實(shí)驗(yàn)五顯微鏡油鏡的使用細(xì)菌的革蘭氏染色及芽孢染色張理珉.ppt

實(shí) 驗(yàn) 五 顯微鏡油鏡的使用 細(xì)菌的革蘭氏染色和芽孢染色,目的要求,1、掌握細(xì)菌觀察制片染色技術(shù) 2、掌握革蘭氏染色和芽孢染色的原理及方法步驟 3、掌握顯微鏡觀察技術(shù)（油鏡的原理及使用）,實(shí) 驗(yàn) 內(nèi) 容 一 顯微鏡油鏡的使用 及顯微技術(shù)的介紹,常用的度量單位,一、顯微鏡的種類,光學(xué)顯微鏡常規(guī)研究工作 電子顯微鏡研究細(xì)胞內(nèi)部的、表面的結(jié)構(gòu)及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu),微生物的大小情況,列文虎克及其發(fā)明的顯微鏡、觀察到的微生物形態(tài),1676年荷蘭人列文虎克用自磨鏡片，創(chuàng)造了一架能放大266倍的原始顯微鏡檢查了污水、齒垢、糞便等，發(fā)現(xiàn)了許多肉眼看不見的微小生物，正確描述了微生物的形態(tài)有球形、桿狀和螺旋樣，為微生物的存在提供了科學(xué)依據(jù)。,二、一般光學(xué)顯微鏡的結(jié)構(gòu)組成,普通光學(xué)顯微鏡光路及原理,顯微鏡的數(shù)值孔徑值,鏡口角指從物鏡光軸上的像點(diǎn)發(fā)出的光線與物鏡前透鏡有效直徑的邊緣所張開的角度，即形成的光錐（ ：光錐角度的一半）； 數(shù)值孔徑和顯微鏡的光學(xué)性能有密切的關(guān)系，它與顯微鏡的分辨力成正比，與焦距成反比，與鏡像亮度的平方根成正比 NA=sin,光學(xué)顯微鏡物鏡的特性,物鏡的焦距、工作距離和孔徑光欄的關(guān)系,油浸物鏡分別在空氣和浸沒油為介質(zhì)時(shí)的工作情況,顯微鏡油鏡的原理和使用,油浸系香柏油：=1.52 數(shù)值孔徑：NA=sin 顯微鏡的分辨率： 分辨兩點(diǎn)間最小距離的能力 加入香柏油的作用? 油鏡使用注意事項(xiàng)?,三、顯微鏡油鏡的使用步驟,利用低倍物鏡找到所需要觀察的材料視野（放大倍數(shù)由低到高），并利用載物臺(tái)調(diào)節(jié)器（水平和垂直）將其調(diào)到視野的中央位置（有時(shí)可以省略肉眼判斷）； 利用粗調(diào)旋鈕降低載物臺(tái)，旋轉(zhuǎn)物鏡轉(zhuǎn)盤，使油鏡（100）轉(zhuǎn)到標(biāo)本上方； 從側(cè)面滴加香柏油于載玻片標(biāo)本上（少量，中央）； 利用粗調(diào)旋鈕升高載物臺(tái)，使油鏡剛剛浸沒于香柏油即可（用肉眼從顯微鏡側(cè)面觀察）； 開大孔徑光欄，升高聚光鏡，用眼通過目鏡觀察，前后調(diào)節(jié)細(xì)調(diào)旋鈕，直至物像清晰； 觀察完后，降低載物臺(tái)，利用鏡頭紙蘸二甲苯擦拭油鏡或粘到香柏油其它物鏡（40 ）。,一般光學(xué)顯微鏡（內(nèi)置光源）的調(diào)整要求,放大倍數(shù)的選擇（物鏡的選擇，一般有4、10、40、100） 光照強(qiáng)度（照明）的調(diào)節(jié)（燈泡電壓高低的調(diào)整） 聚光鏡的調(diào)整（升降）光線的會(huì)聚 孔徑光欄的調(diào)整（大?。┩ü饬?瞳距調(diào)節(jié)（具體后面介紹） 屈光度調(diào)節(jié)（具體后面介紹） 以上各項(xiàng)綜合調(diào)整，達(dá)到的唯一目的物像清晰、反差強(qiáng)。,四、光學(xué)顯微鏡所涉及的觀察方式,1.明場觀察 2.暗場觀察（暗視野） 3.相差觀察（明視野） 4.偏光觀察 5. DIC觀察（微分干涉） 6. RC觀察（浮雕相襯） 7.熒光觀察,1.明場觀察方式,常規(guī)觀察方式 應(yīng)用領(lǐng)域： 常規(guī)鏡檢、病理、染色標(biāo)本 優(yōu)點(diǎn)： 視野亮度高、均勻， 應(yīng)用范圍廣， 操作簡單，價(jià)格低， 物鏡適用于熒光觀察 缺點(diǎn)： 透明標(biāo)本對比度低， 標(biāo)本沒有立體感,明場觀察顯微鏡的調(diào)節(jié),瞳距調(diào)節(jié) 屈光度調(diào)節(jié) 光路轉(zhuǎn)換 聚光鏡中心 孔徑光欄設(shè)置,瞳距調(diào)節(jié),刻度指示,屈光度調(diào)節(jié),調(diào)節(jié),屈光度調(diào)節(jié)指示,光路轉(zhuǎn)換,100%,80%,20%,100%,聚光鏡中心調(diào)節(jié), 光軸中心調(diào)節(jié)螺釘, 視場光闌, 孔徑光闌,10X物鏡, 標(biāo)本, 聚光鏡升降旋鈕,孔徑光欄調(diào)節(jié),N.A聚=(0.60.8)N.A物 和物鏡配合使用,孔徑光欄開度與圖象,100%,70%,30%,HR LC,HC LR,MR MC,2.暗場觀察（暗視野）,暗視野顯微鏡的結(jié)構(gòu)及其效果照片（梅毒螺旋體和團(tuán)藻屬、水棉屬）,原理： 丁道爾（Tyndall）現(xiàn)象，微粒對斜射光反射或衍射，增大了人眼可見性。,特點(diǎn)： 觀察到極其微小物體，分辨率可達(dá)0.02 0.004 um （明場0.4um）“超顯微” 。 缺點(diǎn)： 只能觀察到物體存在、運(yùn)動(dòng)和外部形態(tài) 不方便調(diào)節(jié) 標(biāo)本要求高（灰塵、蓋片、載片） 應(yīng)用： 微小粒子、細(xì)菌形態(tài)觀察、細(xì)菌計(jì)數(shù)，透明標(biāo)本觀察等,3.相差觀察（明視野）,相差顯微鏡結(jié)構(gòu)及原理圖,原理： 利用被檢物體的光程（折射率厚度）差進(jìn)行鏡檢，即利用干涉現(xiàn)象，將相位差變?yōu)槿搜劭梢苑直娴恼穹睢?相差顯微鏡效果照片（迂回螺菌、肉毒梭菌、草履蟲、阿米巴變形蟲）,特點(diǎn)： 鑒定活體細(xì)胞最實(shí)用、最經(jīng)濟(jì)的方法 缺點(diǎn)： 需要光強(qiáng)高 切片不能太厚（510um） 蓋玻片、載玻片需符合標(biāo)準(zhǔn) 最好配用單色濾光鏡 操作較麻煩 熒光效果不如明場物鏡 應(yīng)用： 無色透明活體標(biāo)本的細(xì)微結(jié)構(gòu)，檢查,鑒定活體細(xì)胞（培養(yǎng)細(xì)胞，分離細(xì)胞）,調(diào)節(jié)： 苛勒照明調(diào)節(jié) 將相差物鏡及附件轉(zhuǎn)入光路,對樣品聚焦 取下目鏡，裝上CT望遠(yuǎn)鏡， 調(diào)節(jié)焦距看到清晰的相差環(huán) 調(diào)節(jié)聚光鏡上定位螺絲，使環(huán)狀光闌象與相板共軛面重合,不同類型的光學(xué)顯微鏡的效果圖,說明：用不同類型的光學(xué)顯微鏡在同一條件下拍攝的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）顯微照片：明視野；相差；暗視野）,4.偏光觀察,偏光觀察方式,原理： 依據(jù)波動(dòng)光學(xué)原理觀察和精密測定標(biāo)本細(xì)節(jié)，或透明物體改變光束的物理參數(shù)，以此判別物質(zhì)結(jié)構(gòu)的一種顯微鏡,自然光（多振動(dòng)面）,偏振器1,偏振器2,偏振光（單一振動(dòng)面）,應(yīng)用： 礦物質(zhì)、化學(xué)物品鑒別 鑒別纖維、染色體、淀粉粒、細(xì)胞中晶體 植物病理檢驗(yàn) 鑒別骨骼、牙齒、膽固醇、神經(jīng)纖維、腫瘤細(xì)胞、橫紋肌和毛發(fā)等,5. DIC觀察（微分干涉）,微分干涉觀察方法,原理： 通過特制的棱鏡將偏振光分解相互垂直，強(qiáng)度相等的光束，光束在極近的兩點(diǎn)（小于顯微鏡的分辨率）上通過被檢物體，從而在相位上略有差別，使圖象呈現(xiàn)出立體三維感覺。,微分干涉差顯微鏡照片,特點(diǎn)： 可以使被檢物體產(chǎn)生三維立體感覺 觀察效果更直觀 無須特殊物鏡，與熒光觀察配合更好 可以調(diào)節(jié)背景和物體的顏色變化而達(dá)到理想的效果。 缺點(diǎn)： 需要光強(qiáng)高，雙折射物質(zhì)不能達(dá)到DIC鏡檢效果，不能應(yīng)用于塑料容器培養(yǎng)物的觀察，鏡檢靈敏度有方向性，調(diào)節(jié)較復(fù)雜 應(yīng)用： 無色透明活體標(biāo)本的細(xì)微結(jié)構(gòu)，無色熒光標(biāo)本，染色標(biāo)本，顯微操作等,6. RC觀察（浮雕相襯）,浮雕相襯顯微鏡,原理：斜射光照射到標(biāo)本產(chǎn)生折射、衍射，光線通過物鏡光密度梯度調(diào)節(jié)器產(chǎn)生不同陰影，從而使透明標(biāo)本表面產(chǎn)生明暗差異，增加觀察對比度。,浮雕相襯顯微鏡,歷史： 1975年，Robert Hoffman 博士發(fā)明 2002年，專利到期，各顯微鏡廠家紛紛推出采用以自己名義命名的RC技術(shù)產(chǎn)品 特點(diǎn)： 提高未染色標(biāo)本的可見性和對比度； 圖象顯示陰影或近似三維結(jié)構(gòu)而不會(huì)產(chǎn)生光暈； 可檢測雙折射物質(zhì)（巖石切片、水晶、骨頭）； 可檢測玻璃,塑料等培養(yǎng)皿中的細(xì)胞,器官和組織； 聚光鏡的工作距離可以設(shè)計(jì)的更長； RC物鏡也可用于明場、暗場和熒光觀察,浮雕相襯顯微鏡,缺點(diǎn)： 觀察效果與標(biāo)本方向密切相關(guān) 操作較復(fù)雜 必須有多元件,結(jié)構(gòu)復(fù)雜的高數(shù)值孔徑RC物鏡 觀察熒光效果不如明場物鏡 應(yīng)用： 所有類型的細(xì)胞，組織（無論活體，染色，未染色），晶體表面細(xì)節(jié)，透明聚合物，玻璃和其它類似材料，尤其適用于顯微操作,浮雕相襯顯微鏡,7.熒光觀察,熒光觀察方法,什么是熒光 ?,物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時(shí)釋放出的光，是非溫度輻射光冷光。即：物質(zhì)吸收短波光，發(fā)射出的長波光。 顯微鏡熒光利用光源激發(fā)光化熒光,熒光的種類,自發(fā)（固有）熒光,二次熒光,熒光顯微鏡的作用原理,寬譜線發(fā)射光（汞燈）,濾掉其他光，透過激發(fā)光,激發(fā)濾色片,吸收濾色片,濾掉激發(fā)光，透過熒光,標(biāo)本受激發(fā)產(chǎn)生熒光向四周發(fā)散,激發(fā)光受反射、折射或衍射向四周發(fā)散,熒光顯微鏡結(jié)構(gòu)及其顯微照片 （藤黃微球菌、蠟狀芽孢桿菌和大腸桿菌）,熒光顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)和用途,優(yōu)點(diǎn)： 檢出能力高（放大作用） 對細(xì)胞的刺激小（可以活體染色） 能進(jìn)行多重染色 用途： 物體構(gòu)造的觀察熒光素 熒光的有無、色調(diào)比較進(jìn)行物質(zhì)判別抗體熒光等 發(fā)熒光量的測定對物質(zhì)定性、定量分析,熒光顯微鏡的主要部件,透射式 吸收濾色鏡 暗場聚光鏡 激發(fā)濾色鏡 汞燈光源,落射式 吸收濾色鏡 分光鏡 激發(fā)濾色鏡 汞燈光源,五、常見電子顯微鏡,透射電子顯微鏡 掃描電子顯微鏡,透射電鏡的結(jié)構(gòu)（和光學(xué)的比較）及其顯微照片（奇異變形桿菌和T4大腸桿菌噬菌體）,掃描電子顯微鏡結(jié)構(gòu)及其顯微照片（葡萄球菌和脊螺旋體）,透射電子顯微鏡設(shè)備圖,原核生物具有代表性的細(xì)胞形狀,球菌和桿菌的電子顯微鏡照片,Average size: 0.2 -1.0 m 2 - 8 m Basic shapes:,Unusual shapes Star-shaped Stella Square Haloarcula Most bacteria are monomorphic A few are pleomorphic,實(shí) 驗(yàn) 內(nèi) 容 二 細(xì)菌的革蘭氏染色,一、微生物染色的原理,微生物個(gè)體微小，在光學(xué)顯微鏡下，折光性較小，反差小，看不清，所以要進(jìn)行染色； 染色劑的選擇 具發(fā)色基團(tuán)共軛雙鍵（有時(shí)需要助色基團(tuán)） 可和細(xì)胞結(jié)合離子鍵、共價(jià)鍵、疏水鍵等 染色劑的種類： 堿性染料美蘭、堿性品紅、結(jié)晶紫、番紅、孔雀石綠（氯化鹽類） 酸性染料伊紅、玫瑰紅、酸性品紅（帶-COOH、-OH） 一般情況下，微生物細(xì)胞帶負(fù)電荷，可以和堿性染料電離的正電荷發(fā)色基團(tuán)結(jié)合，從而細(xì)胞被著色。,二、微生物染色的方法,單染色1種染料（著色和不著色） 復(fù)染色2種以上染料（使不結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)不同的顏色） 負(fù)染色視野背景染色，所觀察材料不著色 活體染色TTC、美蘭，利用活體細(xì)胞代謝中的脫氫作用。,三、革蘭氏染色介紹,革蘭氏染色是用來鑒別細(xì)菌的一種方法，利用這種染色法，可將細(xì)菌分成兩大類。 是由一位丹麥醫(yī)生漢斯克里斯蒂安革蘭(Hans Christian Gram，18531938年)于1884年所發(fā)明，最初是用來鑒別肺炎球菌與克雷白氏肺炎菌之間的關(guān)系。,四、革蘭氏染色法原理,細(xì)胞壁組成,網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物質(zhì)微纖維形狀與硬度,填充基質(zhì)成分胞壁間質(zhì)有無不影響形狀，有則增強(qiáng)細(xì)胞壁的堅(jiān)固性，可用化學(xué)方法處理而去掉,細(xì)胞壁成分和結(jié)構(gòu)的不同 肽聚糖含量的不同（肽聚層的厚?。?肽聚糖層交聯(lián)程度不同 脂類的含量不同,G+細(xì)菌與G-細(xì)菌細(xì)胞壁成分的比較,G+和G-細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)圖,G+和G-細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)圖,肽聚糖交聯(lián)情況 （金黃葡萄球菌、大腸桿菌）,革蘭氏染色的效果圖,五、革蘭氏染色法幾個(gè)操作的作用,1、固定目的 殺死微生物，固定細(xì)胞結(jié)構(gòu)。 保證菌體能更牢的粘附在載玻片上，防止標(biāo)本被水沖洗掉蛋白質(zhì)變性。 改變?nèi)玖蠈?xì)胞的通透性，因?yàn)樗赖脑|(zhì)比活的原生質(zhì)易于染色。,2、盧戈氏碘液媒染的作用,在細(xì)胞內(nèi)和結(jié)晶紫形成更大分子的復(fù)合物。 脫色時(shí)不容易被脫色劑脫除。,3、95%乙醇的脫色作用,作為脫水劑引起G+菌細(xì)胞壁脫水收縮，造成細(xì)胞壁網(wǎng)孔孔徑變小。 作為脂溶性溶劑溶解G-菌的細(xì)胞壁中的脂質(zhì)，造成細(xì)胞壁網(wǎng)孔孔徑變大。,六、革蘭氏染色法的操作,菌種： 大腸桿菌（Escherichia coli ） 枯草芽孢桿菌（Bacillus subitilis） 未知菌（前面實(shí)驗(yàn)中分離得到）,實(shí)驗(yàn)步驟：,在載玻片上滴一滴蒸餾水或生理鹽水（用接種環(huán)取最好，量適中易風(fēng)干）接種環(huán)挑取少量菌體（無菌操作，接種環(huán)輕磕，水滴剛變混即可）涂片風(fēng)干固定（過火35次）初染（草酸銨結(jié)晶紫，12分鐘）水洗媒染（盧戈氏碘液1分鐘）水洗95%乙醇脫色（直至無紫色流出）水洗復(fù)染（番紅染色，12分鐘）水洗風(fēng)干鏡檢,涂片要求及示意圖（演示操作）,設(shè)置對照（G+、G-） 涂布成霧狀薄層（半透明，對光線基本無遮擋） 涂斑大小一般直徑小于1cm。,革蘭氏染色操作演示圖,革蘭氏染色操作演示圖,七、注意事項(xiàng),1.革蘭氏染色成敗的關(guān)鍵是酒精脫色。如脫色過度，革蘭氏陽性菌也可被脫色而染成陰性菌；如脫色時(shí)間過短，革蘭氏陰性菌也會(huì)被染成革蘭氏陽性菌。脫色時(shí)間的長短還受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影響，難以嚴(yán)格規(guī)定。 2.染色過程中勿使染色液干涸。用水沖洗后，應(yīng)吸去玻片上的殘水，以免染色液被稀釋而影響染色效果。 3.選用幼齡的細(xì)菌。G+菌培養(yǎng)1216h，E.coli培養(yǎng)24h。若菌齡太老，由于菌體死亡或自溶常使革蘭氏陽性菌轉(zhuǎn)呈陰性反應(yīng)。,介紹三步法,黃元桐等. 革蘭氏染色三步法與質(zhì)理控制. 微生物學(xué)報(bào)，1996，36（1）；7678 脫色和復(fù)染一步完成（0.4%堿性復(fù)紅95%乙醇溶液）,實(shí) 驗(yàn) 內(nèi) 容 三 芽 孢 染 色,一、芽孢染色的原理,芽孢結(jié)構(gòu)特點(diǎn)具皮層（吡啶二羧酸-鈣，DPA），滲透性較差，使其具抗逆性； 阻止染色劑的浸入不利于著色； 一經(jīng)著色后，也可阻止染色劑的洗脫； 經(jīng)過復(fù)染后，就可以使?fàn)I養(yǎng)體和芽孢染上不同顏色，而加以區(qū)分。,芽孢的結(jié)構(gòu)與著生部位,2，6-吡啶二羧酸,EX：孢外壁；SC：芽孢衣；CX：皮層；CW：芽孢壁；N：擬核；CR：核糖體,芽孢的形成和萌發(fā),細(xì)菌的內(nèi)生孢子芽孢,二、芽孢染色的操作步驟,菌種： 枯草芽孢桿菌（Bacillus subitilis） 實(shí)驗(yàn)步聚： 涂片（可以稍多一點(diǎn)）風(fēng)干固定孔雀綠染色（1-2滴）火焰上加熱，冒蒸汽但不沸騰（不得蒸干，染液可添加）保持45分鐘冷卻水洗（無孔雀綠流出）番紅復(fù)染5分鐘水洗風(fēng)干（可用吸水紙吸去水滴，但不擦拭）鏡檢,補(bǔ)充介紹：生物科學(xué)繪圖,生物科學(xué)繪圖，不同于美術(shù)作品，它以科學(xué)性為標(biāo)準(zhǔn)，要求形體正確，比例正確，倍數(shù)正確，色彩正確，即形象必須真實(shí)。,1.生物繪圖應(yīng)具有嚴(yán)格的科學(xué)性 (1)形體（態(tài)）準(zhǔn)確 (2)比例正確 (3)特征明晰 2.生物繪圖應(yīng)具有真實(shí)感 3.生物繪圖需符合制板要求 (1)線條粗細(xì)規(guī)律； (2)圖像