全反式維甲酸誘導(dǎo)人膽管癌細(xì)胞凋亡的作用.doc

精品論文，值得推薦全反式維甲酸誘導(dǎo)人膽管癌細(xì)胞凋亡的作用 【關(guān)鍵詞】 維甲酸 關(guān)鍵詞: 維甲酸;膽管癌;細(xì)胞分化;脫噬作用 摘 要:目的 研究全反式維甲酸（ATRA）對膽管癌細(xì)胞的生長的影響. 方法 應(yīng)用臺(tái)盼藍(lán)染色、MTT法、光鏡、透射電鏡及流式細(xì)胞儀等檢測ATRA對體外培養(yǎng)的人膽管癌細(xì)胞株QBC939細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用. 結(jié)果 不同濃度的ATRA對QBC939細(xì)胞的增殖均有抑制作用，且量效關(guān)系明顯.但大劑量則主要導(dǎo)致細(xì)胞壞死，以10mol L-1 ATRA的作用效果最好.QBC939細(xì)胞經(jīng)10mol L-1 ATRA處理7d的增殖抑制率可達(dá)到60%.光鏡及透射電鏡下可見細(xì)胞惡性表型向正常發(fā)生逆轉(zhuǎn)，并可觀察到凋亡小體.流式細(xì)胞儀分析顯示，ATRA處理組細(xì)胞周期延遲10%，G1 期比例明顯升高50.5%，S/G2 期比例分別下降39.8%和11.4%. 結(jié)論 A-TRA可抑制膽管癌細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡. Keywords:tretinoin;cholangiocarcinoma;cell differentia-tion;apoptosis Abstract:AIM To study the effects of all-trans retinoic acid on human cholangiocarcinoma cells.METHODS Benzo blue，MTT，scanning and transmission electronic microscop-ic technique and flow cytometric analysis were used to study the all-trans retinoic acid-induced apoptosis in human cholan-giocarcinoma cell line QBC939.RESULTS Different concen-tration of all-trans retinoic acid could inhibit the proliferation of human QBC939cell，which had obvious dose and time ef-fect，but treatment with high dose would induce cell necrosisprincipally，and the appropriate concentration of all-trans retinoic acid was10mol L-1 .After treated with all-trans retinoic acid at10mol L-1 for7d，the proliferation in-hibitory rate of QBC939cells was about60%.Apoptosis was observed through scanning and transmission electronic micro-scope.Flow cytometric analysis demonstrated that the cell cycle of QBC939cells was prolonged by10%after using10-5 mol L-1 all-trans retinoic acid.The G0 /G1 proportion of the cell cycle was significantly increased by50.5%，and the S and G2 here reduced by39.8%and11.4%respectively.CONCLUSION All-trans retinoic acid could suppress the growth and also induce the apoptosis of cholangiocarcinoma cells. 0 引言 全反式維甲酸（all-trans retinoic acid，ATRA）對某些腫瘤細(xì)胞具有增殖抑制作用1 ，可使腫瘤細(xì)胞終末分化，并能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡2，3 .我們以膽管癌細(xì)胞QBC939細(xì)胞為研究對象，探討ATRA對膽管癌細(xì)胞生長的影響及其抗癌機(jī)制. 1 材料和方法 1.1 材料 ATRA購自Sigma公司，臺(tái)盼藍(lán)、四唑鹽（MTT）胰酶購自寶泰克公司，PRMI1640購自Ha-clone公司，小牛血清購自杭州四季清公司.人膽管癌細(xì)胞株QBC939細(xì)胞，由第三軍醫(yī)大學(xué)肝膽外科建立，本室保存. 1.2 方法 人膽管癌細(xì)胞株QBC939在含150mL L-1 滅活小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，于50mL L-1 CO2 ，37條件下傳代培養(yǎng).取細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后備用.將細(xì)胞以3103 孔-1 接種于96孔板，培養(yǎng)24h后加入含100，10，1，0.1mol L-1 A-TRA的培養(yǎng)液，設(shè)空白對照組.每日臺(tái)盼藍(lán)染色，細(xì)胞計(jì)數(shù)板內(nèi)計(jì)數(shù)，繪制細(xì)胞生長曲線. 1.2.1 MTT法 QBC939細(xì)胞接種于96孔板，每孔細(xì)胞均做10個(gè)復(fù)孔.10mol L-1 ATRA處理后，根據(jù)所需要于2，4，7d中止實(shí)驗(yàn)，終止培養(yǎng)前4h加入MTT20L，待細(xì)胞染色后以二甲基亞砜（DMSO）150L溶解，于酶聯(lián)免疫檢測儀測定A490nm 波長的吸光度（A值），計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率. 1.2.2 細(xì)胞形態(tài) 實(shí)驗(yàn)組及對照組QBC939細(xì)胞培養(yǎng)3d后，胰酶消化，PBS洗滌、離心，30g L-1 戊二醛固定，光鏡及透射電鏡下觀察. 1.2.3 流式細(xì)胞儀分析 QBC939細(xì)胞用10-5 mol L-1 ATRA處理后，經(jīng)胰酶消化，700mL L-1 乙醇固定，-4保存?zhèn)錅y.測定時(shí)加50mg L-1 PI染色，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期. 2 結(jié)果 不同濃度的ATRA均對QBC939細(xì)胞增殖有抑制作用，且隨濃度增大，抑制作用越明顯（Fig1）.與對照組比較，1，2組P0.05;3，4組P0.01.但濃度為100mol L-1 導(dǎo)致壞死細(xì)胞明顯增加，以10-5 mol L-1 抑制作用最理想. 圖1 略 2.1 MTT法 10-5 mol L-1 ATRA處理QBC939細(xì)胞，于不同時(shí)間終止實(shí)驗(yàn)，MTT比色法檢測其增生抑制率，2，4，7d分別為10%，35%，60%，呈現(xiàn)明顯的時(shí)間依賴性（Tab1）. 表1 MTT比色法檢測QBC939細(xì)胞增生結(jié)果略 2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué) QBC939細(xì)胞經(jīng)10mol L-1 A-TRA作用24h后，光鏡下見細(xì)胞生長緩慢，細(xì)胞間隙變寬，消化時(shí)間縮短，形狀由長梭形變?yōu)閳A形或橢圓形;透射電鏡下見細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)固縮，成塊狀或半月狀;細(xì)胞質(zhì)濃縮，分泌空泡增加，核蛋白減少，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)基本完好，溶酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較對照組減少;部分細(xì)胞裂成碎片，形成細(xì)胞質(zhì)膜包被的許多大小不等的凋亡小體（Fig2）. 圖2 略 2.3 流式細(xì)胞儀分析 10mol L-1 ATRA作用不同時(shí)間，處理組細(xì)胞周期延遲，G0 /G1 期比例明顯增高，S，G2 +M期下降，導(dǎo)致DNA合成障礙，抑制細(xì)胞增殖，觸發(fā)凋亡（Tab2）. 表2 細(xì)胞周期流式細(xì)胞儀分析結(jié)果略 3 討論 許多抗腫瘤藥物均能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡4，5 .維甲類化合物能抑制多種腫瘤，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡.已被用于腫瘤的防治的多方面研究.全反式維甲酸是第一代維甲類化合物.本結(jié)果顯示，用不同濃度的ATRA處理膽管癌細(xì)胞，可以發(fā)現(xiàn)在一定劑量范圍內(nèi)，QBC939細(xì)胞的增殖呈現(xiàn)濃度和時(shí)間依賴性，10mol L-1 ATRA作用效果最顯著.我們發(fā)現(xiàn)，QBC939細(xì)胞經(jīng)10mol L-1 ATRA作用7d，其增殖抑制率可達(dá)60%.ATRA可使細(xì)胞的某些表型發(fā)生轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡.我們發(fā)現(xiàn)，光鏡下細(xì)胞形狀變化，胞核濃縮深染，細(xì)胞間隙變寬，生長緩慢.電鏡下可觀察到凋亡小體.流式細(xì)胞儀顯示，ATRA主要作用在G1 期和S期，G1 期制造產(chǎn)生rRNA，mRNA，tRNA及核蛋白體，S期是細(xì)胞DNA合成期，G1 期和S期比例減少，導(dǎo)致QBC939細(xì)胞周期延遲或阻滯，DNA合成發(fā)生障礙，從而抑制膽管癌細(xì)胞生長觸發(fā)凋亡機(jī)制. 參考文獻(xiàn): 1Zhou HG，Gu GW.Retinods preventing liver cancer J.Shijie Huaren Xiaohua Zazhi（World Chin J Digestol），1999;7（1）:82-83. 2Yang SX，Wen Y，Zhang XJ，Wang LL，Zhang XB.Growth in-hibiton and apoptosis of human bladder cancer cell line T24in-duced by all-trans retinoic acid J.Zhongliu Fangzhi Yanjiu（Cancer Res prev treat），2000;27（5）:335-337. 3Shao CH，Zhu F，Yan W，Zhao ZL，Cai YB，Wang CJ，Shao GX.Cloning of apoptosis-related genes from prostate cancer cell line DU-145induced by all trans retinoic acid J.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;21（6）:757-761. 4Lu JG，Lin CH，Huang ZQ，Wu JS，F(xiàn)u M，Zhang XY，Liang X，Yao X，Wu RW.Inhibitory effects of recombinant aden-oviruses p53transduction on human cholangiocarcinoma cell line J.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;21（6）:764-766. 5Lu JG，Lin CH，H