柵藻細(xì)胞培養(yǎng)及脂肪體誘導(dǎo)和觀察.ppt

柵藻細(xì)胞培養(yǎng)及脂肪體誘導(dǎo)和觀察,藻類是一類沒有真正的根、莖、葉分化的低等植物，具有葉綠體，進(jìn)行光合自養(yǎng)作用，分布于陸地、水體甚至漂浮于大氣中。在自然界中以單細(xì)胞、群體、絲狀體、異絲體（藻絲由直立枝和匍匐枝組成）、多核體、假薄壁組織狀和薄壁組織狀形式存在，體型大小各異，從幾微米到數(shù)十米。藻類的營養(yǎng)需求相對簡單，只需提供必要的水分、空氣、光照和必需的無機(jī)鹽即可。微型藻類（microalgae）由于個(gè)體微小，其和外界環(huán)境間的物質(zhì)交換效率非常高，能快速吸收營養(yǎng)，高效利用光能，具有生長速度快、光合效率高的特征。很多藻類營養(yǎng)豐富，是理想的食品和保健品的來源，具有較高的開發(fā)和利用價(jià)值。目前商業(yè)化大規(guī)模培養(yǎng)的微型藻類主要有螺旋藻、杜氏藻、小球藻、雨生紅球藻等。螺旋藻藻粉和小球藻藻粉常作為功能保健食品使用，而杜氏藻和雨生紅球藻則分別用來生產(chǎn)類胡蘿卜素和蝦青素，二者作為色素和抗氧化劑使用。很多微型藻類是魚、蝦、蟹和貝類的天然開口餌料，在水產(chǎn)育種和養(yǎng)殖中也很重要。另外，藻類在環(huán)境監(jiān)測和廢水處理中也愈來愈顯示出重要作用。,目前，由于化石燃料日漸減少和不可再生性，尋找和開發(fā)綠色環(huán)保的可再生生物能源日益引起人們重視。藻類由于具有光合效率高、生長快、單位面積產(chǎn)量高、含油量高和培養(yǎng)簡單的特點(diǎn)，符合目前發(fā)展生物能源所提倡的“不與人爭糧，不與糧爭地”的方針，是開發(fā)生物能源的理想材料。藻類中的硅藻、黃藻、金藻和隱藻的同化產(chǎn)物主要是油脂，雖然其他藻類的主要儲(chǔ)藏物是淀粉，但經(jīng)適當(dāng)誘導(dǎo)后，可轉(zhuǎn)化為油脂，特別是中性脂，可用來生產(chǎn)生物柴油。如綠藻中的某些種類經(jīng)誘導(dǎo)后，總脂含量可達(dá)干重的70%，而用于生產(chǎn)生物柴油的中性脂含量可高達(dá)60%以上。,脂肪是生物體內(nèi)儲(chǔ)存和供給能量的重要物質(zhì)，根據(jù)其性質(zhì)可分為中性脂肪、脂肪酸、膽固醇、磷脂等。脂肪不溶于水，易溶于濃酒精、苯、氯仿和乙醚等。因此在制作脂類標(biāo)本時(shí)，多用甲醛類固定劑，用冰凍切片或鋪片法替代石蠟切片，避免破壞脂類。蘇丹染料（蘇丹、蘇丹或蘇丹黑等）是一種脂溶性染料，易溶于酒精但更易溶于脂肪，所以當(dāng)蘇丹染料與含有脂肪的標(biāo)本接觸時(shí)，其即脫離酒精而溶于含脂肪的結(jié)構(gòu)中，將其染色。是顯示脂肪的常用染料，但是在使用時(shí)要注意選擇合適的溶劑，要求既能溶解蘇丹染料，又不破壞脂肪。常用Sudan III的70%酒精飽和液或丙酮和70%酒精等量飽和液將脂肪染為橙黃色。尼羅紅（nile red）是一種親脂性的熒光染料，能與脂類物質(zhì)，包括蠟脂、三酰甘油和游離脂肪酸結(jié)合，在543nm(綠色)激發(fā)光下被激發(fā)出598nm的桔紅色熒光，在450-500nm（藍(lán)青光）激發(fā)光下，則顯示為波長大于528 nm的金黃色熒光。,本實(shí)驗(yàn)將培養(yǎng)的綠藻在高光脅迫和氮素營養(yǎng)缺乏的條件下誘導(dǎo)藻細(xì)胞中的儲(chǔ)藏物質(zhì)由淀粉向脂肪的轉(zhuǎn)變，在此過程中脂肪體由少變多，由小變大，最后形成大的脂肪體（lipid body）分布在細(xì)胞中。分別利用蘇丹III和尼羅紅染色后，在普通光學(xué)顯微鏡和熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。在此過程中藻細(xì)胞的形態(tài)和生化組成發(fā)生明顯變化。,目的要求,了解藻類培養(yǎng)的基本過程和方法。 掌握細(xì)胞內(nèi)脂類染色和淀粉染色的方法。 了解熒光顯微鏡的構(gòu)造并掌握其使用方法。,實(shí)驗(yàn)用品,1器具：培養(yǎng)管、三角瓶、酒精燈、1和10 ml移液管、帶塞試管、量筒、大試管架（放大培養(yǎng)管用）、吸耳球、載玻片、蓋玻片、吸管、通氣管、通氣泵、CO2、1 ml Eppendorf 管。 2材料：二形柵藻（Scenedesmus dimorphus）或小球藻（Chlorella sp.）,BG11 培養(yǎng)基 配制,儲(chǔ)備液1： Mg Na2 EDTA 0.1g/l 檸檬酸鐵銨 0.6g/l 檸檬酸 0.6g/l CaCl22H2O 3.6g/l 儲(chǔ)備液2： MgSO47H2O 7.5g/l 儲(chǔ)備液3： K2HPO43H2O 4.0g/l 儲(chǔ)備液4： NaCO3 2.0 g/l 儲(chǔ)備液5： (微量元素) H3BO3 2.86g/L MnCl24H2O 1.81g/l ZnSO47H2O 0.222g/l CuSO45H2O 0.079g/l COCl26H2O 0.050g/l NaMoO42H2O 0.391g/l 使用時(shí)取10 ml儲(chǔ)備液1、2、3和4、1.5g NaNO3和1 ml儲(chǔ)備液5分別入到蒸餾水中，定容至1L。配制固體培養(yǎng)基時(shí)，在配好的培養(yǎng)基中按1.5%的比例加入瓊脂，加熱溶解后，滅菌備用。,內(nèi)容與方法,1 藻類細(xì)胞的活化和培養(yǎng) 將保存在固體培養(yǎng)基上的藻種用接種針或接種產(chǎn)刮下少許，放到盛有滅菌后BG11培養(yǎng)基的三角瓶中先進(jìn)行活化培養(yǎng)，當(dāng)藻細(xì)胞生長到密度較大時(shí)，即整個(gè)藻液呈濃綠色時(shí)，按1:6的比例轉(zhuǎn)入到通氣管中進(jìn)行通氣培養(yǎng)，為了使藻類生長地更快，可適當(dāng)通入CO2和增加光強(qiáng)。待藻生長到接近平臺(tái)期時(shí)，即可作為藻種使用，取藻種按1:10的比例分別接種到含0.75,0.375,0.188和0.09 g NaNO3/L的BG11培養(yǎng)基進(jìn)行通氣和非通氣培養(yǎng)一周。,2藻類細(xì)胞形態(tài)觀察 一周后觀察生長的柵藻可以發(fā)現(xiàn)在氮源充足條件下培養(yǎng)的藻液呈深綠色，取少量藻樣滴在載玻片上，蓋上蓋玻片觀察，可以看到由柵藻多以2、4、8個(gè)細(xì)胞組成的群體存在。群體中細(xì)胞并列于一條直線上，中間細(xì)胞呈紡錘形或近紡錘形，上下兩端漸尖，直立；兩側(cè)細(xì)胞則成鐮刀形或新月形，極少垂直，上下兩端也逐漸變尖。細(xì)胞內(nèi)可見周生葉綠體和圓形的蛋白核。不經(jīng)尼羅紅染色的樣品在熒光顯微鏡下，則可以看到葉綠體中的葉綠素發(fā)出的火紅色熒光。經(jīng)尼羅紅染色的樣品中少見或不見金黃色的脂肪體。 而經(jīng)高光和低氮脅迫的藻液則變成黃綠色，其中柵藻多以單個(gè)細(xì)胞存在，鮮見形成群體。細(xì)胞中部膨起，長寬比下降，呈豐滿的橢球形，細(xì)胞兩側(cè)的尖端變鈍。細(xì)胞中可見反光較強(qiáng)的區(qū)域，此為脂肪體。經(jīng)蘇丹染色的藻細(xì)胞中可見橘黃色的脂肪體。在熒光顯微鏡下觀察不經(jīng)任何染色的樣品可看到火紅色的熒光減少；經(jīng)尼羅紅染色后，可見大的金黃色的脂肪體出現(xiàn)以及周圍較小的分散存在的紅色葉綠體。,尼羅紅染色,蘇丹III染色,3 蘇丹染色 取0.25ml藻樣加到1ml Eppendorf 管中，加0.25ml 1M HCl,充分混合后，再加入0.25ml蘇丹溶液，搖勻，放入70水浴中30 min，取少量染色后的藻樣滴到載玻片上，加蓋玻片后在普通顯微鏡下觀察?？梢娭颈惶K丹紅染為橘黃色。 4 尼羅紅染色 取0.25ml藻樣加到1ml Eppendorf 管中，加等量體積尼羅紅染液充分混合，70水浴30 mi