16SrRNA靶向變性梯度凝膠電泳指紋圖譜分析微生物菌群

最近看到一本書環(huán)境基因組學(xué)實(shí)驗(yàn)指南其中第十七章題目為“16S rRNA靶向變性梯度凝膠電泳指紋圖譜分析微生物菌群”，它作為一個(gè)實(shí)驗(yàn)技術(shù)寫進(jìn)實(shí)驗(yàn)書里，比看期刊，論文更有所幫助。我將這一章編寫的內(nèi)容全部敲下來給你，希望對(duì)你的實(shí)驗(yàn)有所啟示和幫助。第十七章16S rRNA靶向變性梯度凝膠電泳指紋圖譜分析微生物菌群概論 過去幾十年中，利用所謂的生物標(biāo)記物來檢測環(huán)境樣本中的微生物菌群的分子微生物生態(tài)學(xué)（molecular microbial ecology）得到了快速的發(fā)展。許多分子可以作為生物標(biāo)記物，包括細(xì)胞壁成分、蛋白質(zhì)、脂類、DNA或RNA，尤其是核糖體RNA（rRNA）小亞基和相應(yīng)基因的應(yīng)用在微生物生態(tài)學(xué)的發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用。目前已經(jīng)建立了幾種應(yīng)用于環(huán)境樣本中的微生物群落的指紋特征分析方法，其中最常用的方法是PCR擴(kuò)增片段的變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE），DGGE可以根據(jù)序列將相同長度的DNA片段混合物分開，分離的原理使基于DNA片段在含有梯度變性化合物（通常是尿素和甲酰胺的混合物）配置的聚丙烯酰胺凝膠中的序列特異性融點(diǎn)不同實(shí)現(xiàn)的。DGGE能對(duì)微生物群落進(jìn)行快速的分析和比較，利用DGGE可使組成的多樣性一目了然，其中每一條帶原則上代表一種細(xì)菌系群，染色后，在凝膠中DNA分子停止遷移的位置會(huì)看到條帶，理論生，DGGE指紋圖譜可以區(qū)分一個(gè)堿基對(duì)的差別。關(guān)鍵詞：食本芽孢桿菌（Bacillus benzoevorans）；DGGE；指紋圖譜；16S rRNA基因；土壤微生物1. 引言微生物菌群對(duì)于地球上甚至地球外的幾乎所有環(huán)境的發(fā)展和功能是至關(guān)重要的，而針對(duì)一系列細(xì)胞生物標(biāo)記物的分子微生物生態(tài)學(xué)方法的長足發(fā)展，使得對(duì)微生物群落組成和功能的檢測可以不依賴于微生物的培養(yǎng)（1，2）。靶向生物標(biāo)記物可以是在不同的分類水平表明特定微生物種存在的任何生物成分，包括細(xì)胞成分如細(xì)胞壁成分、蛋白質(zhì)、脂類、DAN或RNA。即使細(xì)胞死亡后這些分子仍可以被檢測到。這使得我們可以研究微生物群落并追蹤其在不斷變化的環(huán)境條件下的發(fā)展過程，所以包括歷史標(biāo)本，儲(chǔ)存的樣本（風(fēng)干保存用于后續(xù)分析的樣本）甚至考古樣本這些不可能用培養(yǎng)的方法獲得微生物的材料都可以得到研究（3-5）。微生物生態(tài)學(xué)可以很方便的應(yīng)用核糖體RNA小亞基（SSU rRNA；細(xì)菌和古細(xì)菌的16S rRNA，真核生物的18S rRNA）和對(duì)應(yīng)的基因作為生物標(biāo)記物。以這些分子作為靶點(diǎn)，可以利用很多互為補(bǔ)充的分子技術(shù)來檢測不同環(huán)境下總的細(xì)菌、古細(xì)菌和真核生物群落，以及特定的感興趣的微生物種類。多以SSU rRNA基因檢測作為普遍的系統(tǒng)發(fā)育標(biāo)記物的分子指紋圖譜方法，常被用于在分子微生物生態(tài)學(xué)中快速檢測不同時(shí)間或空間中微生物群落組分的變化，結(jié)合數(shù)理統(tǒng)計(jì)分析，這些技術(shù)是研究不斷變化的環(huán)境因子如何影響微生物群落構(gòu)成的有力工具（6,7）。幾種類型的梯度凝膠電泳已經(jīng)被有效地應(yīng)用于環(huán)境樣本中微生物群落的觀察。最常用的是變性梯度凝膠電泳（DGGE）和溫度梯度凝膠電泳（temperature gradient gel electrophoresis，TGGE），而最新出現(xiàn)的是結(jié)合了DGGE和TGGE的主要原理的時(shí)間溫度梯度凝膠電泳。DGGE在微生物生態(tài)系統(tǒng)的首次應(yīng)用是在對(duì)海洋生態(tài)系統(tǒng)中的細(xì)菌多樣性分析（9）。凝膠電泳技術(shù)在快速比較不同環(huán)境中個(gè)微生物群落和檢測某一特定的群落在不同時(shí)間多個(gè)成員內(nèi)的組成變化的研究中非常有效。DGGE是一種利用序列差異來分離同樣長度DNA片段混合物的技術(shù)（10）。分離的原理是基于DNA片段在含有梯度變性化合物（通常是尿素和甲酰胺的混合物）配置的聚丙烯酰胺凝膠澳中的序列特異性融點(diǎn)不同實(shí)現(xiàn)的，在5端引入GC夾（GC-Clamp）可保護(hù)DNA片段不會(huì)完全變性。這個(gè)GC夾有3050bp長，是在進(jìn)行DGGE分析之前加到對(duì)靶基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增的一個(gè)引物上的，理論上，在不長于500bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物上的單個(gè)堿基對(duì)差異都可以被鑒定出來，在變性梯度中，不同序列的片段將停留在不同的位置。2. 材料2.1 利用試劑盒（Fast DNA SPIN Kit）分離DNAFast DNA SPIN Kit（用于土壤）（Q BIOgene，Cambs，United Kingdom）是商品話的DNA分離試劑盒，在實(shí)驗(yàn)室中常用于廣泛的環(huán)境介質(zhì)檢測，包括土壤、沉積物、排泄物。也可用于其它DNA分離方法。2.2 PCRPCR可以用Taq聚合酶在PCR儀上進(jìn)行。不加模板DNA，先準(zhǔn)備基本組分按照實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的試劑需要準(zhǔn)備的基本組分就是Mix和上、下游引物及超純水。根據(jù)大多數(shù)文獻(xiàn)采用的量和濃度去加。：1、5L10PCR緩沖液（10緩沖液：200mmol/L Tris-HCl，pH8.4，500mmol/L KCl）2、3L MgCl2（50 mmol/L）3、1L上游引物（10 mmol/L）4、1L下游引物（10 mmol/L） 5、1LdNTP（10 mmol/L）6、0.25LTaqDNA聚合酶（5U/L）7、37.75LMilliQ水共49L的反應(yīng)體積。配制時(shí)將上面的每一組份乘以需要的反應(yīng)次數(shù)，多加一份。分裝在0.2mLPCR管（每管49L）中，最后加入模板DNA（1L）.每一反應(yīng)中最終模板的量在10100ng之間。將離心管放入PCR儀中，開始按設(shè)定的反應(yīng)擴(kuò)增。2.3 DGGE2.3.1 DGGE儀器設(shè)備部分1、大小玻璃板2、Gelbond（膠貼）3、Bio-Rad DGGE設(shè)備，包括：a溫度控制模塊包括加熱器、攪拌器、泵和電泳導(dǎo)線。b電泳槽c三明治芯d三明治夾e分隔條f梳子4、電源5、泵和混合槽2.3.2 DGGE電泳1、變性劑（100%變性劑、0%變性劑）根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求選擇合適的變性劑濃度（一般為30%60%），實(shí)驗(yàn)所用試劑均用超純水進(jìn)行配制，需過濾或滅菌的應(yīng)按照要求進(jìn)行。有些藥品的保存期也是有限制的，盡量用新配制的溶液。試劑保證不能配錯(cuò)。2、50TAE緩沖液：242gTris，57.1mL冰乙酸，100mL0.5mol/LEDTA，pH8.0。2.3.3 DGGE染色溶液根據(jù)自己的選擇用染色液對(duì)凝膠進(jìn)行染色。3. 方法DGGE是在分子微生物生態(tài)學(xué)中建立的較完善的分子指紋圖譜技術(shù)（11,12）。DGGE技術(shù)可以迅速地分析微生物群落。復(fù)雜的微生物群落可以利用DGGE達(dá)到可視化，理論上其中每一條帶代表一細(xì)菌種系型，然而，此技術(shù)的缺陷在于只利用了非常有限的遺傳信息（16S rRNA）。DGGE的原理使利用序列特異性將同樣長度的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分開。雙鏈DNA在變性作用下解離。DNA在電場中向正極移動(dòng)，在特意向序列（兩條核苷酸鏈解離）決定的特定位置溶解。在擴(kuò)增過程中，PCR產(chǎn)物的5或者3端引入了GC夾，以避免完全變性，最終形成的叉狀結(jié)構(gòu)實(shí)質(zhì)上發(fā)揮了阻止遷移的作用。染色后，可以在DNA分子在凝膠中停留遷移的位置觀察到條帶。理論上，DGGE指紋圖譜可以區(qū)分單個(gè)堿基對(duì)的差異。3.1 DNA分離DNA可用Fast DNA SPIN Kit（用于土壤）（Q BIOgene，Cambs，United Kingdom）直接從土壤中（或其他樣本）按照說明書進(jìn)行分離。這種試劑盒可高效裂解所有的微生物，包括原來比較難處理的如細(xì)菌芽孢和內(nèi)孢子、革蘭氏陽性細(xì)菌、酵母、藻類、線蟲和真菌。3.2 PCR程序下面是針對(duì)表1的引物優(yōu)化后的PCR循環(huán)參數(shù)，選擇專門對(duì)應(yīng)你處理的物種適合的程序。1. 細(xì)菌群落DGGE-PCR：預(yù)變性2min95變性30s9535個(gè)循環(huán)雜交40s56延伸1 min72后延伸5 min722. 古細(xì)菌DGGE-PCR：預(yù)變性5min94變性30s9435個(gè)循環(huán)雜交40s52延伸1 min68后延伸5 min683. 原核菌群DGGE-PCR：預(yù)變性5min94變性30s9435個(gè)循環(huán)雜交45s56延伸130s72后延伸10 min723.3 DGGE-PCR引物表1提供了一組普遍的和種群特異性的DGGE-PCR引物（見注釋3）。表1 不同微生物菌群常用的DGGE-PCR引物引物序列參考文獻(xiàn)細(xì)菌（17）Bact-968-GC-F5-cgc ccg ggg ggc gcc ccg ggc ggg gcg ggg gca cgg ggg gaa cgc gaa cct tac3（17）L1401-R5-gcg tgt gta caa gac cc-3（18）Bact-0357-F-GC5-ccg ggg gcg cgc ccc ggg cgg ggc ggg ggc acg ggg ggc cta cgg gag gca gca g-3（18）Bact-0158-R5-att acc gcg gct gct gct-3（18）Bact-0954-F-GC5-cgc cgg ggg cgc gcc ccg ggc ggg gcg ggg gca cgg ggg ggc aca agc ggt gga gca tgt gg-3（18）Bact-1369-R5-gcc cgg gaa cgt att cac cg-3（18）古細(xì)菌Arch-109-F5-act gct cag taa cac gt-3（19）Uni-515-GC-R5-cgc ccg ggg cgc gcc ccg ggc ggg gcg ggg gca cgg ggg gat cgt att acc gcg gct gct ggc ac-3（20）真核生物Euk1A5-ctg gtt gat cct gcc ag-3（21）Euk516r-GC5-cgc ccg ggg cgc gcc ccg ggc ggg gcg ggg gca cgg ggg gac cag act tgc cct cc-3（21）3.4 DGGE3.4.1 凝膠“三明治”制備（見注釋4）1.用肥皂清洗大、小玻璃板，干燥后用95%乙醇清洗（見注釋5）。2.切除大小和大玻璃攪拌一樣的膠貼（見注釋6）。3.在大玻板表面上加一些水。4.將膠貼的疏水面放在玻板上（你可以滴一滴水在膠貼上來方便地檢查疏水面，疏水面的水將滑落）。5.用滾筒固定膠貼后移去紙保護(hù)層。6.用紙巾輕輕吸干膠貼。7.用95%乙醇清洗分隔條，并放于膠貼的左右兩側(cè)。8. 將小玻板放在上方。9.用夾子夾住玻板“三明治”，并放入“三明治支架”10.按下襯墊，并擰緊壓板的螺絲。11.將玻璃“三明治”放在橡膠密封墊上，并按下手柄。12.用移液器加入凝膠“塞”。3.4.2 凝膠“塞”制備在制備主要的分析梯度凝膠前，需在DGGE玻板盒底部做一個(gè)0%變性劑PAG凝膠“塞”防治底部泄露。制備凝膠“塞”的主要方法如下：1. 確保凝膠架處于水平；必要時(shí)調(diào)節(jié)底部的螺絲。2. 如下制備“塞”溶液（一塊凝膠體積）：1.5mL 0%變性劑，8%PAG溶液4.5L TEMED15L 10%APS3. 通過橡膠密封墊一邊加入1mL“塞”溶液（見注釋7）。4. “塞”溶液放置10min。5. 灌入梯度凝膠和濃縮膠。3.4.3 制備凝膠1.從低到高濃度梯度寧驕傲和濃縮膠按表2混合配制，操作在冰上進(jìn)行（見注釋8）。2.用軟化水清洗梯度制備儀和連接管道，打開泵（流速為19mL/min），抽干系統(tǒng)。3.關(guān)閉梯度植被以各室之間的開關(guān)。4.用紙巾吸干各室。5.當(dāng)凝膠溶液冷卻后，加入10%APS至高濃度和低濃度的變性劑溶液。6.在右室加入高濃度溶液，在左室加入低濃度溶液。7.開始攪拌，打開開關(guān)，并立即啟動(dòng)泵保持流速4.5mL/min。8.將針頭放于兩塊玻璃板間。9.當(dāng)凝膠灌注結(jié)束后，關(guān)掉泵，轉(zhuǎn)移至Erlenmeyer燒瓶。10.用軟化水清洗各室，啟動(dòng)泵抽干系統(tǒng)。11.加10%APS到濃縮膠中。12.關(guān)掉各室間的開關(guān)，在右室加入濃縮膠。13.將針頭放于兩塊玻璃板間，啟動(dòng)泵，保持流速為3 mL/min。14.灌完濃縮膠后，插入梳子，讓其凝固形成加樣孔。避免氣泡產(chǎn)生，否則會(huì)在條帶中出現(xiàn)凹陷。15.凝膠放置聚合1h。表2 DGGE梯度混合比例表梯度/%0%(mL)100%(mL)終體積(mL)TEMED(L)APS(L)09-91350309.13.9131350318.974.03131350328.844.16131350338.714.29131350348,.584.42131350358.454.55131350368.324.68131350378.194.81131350388.064.94131350397.935.07131350407.85.2131350417.675.33131350427.545.46131350437.415.59131350447.285.72131350457.155.85131350467.025.98131350476.896.11131350486.766.24131350496.636.37131350506.56.5131350516.376.63131350526.246.76131350536.116.89131350545.987.02131350555.857727.28131350575.597.41131350585.467.54131350595.337.67131350605.27.81313503.4.4電泳1.在電泳槽中加入0.5TAE緩沖液。2.在電泳前至少90min打開Dcode，以便緩沖液在60達(dá)到平衡。3.在1h的聚合后，輕輕拔出梳子。4.用軟化水清洗孔內(nèi)和孔上未聚合的凝膠，并輕敲“三明治”。5.關(guān)掉Dcode，打開蓋子。6.拿出“三明治”，放入電泳槽中。7.打開Dcode，直至上緩沖室充滿緩沖液。8.關(guān)掉Dcode，打開蓋子。9.用充滿緩沖液的注射器和針頭清洗所有加樣孔。10.在加樣孔中加入樣品（見注釋10）。11.蓋上蓋子，后打開Dcode。12.打開電源，200V電泳10min，調(diào)至85V再電泳16h。3.5 凝膠染色（見注釋11和