是體內(nèi)的一種重要抗凝物質(zhì)，屬于絲酶抑制蛋白。能不可逆地抑制凝血因子a、a、a、a以及由a與組織因子所形成的復(fù)合體，故具有防止血栓的作用。 用于治療先天性抗凝血酶缺乏癥，獲得性抗凝血酶缺乏（如肝病引起的酶水平降低），或一些血栓性疾病。,2-巨球蛋白：是血漿中分子量最大的蛋白質(zhì)，由肝細(xì)胞與單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)合成。具有酶抑制劑的作用。 抑制炎癥組織釋放的各種蛋白酶，同時(shí)對(duì)不同的病原菌釋放的毒素也起到抑制作用。,6. 血漿運(yùn)載蛋白類,血漿運(yùn)載蛋白是指能夠?qū)C(jī)體的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、代謝產(chǎn)物、激素、藥物進(jìn)行轉(zhuǎn)輸?shù)难獫{蛋白。具體有： （1）白蛋白-轉(zhuǎn)輸脂肪酸、色素、陽(yáng)離子、藥物、VC （2）前白蛋白-轉(zhuǎn)輸甲狀腺素結(jié)合蛋白、視黃醇結(jié)合蛋白 （3）-類脂蛋白-轉(zhuǎn)輸脂質(zhì)、膽固醇、激素 （4）-類脂蛋白-轉(zhuǎn)輸脂質(zhì)、膽固醇、激素 （5）觸珠蛋白-轉(zhuǎn)輸游離血紅蛋白 （6）血紅蛋白結(jié)合蛋白-轉(zhuǎn)輸游離血紅蛋白 （7）轉(zhuǎn)鐵蛋白-將鐵轉(zhuǎn)輸給網(wǎng)織紅細(xì)胞和其它組織 （8）銅藍(lán)蛋白-轉(zhuǎn)輸銅，調(diào)節(jié)銅吸收形成酶 （9）轉(zhuǎn)鈷胺蛋白-轉(zhuǎn)輸VB12 （10）GC球蛋白-轉(zhuǎn)輸維生素D,二、血液制品的安全性P111）,1.可由血液制品傳播的病毒,國(guó)家藥監(jiān)局規(guī)定：血液制品生產(chǎn)工藝必須包括病毒滅活/去除步驟 血漿蛋白制品的生產(chǎn)：包括一步或兩步病毒滅活/去除工藝步驟 病毒滅活/去除方法： 須經(jīng)國(guó)家藥品管理部門批準(zhǔn)后方可使用,2. 血液制品的病毒滅活 / 去除工藝,病毒滅活方法：（1）加熱法,巴氏消毒法（60/10h） 即在600.5連續(xù)加熱10-11小時(shí)。 白蛋白采用這個(gè)方法進(jìn)行病毒滅活，通常是在除菌過(guò)濾、分裝到最終容器以后進(jìn)行加熱處理。通常，為防止蛋白質(zhì)變性，在除菌過(guò)濾前要加入低濃度的辛酸鈉或辛酸鈉與N-乙酰色氨酸作為保護(hù)劑。 幾十年的臨床使用情況證明，采用低溫乙醇法和巴氏滅活方法生產(chǎn)的白蛋白對(duì)肝炎病毒和HIV是安全的。,干熱法 (80/72h),凍干品加熱法 蛋白質(zhì)凍干除去水分以后可以耐受60-80或更高溫度。在80以上加熱可以產(chǎn)生令人滿意的對(duì)HBV、HCV、HIV和HAV的病毒滅活效果。 凍干品加熱法一般多用于凝血因子類產(chǎn)品。由于凍干后病毒也更穩(wěn)定，因此，必須進(jìn)行在規(guī)定條件下的病毒滅活驗(yàn)證。 凍干品加熱法的病毒滅活效果受產(chǎn)品的水分殘留量、組成成分如蛋白質(zhì)、糖、鹽和氨基酸的含量以及冰凍與凍干時(shí)間的影響。 由于病毒滅活對(duì)水分殘留量特別敏感，因此要根據(jù)驗(yàn)證結(jié)果設(shè)置允許的水分殘留限度，并保持瓶間殘留水分的差異處于限度內(nèi)。,（2） 有機(jī)溶劑/表面活性劑 （S/D法）P112,S/D法 磷酸三丁脂（TNBP）(0.3%)+Cholate(0.2%)（30/6h） TNBP(0.3%)/Tween-80(1%)（24/6h） TNBP(0.3%)/Triton-100(1%)（24/46h） 有機(jī)溶劑與去污劑的混合物（S/D）能夠破壞包膜病毒的脂膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致受到破壞的病毒無(wú)法與感染細(xì)胞結(jié)合。但該方法不能滅活非脂包膜病毒。,（3）-丙內(nèi)酯法 P113,-丙內(nèi)酯自1984年作為狂犬疫苗的滅活劑以來(lái)，已被廣泛應(yīng)用于多種人和動(dòng)物疫苗的生產(chǎn)。 但-丙內(nèi)酯可能具有致癌性,（5）低pH法 （pH：.000.20;24,21天）,低pH法 在某些酸性條件下, 脂包膜病毒可以被滅活。免疫球蛋白經(jīng)低pH如pH4）處理，可以有效滅活幾種脂包膜病毒。如在免疫球蛋白生產(chǎn)中，通常采用20-22，pH4.1培育21天。 滅活條件如pH值、孵放時(shí)間和溫度、胃酶含量、蛋白質(zhì)濃度、溶質(zhì)含量等因素，可能影響滅活效果，應(yīng)確定這些參數(shù)允許變化的幅度。,（6）美藍(lán)/熒光照射法 P114,可殺滅大多數(shù)脂質(zhì)包膜病毒 對(duì)非脂質(zhì)包膜病毒殺滅效果不佳,病毒去除方法,層析（離子交換或親和層析） 納米膜過(guò)濾(使用20nm或50nm的膜過(guò)濾。),血液制品常用病毒滅活方法,1.人血白蛋白：巴氏消毒法 （60 / 10小時(shí)） 2.IVIG / IMIG（包括特異性免疫球蛋白）： - 低pH孵放法 （pH4） - 巴氏消毒法 - 低pH孵放法加納米膜過(guò)濾 - 巴氏消毒法加低pH孵放法 - S/D （有機(jī)溶劑 / 去污劑）法 3. 人凝血因子: - S / D法 - S/D法 / 100 、30分鐘， 干熱法：80 、72小時(shí)。,血液制品常用病毒滅活方法,第五節(jié) 人源性生物制品制備實(shí)例P119 NP156,白蛋白又稱清蛋白，白蛋白是血漿蛋白中含量最高、分子量最小、分子數(shù)最多的一類蛋白質(zhì)。 白蛋白對(duì)治療因失血、創(chuàng)傷、燒傷等引起的休克，腦水腫和大腦損傷性所致的腦壓增高，防止低蛋白血癥，肝硬化或者由腎病引起的水腫與腹水等嚴(yán)重疾病具有良好療效。,一、人血漿白蛋白制劑的制備,白蛋白為單鏈分子，由584個(gè)氨基酸殘基組成，N端為天門冬氨酸，C端為亮氨酸，分子量為6.6104，在離子強(qiáng)度為0.15時(shí)，pI為4.7，易溶于水，在60%硫酸銨飽和度以上沉淀。對(duì)酸較穩(wěn)定，受熱變性。 從人體中分離的白蛋白有兩種：一種是從健康人血漿中分離制得的人血白蛋白，另一種是從健康產(chǎn)婦胎盤中分離制得的胎盤血白蛋白。,常用的血漿蛋白分離純化技術(shù) 1、 低溫乙醇沉淀法分離血漿蛋白 （1）原理 在介電常數(shù)大的溶液中，蛋白質(zhì)的溶解度大，在介電常數(shù)小的溶液中蛋白質(zhì)的溶解度就小。乙醇能顯著地降低蛋白質(zhì)水溶液的介電常數(shù)，從而使蛋白質(zhì)從溶液中沉淀析出。 蛋白質(zhì)分子量越大，越先析出；蛋白質(zhì)分子量越小，越后析出,乙醇為有機(jī)溶劑的優(yōu)點(diǎn),化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，毒性低 可與水任意混合，使用方便 易得，易回收，污染小 冰點(diǎn)低，在生產(chǎn)條件下不產(chǎn)生具有爆炸性危險(xiǎn)的氣體混合物 抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，對(duì)病毒有較強(qiáng)的殺滅作用 對(duì)蛋白活性影響小,1. pH 2. 乙醇濃度 3. 溫度 4. 蛋白質(zhì)濃度 5. 離子強(qiáng)度 在五變系統(tǒng)中，對(duì)蛋白分離最重要的變化因素是pH和乙醇濃度。,（ 2）低溫乙醇法中影響蛋白質(zhì)沉淀反應(yīng)的因素,A、pH 當(dāng)pH位于等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度最小，所以最易沉淀 以根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同順序沉淀出不同的血漿蛋白。 通常低溫乙醇法是在pH 4.4-7.4之間進(jìn)行分離.,B、溫度 溫度低，蛋白質(zhì)的溶解度低。 溶液中加入乙醇，因乙醇的水合作用，會(huì)產(chǎn)生放熱現(xiàn)象，而溫度升高可能造 成蛋白質(zhì)的變性，所以在低溫乙醇工藝中，整個(gè)過(guò)程均應(yīng)控制在0-8。如 溫度控制不當(dāng)，輕則會(huì)影響蛋白質(zhì)的得率，重則引起蛋白質(zhì)變性。,C、蛋白質(zhì)濃度 如果溶液的蛋白質(zhì)濃度較大，容易引起多種蛋白共同沉淀，所以在分離過(guò)程中，可將蛋白質(zhì)溶液作適當(dāng)?shù)南♂?，以減少蛋白質(zhì)之間的相互作用，避免多種蛋白共同沉淀，但過(guò)分稀釋，蛋白質(zhì)易變性，同時(shí)增大分離的容量，也不可取。所以應(yīng)選擇適宜的濃度。 在低溫乙醇工藝中，蛋白質(zhì)濃度范圍為：0.2-6.6%,D、離子強(qiáng)度 鹽類與蛋白質(zhì)的互相影響隨離子強(qiáng)度而變化。在低鹽溶液中， 鹽濃度的很小改變即可引起蛋白質(zhì)溶解度的極大變化。離子強(qiáng) 度用r/2表示。 低溫乙醇法工藝中離子強(qiáng)度的變化范圍在0.01-0.16。 正常人血清的離子強(qiáng)度接近于0.15。,E、乙醇濃度 乙醇能降低蛋白質(zhì)溶液的介電常數(shù)，隨著乙醇濃度的增加，蛋白質(zhì)溶液的介電常數(shù)逐漸降低，而其溶解度急劇下降。 在低溫乙醇工藝中，乙醇的濃度范圍在0-40%。,低溫乙醇法優(yōu)點(diǎn),相對(duì)簡(jiǎn)單的操作，產(chǎn)量高，適宜工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。 保持蛋白質(zhì)的天然特性。 抑菌作用。 同時(shí)分離多種血漿成分，適于血漿綜合利用。 乙醇作為主要原材料，價(jià)格低廉，易于獲得。,血漿,Cohn6法工藝流程,Cohn6法工藝流程,（1）離子交換層析 （2）凝膠過(guò)濾層析 （3）親和層析法,層析法,常用層析載體 纖維素（cellulose） 葡聚糖凝膠（Sephadex） 瓊脂糖凝膠（Sepharose） 聚丙烯酰胺凝膠（Bio-gel） 多孔玻璃珠（Bio-Glass）,重組人血白蛋白（補(bǔ)）,人血清白蛋白(human serum albumin，HSA）是迄今為止產(chǎn)量最大、用量最多的血漿蛋白藥物，在臨床和生物產(chǎn)品中的廣泛應(yīng)用使其在國(guó)內(nèi)外均具有很大市場(chǎng)。 由于rHSA批次之間的產(chǎn)品均一度好、純度高、生產(chǎn)規(guī)模不受限制、無(wú)病毒傳播風(fēng)險(xiǎn)，從而賦予其巨大的市場(chǎng)前景。,重組人血白蛋白的種類,輸注用rHSA 輔料級(jí)rHSA 重組白蛋白融合蛋白藥物,天然尿激酶（UK）是由兩條肽鏈通過(guò)二硫鍵連接而成。是絲氨酸蛋白酶，絲氨酸、組氨酸是活性中心必需的氨基酸。血纖維蛋白溶酶原是唯一的天然蛋白質(zhì)底物，使纖溶酶原轉(zhuǎn)為纖溶酶。 尿激酶用于治療各種新血栓形成或血栓梗塞疾病。,二、尿激酶（urokinase）的制備,圖 3-2 尿激酶生產(chǎn)工藝路線,（4）工藝要點(diǎn) 收尿：男性尿，8h內(nèi)處理。調(diào)尿液pH6.5以下。 硅藻土吸附：加入1%的硅藻土，5下攪拌吸附1h 洗脫：硅藻土吸附物用5冷水洗滌后裝柱，當(dāng)洗脫液由清變渾時(shí)開始收集。 除熱原、色素：收集液用飽和NaH2PO4，調(diào)pH8.0，加NaCl調(diào)電導(dǎo)至22ms，過(guò)DEAE-Sephadex A50層析柱，收集流出活性部分。,CMC濃縮：流出液用1mol/L HAc調(diào)至pH4.2，用蒸餾水調(diào)電導(dǎo)至16-17M/，通過(guò)CM-C層析柱。用10倍體積的pH4.2的HAC-NaAc緩沖液洗滌柱床。洗后用0.1%氨水0.1mol/L NaCl溶液洗脫尿激酶。收集活性組分，雜質(zhì)被吸附。 產(chǎn)品質(zhì)量：無(wú)色澄清液或白色凍干粉末。酶活力15000 IU/mg蛋白質(zhì)。,（1）HCG的性質(zhì) HCG是一種糖蛋白，由、兩亞基組成，易溶于水，pI為3.2-3.3。HCG由胎盤滋養(yǎng)層合體細(xì)胞所分泌。婦女妊娠45-70天，尿中HCG含量可達(dá)30.000-50.000IU/24h。 治療女性不育癥，神經(jīng)性皮炎。男性性功能過(guò)低癥和隱睪癥，子宮出血和習(xí)慣性流產(chǎn)。,三、人絨毛膜促性腺激素（HCG）的制備,圖3-3 HCG生產(chǎn)工藝路線,（2） HCG生產(chǎn)工藝路線,（3）工藝要點(diǎn) 吸附粗品：HCl調(diào)孕婦尿至pH4-5，加苯甲酸乙醇飽和液（孕婦尿：苯甲酸乙醇飽和液：乙醇 = 1:0.075:5）攪拌1h靜置2-3h，過(guò)濾，棄濾液，得吸附物。在攪拌下加入95%乙醇，至苯甲酸全部溶解有絮狀沉淀產(chǎn)生，靜置過(guò)夜，離心，沉淀用95%乙醇和丙酮洗滌，干燥得粗制品。,提取：加10倍量的41/15 mol/L、pH4.8醋酸鹽緩沖液，攪拌4h，離心，取上清液。沉淀再提取2h。合并兩次提取液，棄去沉淀。 離子交換層析：CM-Sepharose柱用0.01mol/L的醋酸鹽緩沖液平衡后樣品上柱。依次用pH4.8、0.01mol/L的醋酸鹽緩沖液和pH5.9、0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液洗滌出兩個(gè)峰（雜質(zhì)）。再用pH8.5、0.2mol/L的醋酸鹽緩沖液洗脫，得到的第3峰即為HCG。,羥基磷灰石柱層析：柱用pH6.8、0.5mmol/L磷酸鹽緩沖液平衡。樣品用pH6.8、0.5mmol/L的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行層析上柱。洗脫先用pH6.8、0.5mmol/L再用pH6.8 1.0mmol/L的磷酸鹽緩沖液。得到I、II活性峰。然后冷凍干燥。HCG純品的比活性為10,000-12,000IU/mg蛋白質(zhì)。,（1）性質(zhì)：由活化的淋巴細(xì)胞所產(chǎn)生的，糖蛋白有一個(gè)鏈內(nèi)二硫橋（58位，105位）。等電點(diǎn)為pH6.5。 （2）工藝路線（圖3-4）,誘生白細(xì)胞培養(yǎng)液,0.4mol/L NaCl,PBS,pH6.5,UltrogelACA44柱，pH7.6,圖3-4為IL-2生產(chǎn)工藝路線,四、白細(xì)胞介素-2（IL-2）的制備,（3）工藝要點(diǎn) 誘生：刺激人外周血白細(xì)胞，37培養(yǎng)。 病毒滅活和固液分離：HCl