DBS45 023-2015 食品安全地方標準 水牛乳及其制品中摻入牛屬乳的定性檢測 PCR法.doc

ICS點擊此處添加ICS號點擊此處添加中國標準文獻分類號DBS45廣西壯族自治區(qū)地方標準DBS 45/02320154食品安全地方標準 水牛乳及其制品中摻入牛屬乳的定性檢測PCR法（報批稿）（審定稿報批稿）2014 2015 - XX 03- XX05發(fā)布2014 2015 - XX 04 - XX05實施廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生計生委廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生和計劃生育委員會 發(fā)布發(fā)布 DBS 45/02320154前言本標準按照GB/T 1.12009的格式編寫。本標準由廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生和計劃生育委員會提出。本標準起草單位：廣西壯族自治區(qū)水牛研究所、廣西壯族自治區(qū)分析測試研究中心。本標準起草人：曾慶坤、林波、黎穎、李玲、盧安根、杜寒春、巫堅、黎德全、黃麗、劉永強。10水牛乳及其制品中摻入牛屬乳的定性檢測 PCR法1 范圍本標準適用于水牛乳及其制品中摻入牛屬乳的 PCR 定性檢測。2 規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T 19495.2-2004 轉基因產(chǎn)品檢測實驗室技術要求GB/T 6682-2008 分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法3 術語和定義3.1水牛乳水牛屬動物（Bubalus bubalis ）乳腺分泌產(chǎn)生的乳白色液體物質(zhì)。3.2牛屬乳牛屬動物（Bos taurus），包括荷斯坦和娟姍牛乳腺分泌產(chǎn)生的乳白色液體物質(zhì)及其制品。3.3水牛乳制品以生水牛乳為原料，經(jīng)過相應工藝加工制成的液態(tài)乳、發(fā)酵乳和干酪等各種產(chǎn)品的總稱。3.4PCR(聚合酶鏈反應)聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction, PCR）是一種在體外快速擴增特定基因或DNA片段的方法。由“熱變性復性延伸”三步反應組成一個PCR循環(huán)，經(jīng)過多次循環(huán)反應，使目標DNA得以大量擴增。3.5特異性引物針對特定模板 DNA 片段設計的兩段與模板兩端分別互補的一對寡核苷酸序列，在PCR反應中與模板 DNA 兩端分別特異性結合。3.6 陽性摻入對照從生水牛乳與生牛屬乳比例為1：1的混合乳中按照6.1.1的操作提取得到的總DNA，按照6.3的PCR程序擴增后，經(jīng)電泳檢測會在220bp和346bp位置各出現(xiàn)一條電泳條帶。3.7 陰性摻入對照從生水牛乳中按照6.1.1的操作提取得到的總DNA，按照6.3的PCR程序擴增后，電泳檢測僅在220bp位置出現(xiàn)一條電泳條帶。3.8陰性質(zhì)控對照在PCR擴增時，用雙蒸水代替模板，其它操作相同。4 方法原理采用DNA提取試劑或試劑盒，提取樣品中的DNA，以提取的DNA為模板進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，對比DNA標準分子量條帶，檢驗PCR產(chǎn)物是否有大小為220bp的水牛特異性條帶或346bp的牛屬特異性條帶，特異性條帶的核苷酸序列信息見附錄A，從而對水牛乳或水牛乳制品中是否摻入牛屬乳進行檢驗和判斷。5 試驗材料5.1 特異性引物根據(jù)12S rRNA基因的核苷酸序列設計引物，其中一條為水牛與牛屬牛12S rRNA的通用引物，另兩條分別為擴增水牛12S rRNA基因與牛屬牛12S rRNA基因的特異性引物，擴增水牛12S rRNA基因片段大小為220bp ，擴增牛屬牛12S rRNA基因片段大小為346bp。引物序列見附錄 B.1，使用前先用滅菌雙蒸水稀釋，引物稀釋后分裝成小劑量置于 -20 保存?zhèn)溆谩?.2 試劑除另有規(guī)定外，所用生化試劑均為分析純，水為符合GB/T 6682-1992的滅菌雙蒸水或超純水。5.2.1 DNA抽提試劑酚-氯仿-異戊醇法抽提DNA試劑如下:消化緩沖液（10 mmol/L Tris-Cl，pH7.6；2 mmol/L EDTA，pH 8.0；0.5% SDS；75 mmol/L NaCl）；20mg/mL 蛋白酶K；Tris飽和苯酚；氯仿；3 mol/L 乙酸鈉；無水乙醇；異丙醇；75%乙醇；TE緩沖液(10 mmol/L Tris-Cl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0)。或用等效的食品專用DNA抽提試劑盒。5.2.2 PCR 試劑、電泳試劑、其它試劑Taq DNA 聚合酶；dNTPs混合物：包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP；MgCl2；或 PCR Mix試劑盒。核酸染料GelRed；6DNA電泳上樣緩沖液；1倍Tris-硼酸電泳緩沖液。滅菌雙蒸水；1 mol/L 滅菌 PBS，pH7.4。5.2.3 試劑配制方法試劑配制方法見附錄 C。5.3 儀器設備及耗材5.3.1 儀器設備PCR 儀；電泳儀；電泳槽；核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計；凝膠成像系統(tǒng)；低溫離心機；小型高速離心機；水浴鍋；旋渦振蕩器；掌上離心機；微量加樣器：100L1 000L、20L200L、10L100L、0.5L10L和0.1L2.5L等多種規(guī)格。5.3.2 一次性耗材一次性PE手套；離心管：1.5mL；PCR反應管：0.2mL；吸頭：1 000L、200L、10L等多種規(guī)格。6 操作程序6.1 待檢樣品的DNA抽提6.1.1 生水牛乳及液態(tài)水牛乳制品樣品的DNA提取取50mL乳樣于50mL離心管中，2500r/min離心20min，用小勺撇去離心管上層的乳脂，再用吸管將上清液吸出，保留最底部的沉淀，用無菌棉球或棉簽擦除離心管壁上殘存乳脂；然后向離心管中加入20mL pH7.4的PBS，輕輕敲打離心管使沉淀懸浮，2500 r/min離心20 min，用吸管將上清液吸出，保留最底部的沉淀，再用無菌棉球擦除離心管壁上殘存乳脂；如果乳脂殘存過多，再次重復向離心管中加入20mL pH7.4 PBS、離心、除脂的操作步驟；最后將上清液吸出，保留最底部的沉淀；按照食品專用DNA抽提試劑盒中步驟抽提DNA。DNA提取除采用試劑盒外，也可采用酚-氯仿-異戊醇法(用酚-氯仿-異戊醇法提取DNA的步驟見附錄D)提取。DNA提取后置于-20保存。6.1.2 發(fā)酵水牛乳樣品的DNA提取取一定量(約10 mL或10g)樣品于50mL離心管中，然后向離心管中加入20mL pH7.4的PBS，輕輕敲打離心管使沉淀懸浮，2500r/min離心20min，用小勺撇去離心管上層的乳脂，再用吸管將上清液吸出，保留最底部的沉淀，再用無菌棉球擦除離心管壁上殘存乳脂；如果乳脂殘存過多，再次重復向離心管中加入20mL pH7.4的PBS、離心、除脂的操作步驟；最后將上清液吸出，保留最底部的沉淀；按照食品專用 DNA 抽提試劑盒中步驟抽提DNA。DNA提取除采用試劑盒外，也可采用酚-氯仿-異戊醇法(用酚-氯仿-異戊醇法提取DNA的步驟見附錄D)提取。DNA提取后置于-20保存。6.1.3 水牛乳干酪樣品的DNA提取取2g干酪樣品，充分研碎后置于50 mL離心管中；然后向離心管中加入20mL pH7.4的PBS，搗碎并劇烈震蕩使沉淀懸浮，2500r/min離心20min，用小勺撇去離心管上層的乳脂，再用吸管將上清液吸出，保留最底部的沉淀，再用無菌棉球擦除離心管壁上殘存乳脂；如果乳脂殘存過多，再次重復向離心管中加入20mL pH7.4的PBS、離心、除脂的操作步驟；按照食品專用DNA抽提試劑盒中步驟抽提DNA。DNA提取除采用試劑盒外，也可采用酚-氯仿-異戊醇法(用酚-氯仿-異戊醇法提取DNA的步驟見附錄D)提取。DNA 提取后置于-20保存。注： 以酚-氯仿-異戊醇法或食品專用DNA抽提試劑盒提取酸乳和干酪DNA的過程中，如果使用蛋白酶K消化后，所得溶液比較渾濁的話，再次添加相同量的蛋白酶K，并延長一倍的孵化時間，以確保蛋白消化完全。6.2 DNA濃度和純度的測定取5L DNA溶液加雙蒸水稀釋至1mL，用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計分別檢測260nm和280nm處的吸光值 A260和 A280。DNA的濃度按照式（1）計算：c=AN50/1000 （1）式中：cDNA 濃度，單位為微克每微升（g/L）；A260 nm處的吸光值；N核酸稀釋倍數(shù)。當 A260/A280比值在1.7-1.9之間時，適宜于PCR擴增。6.3 PCR擴增在冰浴條件下，按25L的PCR反應體系用量在PCR反應管中分別加入各PCR試劑，每個樣本做三個平行，同時PCR擴增陽性摻入對照、陰性摻入對照和陰性質(zhì)控對照。25 L的 PCR 反應體系試劑用量如下：PCR Buffer（5）5L、MgCl2（25mmol/L）2.0L、Taq DNA聚合酶（1U/L）0.5L、引物B1（10 M/L）和B2（10 M/L）各0.5L、引物C1（10 M/L）1L、dNTPs 混合物（10 mM/L）0.5L、模板 DNA（0.1 g1.0 g）2L、滅菌雙蒸水8L。除按上述配制外，也可采用 PCR Mix試劑盒。加完試劑后瞬時離心混勻，將PCR反應管均置于PCR儀內(nèi)，按下面反應程序進行PCR反應： 94，3min；然后進入94變性30s；58退火30s；72延伸45s的循環(huán)，共進行40個循環(huán)；72，10 min；4結束擴增。PCR 產(chǎn)物直接進行瓊脂糖凝膠電泳分析或置4保存?zhèn)溆谩?.4 電泳6.4.1 1.5%瓊脂糖凝膠制備制備方法見附錄 E。6.4.2 加樣分別將樣品、陽性摻入對照、陰性摻入對照和陰性質(zhì)控對照的5L PCR 產(chǎn)物與 1L 6DNA電泳上樣緩沖液混合均勻，加至瓊脂糖凝膠樣品孔中（如用含Loading dye 的PCR Mix試劑盒進行PCR反應可直接上樣），同時設置標準 DNA 分子量對照。6.4.3 電泳條件調(diào)整電泳儀至70V電泳約45min，直至溴酚藍指示劑到達離瓊脂糖凝膠末端 2cm3cm 時停止。7 結果判定將電泳后的瓊脂糖凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)內(nèi)觀察，與標準DNA分子量比較，只有陽性摻入對照、陰性摻入對照和陰性質(zhì)控對照結果正確時才能進行受檢樣品的結果判定，然后拍照保存。如果樣品僅在220 bp位置出現(xiàn)水牛特異性條帶，判定為純水牛乳或純水牛乳制品。如果樣品僅在346bp 位置出現(xiàn)牛屬特異性條帶或沒有條帶，則判為非水牛乳或非水牛乳制品。如果樣品在 220bp位置出現(xiàn)水牛屬特異性條帶，且同時在346bp位置出現(xiàn)牛屬特異性條帶，則判為摻假水牛乳或摻假水牛乳制品。注：檢測結果凝膠電泳圖見附錄B.2。附錄A（規(guī)范性附錄）水牛屬和牛屬特異性片段序列A.1 水牛屬特異性片段序列CTAGAGGAGCCTGTTCTATAATCGATAAACCCCGATAGACCTCACCAATTCTTGCTAATGCAGTCTATATACCGCCATCTTCAGCGAACCCTAAAAAGGTACAAAAGTAAGCGCAATCACAACGCATAAAAACGTTAGGTCAAGGTGTAACCTATGAAATGGGAAGAAATGGGCTACATTTTCTACACCAAGAACACCCAACACGAAAGTTATTATGAAAA.2 牛屬特異性片段序列CTAGAGGAGCCTGTTCTATAATCGATAAACCCCGATAAACCTCACCAATTCTTGCTAATACAGTCTATATACCGCCATCTTCAGCAAACCCTAAAAAGGAAAAAAAGTAAGCGTAATTATGATACATAAAAACGTTAGGTCAAGGTGTAACCTATGAAATGGGAAGAAATGGGCTACATTCTCTACACCAAGAGAATCAAGCACGAAAGTTATTATGAAACCAATAACCAAAGGAGGATTTAGCAGTAAACTAAGAATAGAGTGCTTAGTTGAATTAGGCCATGAAGCACGCACACACCGCCCGTCACCCTCCTCAAATAGGATTCAGTGCATCTAACCCTATTTA附錄B （規(guī)范性附錄）特異性引物序列及檢測結果電泳圖示B.1 特異性引物序列合成的特異性引物序列應符合表 A.1 的要求。表 A.1特異性引物序列引物種類引物名稱特異性引物的核苷酸序列片段長度水牛特性引物C15-CTAGAGGAGCCTGTTCTATAATCGATAA-3220bpB15-TTTCATAATAACTTTCGTGTTGGGTGT-3牛屬特性引物C15-CTAGAGGAGCCTGTTCTATAATCGATAA-3346bpB25-TAAATAGGGTTAGATGCACTGAATCCAT-3B.2 PCR 檢測結果電泳圖示以水牛特異性引物和牛屬特異性引物進行雙重PCR的電泳圖圖 A.21 PCR檢測結果瓊脂糖凝膠電泳圖示M、標準 DNA 分子量（100 bp ladder DNA marker）；1、陽性摻入對照； 2、純水牛乳或純水牛乳制品； 3和6、非水牛乳或非水牛乳制品； 4、摻假水牛乳或摻假水牛乳制品； 5、陰性摻入對照； 7、陰性質(zhì)控對照。 附錄C （規(guī)范性附錄）試劑的配制C.1 1 mol/L PBS (pH 7.4) 的配制1 mol/L PBS (pH 7.4) 按下列方法進行制備： 氯化鈉：8.0g； 氯化鉀：0.2g； 磷酸氫二鈉：1.42g； 磷酸二氫鉀：0.27g； 雙蒸水：定容至 1 000mL；在 800 mL 雙蒸水中依次加入上述成分，用 1moL/L 鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4，加水定容至1 000 mL，1.034105 Pa 高壓滅菌 25 min。室溫保存。C.2 0.5 mol/L EDTA (pH 8.0) 的配制 0.5 mol/L EDTA (pH 8.0) 按下列方法進行配制： 二水乙二胺四乙酸二鈉 (EDTA-Na22H2O)：186.1 g； 氫氧化鈉：20.0 g； 雙蒸水：定容至1 000 mL；在 800 mL 雙蒸水中加入 186.1g EDTA-Na22H2O，在磁力攪拌器上劇烈攪拌，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液pH值至8.0(約需 20.0 g 氫氧化鈉顆粒)，然后定容至 1 000 mL，分裝后 1.034105 Pa 高壓滅菌 30 min。室溫保存。C.3 10% SDS 的配制10% SDS 按下列方法進行配制： 十二烷基硫酸鈉 (SDS)：100.0g； 雙蒸水：定容至1 000 mL；在 900 mL 雙蒸水中溶解 100.0 g 電泳級SDS，加熱至68 助溶，用 1 moL/L鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.2，加水定容至1 000mL，分裝備用。室溫保存。C.4 20mg/mL 蛋白酶K的配制20 mg/mL 蛋白酶K按下列方法進行配制： 蛋白酶K：200.0 mg； 雙蒸水：定容至10 mL；將 200.0 mg 蛋白酶K加入9.5mL 的水中(為了減少變性，須加蛋白質(zhì)于水中，而非加水于蛋白質(zhì)中)，輕輕地搖動緊蓋的管子，直到蛋白酶K完全溶解為止。定容至終體積10 mL。用0.22 m孔徑濾膜過濾除菌，分裝成小份于-20 貯存。C.5 3 mol/L NaAc 的配制3 mol/L NaAc 按下列方法進行配制： NaAc：257.5g； 雙蒸水：定容至1 000 mL；在 800 mL 雙蒸水中加入 257.5g NaAc，在磁力攪拌器上劇烈攪拌，調(diào)節(jié)溶液 pH 值至8.0，然后定容至1 000 mL，分裝后 1.034105 Pa 高壓滅菌 30 min。室溫保存。 C.6 TE 的配制TE 按下列方法進行配制： 100 mmol/L Tris-Cl PH 7.6； 10 mmol/L EDTA pH 8.0；分裝后 1.034105 Pa 高壓滅菌 30 min。室溫保存。C.7 100mmol/L Tris-Cl pH7.6的配制100mmol/L Tris-Cl pH7.6按下列方法進行配制： Tris堿：12.11 g； 雙蒸水：定容至 100 mL；在 80 ml 雙蒸水中加入 12.11g Tris 堿，待溶液冷至室溫后，加入濃鹽酸調(diào) PH 值至7.6，然后定容至 100 ml，分裝后 1.034105 Pa 高壓滅菌 30min。室溫保存。C.8 Tris-硼酸電泳緩沖液的配制C.8.1 5 倍Tris-硼酸電泳緩沖液的配制 5 倍 Tris-硼酸電泳緩沖液按下列方法進行配制： Tris：54.0g； 硼酸：27.5g； 0.5 mol/L EDTA (pH 8.0)：20 mL； 雙蒸水：定容至 1 000mL。室溫保存。C.8.2 1 倍 Tris-硼酸電泳緩沖液的配制 1 倍 Tris-硼酸電泳緩沖液按下列方法進行配制： 5倍 Tris-硼酸電泳緩沖液：100 mL； 雙蒸水：400 mL。室溫保存。附錄D （規(guī)范性附錄）用酚-氯仿-異戊醇法提取DNA的步驟D.1 樣品的收集按照6.1；D.2 根據(jù)最終離心獲得的沉淀量，每200mg沉淀量加入1mL的消化緩沖液，同時加入蛋白酶K至終濃度為100g/mL,輕柔混勻后置于60水浴120min，不時旋轉粘滯的溶液；注：在提取酸奶和干酪DNA的過程中，如果使用蛋白酶K消化后，所得溶液比較渾濁的話，再次添加相同量的蛋白酶K，并延長一倍的孵化時間，以確保蛋白消化完全。D.3 冷卻至室溫，2500rpm/mim離心5min后取1000L上清液到一新的2