系列實驗Ⅰ谷氨酸發(fā)酵.ppt

,系列實驗 液體通氣發(fā)酵谷氨酸發(fā)酵,實驗目的,谷氨酸(Glutamic acid)是最先成功地利用發(fā)酵法進行生產的氨基酸，谷氨酸發(fā)酵是典型的代謝調控發(fā)酵，因此，了解谷氨酸發(fā)酵機理，掌握其發(fā)酵工藝，將有助于對代謝調控發(fā)酵的理解，有助于對其它有氧發(fā)酵，特別是氨基酸發(fā)酵的理解和掌握。,谷氨酸發(fā)酵生理,谷氨酸發(fā)酵包括了谷氨酸的生物合成和產物的結累二個過程,EMP和HMP TCA循環(huán) DCA循環(huán) CO2的固定 氨的導入,谷氨酸的生物合成途徑,實驗室谷氨酸發(fā)酵,一、谷氨酸菌種的制備,培養(yǎng)基 培養(yǎng)基可直接用營養(yǎng)瓊脂，稱取一定量的營養(yǎng)瓊脂， 加熱溶解，分裝到試管中，不能超過試管體積的1/3。 滅菌 將裝有瓊脂培養(yǎng)基的試管高壓滅菌鍋里面 121，高壓滅菌20分鐘。 接種 試管傾斜放置等斜面凝固 超凈臺 開啟三十分鐘后，通風5分鐘后方可進行操作。 從冷凍的菌體中用接種針挑取一定的菌種 ，Z 字型接種到試管斜面上。,注意事項 菌種的污染，勢必導致發(fā)酵的失敗，輕者產酸下降，嚴重的不積累產物，因此，在菌種制備的整個過程中，都要樹立起牢固的無菌概念，工作力求細致、到位,一、谷氨酸菌種的制備,培養(yǎng) 將試管放入28度 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天注意觀察記錄。 擴大培養(yǎng) 斜面生長大約三天左右。菌種開始長出，然后接種到250ml錐形瓶液體培養(yǎng)基中 ，28 150轉 搖床培養(yǎng)。,二、發(fā)酵罐構造的熟悉及空氣管路的滅菌,谷氨酸發(fā)酵是有氧發(fā)酵，發(fā)酵罐由空氣管道、蒸汽管道、水管道和排污管道等組成。,1. 方法：蒸汽滅菌法，事先打開蒸汽發(fā)生器 蒸汽發(fā)生器使用注意：使用時保持進水； 一般保持“自動”位置 2. 調節(jié)壓力0.11Mpa，并保壓30分鐘，在此過程中，時刻注意觀察此壓力。 3. 空氣過濾器的吹干： 事先打開空氣壓縮機； 空氣管道滅菌時間到后，關上排污閥，打開空氣閥，送入空氣吹干過濾器，約需2025分鐘。,三、發(fā)酵罐的空消,控制壓力0.110.12MPa，保壓30分鐘； 空消結束后，打開空氣，保壓0.030.05MPa之間。,一般地，空氣管路可以與發(fā)酵罐一起滅菌。,四、發(fā)酵培養(yǎng)基的配制 按工藝要求配制培養(yǎng)基（課本P88）和40%的尿素。 培養(yǎng)基體積： 理論容積：按發(fā)酵罐容積的70%來定容； 實際定容：按照預定體積的75%來定容，余下的25%留 給蒸汽冷凝水和種子液。 放入pH、OD電極（注意事先要校對） 空消后待罐溫度降低，手摸玻璃視窗不燙手，才可倒入培養(yǎng)基。否則冷熱刺激，玻璃會破裂。,五、實消 （1）先打開進夾套的蒸汽閥和夾套下排水，開啟攪動，待溫度上升到90度時，關閉夾套進汽閥，打開進發(fā)酵罐的蒸汽閥，繼續(xù)升溫到實驗要求。 （2）保壓0.11MPa，105保持5分鐘。 （3）時間到后，關閉進氣閥，打開冷卻水進行冷卻；注意保持罐壓0.030.05MPa （4）溫度降至40度左右時，加初尿，添加量為0.61%,六、接種,緩慢降罐壓至0.01MPa 火焰封口法接種,七、發(fā)酵過程的控制 （1）長菌期：0 12小時，最適溫度3032度，控制pH不大于8.2。 （2）產酸期：12小時后，控制溫度3436度，控制pH在7.17.2。,八、放罐,谷氨酸的等電回收 發(fā)酵罐的清洗,系列實驗 液體靜止發(fā)酵啤酒發(fā)酵,實驗目的,通過啤酒的實驗室發(fā)酵試驗，熟悉無氧發(fā)酵工藝的大致過程，了解啤酒的釀造特點，從而增強對啤酒發(fā)酵的感性認識，為有志于啤酒生產與科研的同學打下基礎。,啤酒發(fā)酵概述,啤酒是一種以麥芽汁為原料，經酵母菌發(fā)酵釀制而成的含酒精飲料。,啤酒發(fā)酵生理學,啤酒的化學組成 啤酒發(fā)酵過程,一 、 啤酒的化學組成,啤酒中所含的成分很多，除水外，還有其它近600種成分，其中主要有： 1、酒精 2、浸出物 3、二氧化碳 4、揮發(fā)性成分,二 、啤酒發(fā)酵過程,酵母菌是一種兼性厭氧微生物，有氧時進行呼吸作用，糖的消耗緩慢，酒精的產量很低，這種呼吸抑制發(fā)酵的現(xiàn)象，稱為巴斯德效應（Pasteur effect）。但在有氧條件下，如果含糖含量過多（葡萄糖濃度超過4g/L時）又會使呼吸受抑，從而促使發(fā)酵的進行，這種現(xiàn)象稱為克拉勃脫效應（Crabtree effect），又稱反巴斯德效應。,啤酒發(fā)酵過程中，酵母主要通過EMP途徑進行酒精發(fā)酵，生成大量乙醇，CO2和微量乳酸，但也有少量糖(約占46)通過HMP途徑，合成NADPH 以及戊糖原料。,三、啤酒發(fā)酵的原料,啤酒發(fā)酵的主要原料是麥芽汁，是由麥芽經粉碎后兌水糖化而成。為了降低成本，大多數(shù)廠家都會適當添加一些輔助原料。另外，為了保證啤酒的品質和口味，麥汁中必須添加一定濃度的酒花。 1. 水 2 . 麥芽：大麥經浸麥、發(fā)芽、烘干、焙焦而成 3 . 輔料：采用富含淀粉的谷類、糖類或糖漿作為輔助原 料 4 . 酒花：利用其苦味、香味、防腐力和澄清麥汁的能力,四、麥汁的制備,主要過程： （1）麥芽和谷物的粉碎； （2）糖化制成麥芽汁； （3）過濾分離麥糟； （4）麥汁煮沸并添加酒花； （5）麥汁預冷卻和冷卻。,1. 麥芽粉碎,目的：使表皮破裂，增加麥芽本身的表面積，使其內容物質更容易溶解，利于糖化。 要求：表皮的破碎要破而不碎。因為表皮的主要組成是各種纖維組織，其中有很多物質會影響啤酒的口味，如果將其粉碎，在糖化過程中，會使其更容易溶解，從而影響啤酒的口味；其次在糖化后的過濾中，可以讓其充當過濾層，達到更好的過濾效果。,2. 糖化制成麥汁,糖化：利用麥芽所含的各種水解酶，在適宜的條件下，將麥芽中不溶性高分子物質（淀粉、蛋白質、半纖維及其中間分解產物），逐步分解成低分子可溶性物質的過程。 過程包括：淀粉分解、蛋白質分解、B-葡聚糖分解、酸的形成和多酚物質的變化。,3.麥汁過濾,目的：糖化結束后，應在最短的時間內，將糖化醪液中的原料溶出物和非溶性的麥槽分離，以得到澄清的麥汁和良好的浸出物收得率。,4. 麥汁煮沸,過濾后的麥汁需進行煮沸并添加酒花。其目的是： A、蒸發(fā)多余水分，使麥汁濃縮到規(guī)定濃度。 B、使酒花有效成分溶入麥汁中，賦予麥汁獨特的香氣和爽口的苦味，提高麥汁的生物和非生物穩(wěn)定性。 C、使麥汁中可凝固性蛋白質凝固析出，以提高啤酒的非生物穩(wěn)定性。 D、使酶失活，主要是停止淀粉酶的作用，以獲得定型的麥汁。 E、對麥汁進行滅菌，消滅麥汁中的各種菌類，特別是乳酸菌。,5.麥汁預冷卻和冷卻 預冷卻：分離煮沸過程中產生的熱凝固物?；匦恋聿凼亲畛Ｓ玫念A冷卻方法。 冷卻：通過麥汁冷卻器，迅速冷卻至發(fā)酵所需的溫度，同時析出冷凝固物（指溫度在70以上為溶解狀態(tài)，但降至70以下開始析出的物質）的過程。,五、啤酒發(fā)酵工藝,冷卻后的麥汁添加酵母后，便是發(fā)酵的開始。啤酒發(fā)酵中麥汁中的可發(fā)酵糖等營養(yǎng)物被酵母細胞中的酶分解成酒精和二氧化碳，并產生諸如雙乙酰、高級醇、醛、酸、酯和硫化物等一系列風味活性物質，將麥汁的風味轉變成啤酒風味。,前發(fā)酵： 一般將發(fā)酵液溫度控制在910左右，發(fā)酵7l0天即成嫩啤酒。 后發(fā)酵：嫩啤酒輸貯酒罐中進行后發(fā)酵（又稱貯酒），一般在03下貯酒4290天，以達到啤酒成熟、二氧化碳飽和和啤酒澄清的目的。,實驗室啤酒發(fā)酵,目的：熟悉靜止培養(yǎng)操作，觀察啤酒發(fā)酵過程，掌握發(fā)酵過程中一些指標的分析操作技能。 原理：啤酒酵母將麥芽汁發(fā)酵，產生酒精等發(fā)酵產物（啤酒）。,實驗步驟：,啤酒酵母擴大培養(yǎng) 培養(yǎng)基的配置 啤酒酵母的培養(yǎng)基選用麥芽汁培養(yǎng)基，具體方法為：稱取麥芽粉 ，比例為4g麥芽粉對應10ml麥芽汁，保證麥芽汁濃度在812。將麥芽粉和水混勻， 在電爐上加熱至 70保持半小時左右。靜置取上清液， 加入2%瓊脂粉，加熱煮沸，攪拌均勻。 滅菌 將培養(yǎng)基液分裝入 若干個試管中，注意不能超過試管體積的三分之一，然后用綿花塞住。放入高壓滅菌鍋 121、20分鐘滅菌處理。,接種 將滅菌好的試管培養(yǎng)基傾斜放置，等斜面凝固。 超凈臺 開啟三十分鐘后，通風5分鐘后方可進行操作。 從冷凍的菌體中用接種針取一定的菌種 Z 字型涂到試管斜面上。 培養(yǎng) 將試管 放入28度 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天注意觀察記錄。 擴大培養(yǎng) 斜面生長大約三天左右。菌種開始長出，然后接種到盛有麥芽汁液體培養(yǎng)基的錐形瓶中， 28度左右培養(yǎng)。,啤酒酵母擴大培養(yǎng),（5）麥汁煮沸：夾套中通蒸汽加熱升溫到100 ，并保溫30min，此過程稱取20克酒花粉碎后加入到煮沸鍋中。 （6）麥汁預冷卻 煮沸的麥汁泵入回旋沉淀槽。 （7）麥汁冷卻（提前打開冰水罐） 將預冷的麥芽汁通過薄板冷卻器進行冷卻,4. 接種,5. 發(fā)酵,將冷卻的麥芽汁輸入到發(fā)酵罐（提前打開預冷到10 ）中。 接種：火焰封口法,前發(fā)酵后發(fā)酵 每天注意觀察溫度、壓力等 注意要控制壓力小于0.1（0.05MPa），否則要排氣，排氣動作要緩。,系列實驗 紅曲菌固體發(fā)酵,系列實驗目的,通過紅曲的制作，了解固體發(fā)酵的大致過程，并學習從紅曲培養(yǎng)物中提取紅色素及其它生理活性物質的方法。,紅曲菌固體發(fā)酵概述,一、紅曲霉的形態(tài)及分類 隸屬于 真菌界 子囊菌門 子囊菌綱(Ascomycetes) 散囊菌目(Plectascales) 紅曲菌科(Eurotiascus) 紅曲霉屬(Monascus)，,二、紅曲霉的生理特性,在合成培養(yǎng)基（葡萄糖5，NaNO3 1， KH2PO4 0.5，MgS04 7H2O 0.25，F(xiàn)eCl3 微量）中，紅曲霉菌株的生長最適溫度是30-35，25以下或40以上生長緩慢。最適pH為3.0-5.0，pH3.0以下生長緩慢，pH5.0以上則不適于產生色素。,紅曲霉能產生醇、酯、酸等多種芳香物質和淀粉酶、蛋白酶、半乳糖酶、核糖核酸酶等多種水解酶類，能賦予發(fā)酵食品優(yōu)質的香氣和甜味，因而是絕佳的釀酒菌種。 紅曲霉產生的次級代謝產物如色素、抗菌素、膽固醇抑制劑等因有特殊的保健功能，近年來已成為人們研究的熱點。,三、紅曲的制作,紅曲古稱丹曲，是紅曲霉生長在蒸煮過的米粒上形成的發(fā)酵食品。,生產工藝流程 說明： 瀝干：一般至含水量25%-30%為止； 蒸煮：至飯粒呈玉色，粒粒疏松，不結團塊。蒸飯不能熟透。 冷卻：至約30即可接種； 培養(yǎng)溫度一般為30，相對濕度RH85%，培養(yǎng)一周后即可。,影響紅曲發(fā)酵的因素 影響紅曲發(fā)酵的因素很多，如菌種、原料、補水、空氣相對濕度(RH)、溫度、通氣狀況等。,（1） 菌種 應選擇生長快，適應性強、產紅色素明顯的菌株。 （2） 原料 選用無粘性的梗米或粕米，其淀粉含量高、營養(yǎng)豐富，且可吸收適量水分。起始水分含量低，紅曲色素易生成；水分含量高，會抑制色素合成。一般米中含水量以25-30為宜；,（3） 補水 生長繁殖過程中需補充適量水分，尤其在生長旺盛期補水更顯得重要。 （4） RH 關系到水分的蒸發(fā)，對發(fā)酵影響很大，一般RH控制在85以上。 （5） 溫度 適宜生長溫度為20-37，通常采用30發(fā)酵。 （6） 通氣 紅曲霉是一種好氣性微生物，培養(yǎng)中要注意保持良好的通氣。,四、紅曲霉的應用,1. 醫(yī)藥上 2. 食品生產上,實驗室紅曲固體發(fā)酵,一、紅曲菌菌種活化及擴大培養(yǎng),培養(yǎng)基的配置 紅曲菌種的培養(yǎng)基選用麥芽汁培養(yǎng)基，具體方法為：稱取麥芽粉 ，比例為4g麥芽粉對應10ml麥芽汁，保證麥芽汁濃度在812。將麥芽粉和水混勻， 在電爐上加熱至 70保持半小時左右。靜置取上清液， 加入2%瓊脂粉，加熱煮沸，攪拌均勻。 滅菌 將培養(yǎng)液分裝入幾個錐形瓶中，包扎好，同時在一個空的錐形瓶中裝入 100到200ml的清水。準備若干個培養(yǎng)皿用報紙包扎好。全部放入高壓滅菌鍋 121度 滅菌20分鐘。,接種 1、超凈臺 開啟三十分鐘后，通風5分鐘后方可進行操作。 2、在超凈臺下，選取菌種，取黃豆大的一小塊放到無菌水中(冷卻到60)。 3、在60的水浴鍋中水浴30分鐘 （殺死其它菌種，與其它菌相比紅曲能耐高溫）。 4、待裝有培養(yǎng)基的錐形瓶冷卻到70左右時，用移液搶吸取1到3ml（貼上標簽） 溶有菌種的菌液 注入到 錐形瓶中，然后倒入培養(yǎng)皿中，20ml 左右。 5、等到培養(yǎng)基凝固然后將培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)。 培養(yǎng) 將培養(yǎng)皿倒置 放入30 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 每天注意觀察記錄，及時取出染菌培養(yǎng)皿。,（1）制曲原料：優(yōu)質秈米。 （2）浸米：25以上浸米5-8h，大米吸水分約在28-30。 （3）蒸飯：將浸好的米用清水淋去米漿水，瀝干，即可蒸飯。上汽火力要強，待全部圓氣以后蒸料3-5min，出飯率在135，飯粒呈玉色，粒粒疏松，不結團塊。蒸飯不能熟透。,二、實驗室紅曲固體發(fā)酵,（4）攤涼接種：將蒸熟的曲料倒在干凈的地方，迅速打碎團塊，攤平冷卻到30-32。然后，每50kg米接種紅曲醪0.5kg（1%），混合均勻，再充分翻拌2-3次，操作要迅速，以減少雜菌污染。待冷卻到30-3l，即可堆料。 （5）堆料：當菌種移植于新的培養(yǎng)基時，需要一段時間才能適應新環(huán)境，在室溫25-30時，一般經15-18h，品溫可升到43-45，此時從中心取出的飯粒有白色斑點，伴有微微清香氣，此時即可進行發(fā)酵。,（6）發(fā)酵：將曲料攤在曲池上，厚度約50cm。開始時升溫較快，經2h上升到40時即可開耙，耙后品溫下降2-3。由于菌種繁殖力的加快，需將堆料厚度降至26cm左右，再經過1h，品溫繼續(xù)上升至37-38，再行開耙，繼續(xù)降低厚度至13-17cm，維持品溫在35-36，進行養(yǎng)花。再經8h左右，飯粒表層粒粒呈白色斑點。,（7）吃水與培育：花齊以后，將曲堆厚度調整為33-50cm，品溫維持在32-33，使菌絲大量繁殖。每隔lh拌曲一次，經27h左右，飯粒表面菌體增厚、曲粒表面略有干皮、少數(shù)曲粒略有微紅斑點時即可吃水，使曲粒吸收一定水分，以利菌絲逐漸向內生長。 吃水方法：一邊拌曲一邊向曲池中噴曬無菌水（涼開水），使曲粒表面潤濕并微脹。攤成17-23cm厚，待品溫上升至36-37，將