GB15193.23-2014食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)體外哺乳細(xì)胞染色體畸變試驗.pdf

書書書中 華 人 民 共 和 國 國 家 標(biāo) 準(zhǔn)犌 犅 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)體外哺乳類細(xì)胞染色體畸變試驗（ 報批稿） 發(fā)布 實施中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會發(fā) 布書書書食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)體外哺乳類細(xì)胞染色體畸變試驗范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了體外哺乳類細(xì)胞染色體畸變試驗的基本試驗方法和技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于評價受試物的體外哺乳類細(xì)胞染色體畸變。術(shù)語和定義染色體結(jié)構(gòu)畸變通過顯微鏡可以直接觀察到的發(fā)生在細(xì)胞有絲分裂中期的染色體結(jié)構(gòu)變化。如染色體中間缺失和斷片、 染色體互換等。染色體結(jié)構(gòu)畸變可分為染色體型畸變（ ） 和染色單體型畸變（ ） 。染色體型畸變?nèi)旧w結(jié)構(gòu)損傷， 表現(xiàn)為在兩個染色單體的相同位點均出現(xiàn)斷裂或斷裂重組等改變。染色單體型畸變?nèi)旧w結(jié)構(gòu)損傷， 表現(xiàn)為染色單體斷裂或染色單體斷裂重組等改變。有絲分裂指數(shù)中期相細(xì)胞數(shù)與所觀察的細(xì)胞總數(shù)之比值； 是反映細(xì)胞增殖程度的指標(biāo)。核內(nèi)復(fù)制在 復(fù)制的期之后， 細(xì)胞核未進(jìn)行有絲分裂就開始了另一個期的過程。其結(jié)果是染色體有、 倍的染色單體。裂隙染色體或染色單體損傷的長度小于一個染色單體的寬度， 為染色單體的最小錯誤排列。試驗?zāi)康暮驮硗ㄟ^檢測受試物是否誘發(fā)體外培養(yǎng)的哺乳類細(xì)胞染色體畸變， 評價受試物致突變的可能性。在加入或不加入代謝活化系統(tǒng)的條件下， 使培養(yǎng)的哺乳類細(xì)胞暴露于受試物中。用中期分裂相阻斷劑（ 如秋水仙素或秋水仙胺） 處理， 使細(xì)胞停止在中期分裂相， 隨后收獲細(xì)胞、 制片、 染色、 分析染色體畸變。儀器和試劑儀器細(xì)胞培養(yǎng)箱， 倒置顯微鏡， 超凈臺， 離心機(jī)。犌 犅 培養(yǎng)液常用 培養(yǎng)液（ ，） ， 也可選用其他合適培養(yǎng)液。加入抗菌素（ 青霉素按 、 鏈霉素 ） ， 將滅活的胎牛血清或小牛血清按 的比例加入培養(yǎng)液。代謝活化系統(tǒng)犛 輔助因子的配制鎂鉀溶液氯化鎂和氯化鉀 加蒸餾水溶解至 。犿 狅 犾犔磷酸鹽緩沖液（狆 犎）磷酸氫二鈉（ ， ） ， 磷酸二氫鈉（ ， ） ， 調(diào) 至， 滅菌或濾菌。輔酶 （ 氧化型） 溶液無菌條件下稱取輔酶 ， 用無菌蒸餾水溶解配制成 溶液， 現(xiàn)用現(xiàn)配。葡萄糖 磷酸鈉鹽溶液稱取葡萄糖 磷酸鈉鹽， 用蒸餾水溶解配制成 ， 過濾滅菌?，F(xiàn)用現(xiàn)配。大鼠肝犛 組分的誘導(dǎo)和配制選健康雄 性 成 年 或 大 鼠， 體 重 ， 約周 齡周 齡。將 多 氯 聯(lián) 苯（ ） 溶于玉米油中， 濃度為 ， 按 體重?zé)o菌操作一次腹腔注射，后處死動物， 處死前禁食 。也可采用苯巴比妥鈉和萘黃酮聯(lián)合誘導(dǎo)的方法進(jìn)行制備， 經(jīng)口灌胃給予大鼠苯巴比妥鈉和萘黃酮， 劑量均為 體重， 連續(xù)， 禁食 后斷頭處死動物。其他操作同多氯聯(lián)苯誘導(dǎo)。處死動物后取出肝臟， 稱重后用新鮮冰冷的 氯化鉀溶液連續(xù)沖洗肝臟數(shù)次， 以便除去能抑制微粒體酶活性的血紅蛋白。每克肝（ 濕重） 加 氯化鉀溶液 ， 連同燒杯移入冰浴中， 用消毒剪刀剪碎肝臟， 在玻璃勻漿器（ 低于 ， ） 或組織勻漿器（ 低于 ， ）中制成肝勻漿。以上操作需注意無菌和局部冷環(huán)境。將制成的肝勻漿在低溫（） 高速離心機(jī)上以 犵離心 ， 吸出上清液為 組分，分裝于無菌冷凍管中， 每管 左右， 最好用液氮或干冰速凍后置 低溫保存。 組分制成后， 經(jīng)無菌檢查， 測定蛋白含量（ 法） ， 每毫升蛋白含量不超過 為宜， 并經(jīng)間接致突變劑鑒定其生物活性合格后貯存于 低溫或冰凍干燥， 保存期不超過年。 犛 混合液的制備一般由 組分和輔助因子按組成 的 混合液， 無菌現(xiàn)用現(xiàn)配。 混合液 配制如下：取上述磷酸鹽緩沖液 、 鎂鉀溶液 、 葡萄糖 磷酸鈉鹽溶液 、 輔酶 溶液 、肝 組分 ， 混勻， 置冰浴中待用。 混合液濃度一般為 ， 實際使用濃度可由各實驗室自行決定， 但需對其活性進(jìn)行鑒定，犌 犅 必須能明顯活化陽性對照物， 且對細(xì)胞無明顯毒性。秋水仙素溶液用 溶液配制適當(dāng)濃度的儲備液， 過濾除菌， 在避光冷藏的條件下至少能保存?zhèn)€月。 犿 狅 犾犔氯化鉀溶液 氯化鉀加蒸餾水至 。固定液甲醇冰醋酸為， 臨用前配制。根據(jù)試驗條件， 可適當(dāng)調(diào)整冰醋酸的濃度， 改善染色體分散度， 但不宜過大， 導(dǎo)致細(xì)胞破裂。姬姆薩（犌 犻 犲 犿 狊 犪） 染液取姬姆薩染料， 置乳缽中， 加少量甲醇研磨。逐漸加甲醇至 ， 待完全溶解后， 再加 甘油， 放入 溫箱中保溫 。保溫期間振搖數(shù)次， 使充分溶解。取出過濾，周后使用， 作為姬姆薩染液原液。使用時， 取份姬姆薩染液原液， 與份 磷酸鹽緩沖液（ ） 混合，配成其應(yīng)用液， 現(xiàn)配現(xiàn)用。磷酸鹽緩沖液（ ， ） 配制方法如下：）第一液： 取磷酸氫二鈉（ ） 溶于去離子水 中， 配成 溶液；）第二液： 取磷酸二氫鉀（ ） 溶于去離子水 中， 配成 溶液；）取第一液 加于第二液 中混勻， 即為 的 磷酸鹽緩沖液。試驗方法受試物固體受試物應(yīng)溶解或懸浮于適合的溶媒中， 并稀釋至適當(dāng)濃度。液體受試物可直接使用或稀釋至適當(dāng)濃度。受試物應(yīng)無菌現(xiàn)用現(xiàn)配， 否則須確認(rèn)儲存不影響其穩(wěn)定性。細(xì)胞株可選用中國倉鼠肺（） 細(xì)胞株或卵巢（） 細(xì)胞株、 人或其他哺乳動物外周血淋巴細(xì)胞（ ） 。試驗前檢查細(xì)胞的核型和染色體數(shù)目， 檢測細(xì)胞有無支原體污染。推薦使用中國倉鼠肺（） 細(xì)胞株。劑量劑量設(shè)置受試物至少應(yīng)取個檢測劑量。對有細(xì)胞毒性的受試物， 其劑量范圍應(yīng)包括從最大毒性至幾乎無毒性（ 細(xì)胞存活率在 的范圍內(nèi)） ； 通常濃度間隔系數(shù)不大于槡 。最高劑量的選擇當(dāng)收獲細(xì)胞時， 最高劑量應(yīng)能明顯減少細(xì)胞計數(shù)或有絲分裂指數(shù)（ 大于 ， 如毒性過大， 應(yīng)適當(dāng)增加接種細(xì)胞數(shù)） ； 同時應(yīng)該考慮受試物對溶解度、 和摩爾滲透壓濃度的影響； 對無細(xì)胞毒性或細(xì)胞毒性很小的化合物， 最高劑量應(yīng)達(dá)到、 或 。犌 犅 對溶解度較低的物質(zhì)， 當(dāng)達(dá)到最大溶解濃度時仍無毒性， 則最高劑量應(yīng)是在最終培養(yǎng)液中溶解度限值以上的一個濃度。在某些情況下， 應(yīng)使用一個以上可見沉淀的濃度， 溶解性可用肉眼鑒別， 但沉淀不能影響觀察。細(xì)胞毒性的確定測定細(xì)胞毒性可使用指示細(xì)胞完整性和生長情況的指標(biāo)， 如相對集落形成率或相對細(xì)胞生長率等。應(yīng)在 系統(tǒng)存在或不存在的條件下測定細(xì)胞毒性。陽性對照可根據(jù)受試物的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)選擇適宜的陽性對照物， 應(yīng)是已知的斷裂劑， 能引起可檢出的、 并可重復(fù)的陽性結(jié)果。當(dāng)不存在外 源性 代 謝活 化系 統(tǒng) 時， 可 使用 的 陽 性 對 照 物 有 甲 磺 酸 甲 酯 （ ， ） 、 甲磺酸乙酯（ ，） 、 絲裂霉素（ ） 、乙基亞硝基脲（ ， ） 、 硝基喹啉犖氧化物（ 犖 ） 等。當(dāng)存在外源性 活 化 系 統(tǒng) 時，可 使 的 陽 性 對 照 物 有 苯 并 犪芘 （犪） ， 、環(huán) 磷 酰 胺（ ） 等。不加 的陽性對照常用絲裂霉素， 其常用濃度為。其 為的水溶液在下避光保存能存放周。加 的陽性對照常用環(huán)磷酰胺， 其常用濃度為 。其水溶液不穩(wěn)定， 應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用。陰性對照溶媒應(yīng)為非致突變物， 不與受試物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)， 不影響細(xì)胞存活和 活性。首選溶媒對照是不含血清的培養(yǎng)液和水， 亦可使用二甲基亞砜（ ） ， 但濃度不應(yīng)大于?？瞻讓φ杖绻麤]有文獻(xiàn)資料或歷史資料證實所用溶媒無致突變作用時應(yīng)設(shè)空白對照。試驗步驟細(xì)胞培養(yǎng)與染毒試驗需在加入和不加入 （ 的終濃度常為 ， 以細(xì)胞毒性試驗結(jié)果為準(zhǔn)） 的條件下進(jìn)行。試驗前一天， 將一定數(shù)量的細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿（ 瓶） 中 以收獲細(xì)胞時， 培養(yǎng)皿（ 瓶） 的細(xì)胞未長滿為標(biāo)準(zhǔn)， 一般以長到 左右為佳； 如用細(xì)胞， 可接種 個 ， 放 培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。試驗時吸去培養(yǎng)皿（ 瓶） 中的培養(yǎng)液， 加入一定濃度的受試物、 混合液（ 不加 混合液時， 需用培養(yǎng)液補(bǔ)足） 以及一定量不含血清的培養(yǎng)液， 置培養(yǎng)箱中處理。處理結(jié)束后， 吸去含受試物的培養(yǎng)液， 用 溶液洗細(xì)胞次， 加入含 胎牛血清的培養(yǎng)液， 放回培養(yǎng)箱， 于 收獲細(xì)胞。于收獲前，加入細(xì)胞分裂中期阻斷劑（ 如用秋水仙素， 終濃度為） 。當(dāng)受試物為單一化學(xué)物質(zhì)時， 如果在上述加入和不加入 混合液的條件下均獲得陰性結(jié)果， 則需加做長時間處理的試驗， 即在沒有 混合液的條件下， 使受試物與試驗系統(tǒng)的接觸時間延長至 。當(dāng)難以得出明確結(jié)論時， 應(yīng)更換試驗條件， 如改變代謝活化條件、 受試物與試驗系統(tǒng)接觸時間等重復(fù)試驗。收獲細(xì)胞與制片消化用 胰蛋白酶溶液消化細(xì)胞， 待細(xì)胞脫落后， 加入含 胎?；蛐∨Ｑ宓呐囵B(yǎng)液終止胰蛋犌 犅 白酶的作用， 混勻， 放入離心管以 的速度離心 ， 棄去上清液。低滲加入 氯化鉀溶液 ， 用滴管將細(xì)胞輕輕地混勻， 放入 細(xì)胞培養(yǎng)箱中低滲處理 。固定加入 固定液， 混勻后固定 以上， 以 速度離心 ， 棄去上清液。重復(fù)一次， 棄去上清液。滴片加入數(shù)滴新鮮固定液， 混勻。用混懸液滴片， 自然干燥。玻片使用前用冰水浸泡。染色 姬姆薩染液， 。閱片在油鏡下閱片， 每一劑量組應(yīng)分析不少于 個分散良好的中期分裂相， 且每個觀察細(xì)胞的染色體數(shù)在狀范圍之內(nèi)。對于畸變細(xì)胞還應(yīng)記錄顯微鏡視野的坐標(biāo)位置及畸變類型。觀察指標(biāo)染色體數(shù)目的改變非整倍體： 亞二倍體或超二倍體。多倍體： 染色體成倍增加。核內(nèi)復(fù)制： 核膜內(nèi)的特殊形式的多倍化現(xiàn)象。染色體結(jié)構(gòu)的改變斷裂： 損傷長度大于染色體的寬度。微小體： 較斷片小而呈圓形。有著絲點環(huán)： 帶有著絲點部分， 兩端形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)并伴有一雙無著絲點斷片。無著絲點環(huán)： 成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。單體互換： 形成三輻體、 四輻體或多種形狀的圖像。雙微小體： 成對的染色質(zhì)小體。裂隙： 損傷的長度小于染色單體的寬度。非特定性型變化： 如粉碎化、 著絲點細(xì)長化、 黏著等。數(shù)據(jù)處理和結(jié)果評價數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)按不同劑量列表， 指標(biāo)包括觀察細(xì)胞數(shù)、 畸變細(xì)胞數(shù)、 染色體畸變率、 各劑量組及對照組不同類型染色體畸變數(shù)與畸變率等。裂隙應(yīng)單獨記錄和報告， 但一般不計入總的畸變率。各組的染色體畸變率用檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。犌 犅 結(jié)果評價下列兩種情況可判定受試物在本試驗系統(tǒng)中為陽性結(jié)果：）受試物引起染色體結(jié)構(gòu)畸變數(shù)的增加具有統(tǒng)計學(xué)意義， 并與劑量相關(guān)；）受試物在任何一個劑量條件下， 引起的染色體結(jié)構(gòu)畸變數(shù)增加具有統(tǒng)計學(xué)意義， 并有可重復(fù)性。試驗報告試驗名稱、 試驗單位名稱和聯(lián)系方式、 報告編號。試驗委托單位名稱和聯(lián)系方式、 樣品受理日期。試驗開始和結(jié)束日期、 試驗項目負(fù)責(zé)人、 試驗單位技術(shù)負(fù)責(zé)人、 簽發(fā)日期。試驗摘要。受試物： 名稱、 鑒定資料、 號（ 如已知） 、 純度、 與本試驗有關(guān)的受試物的物理和化學(xué)性質(zhì)及穩(wěn)定性等。溶媒： 溶媒的選擇依據(jù)為受試物在溶媒中的溶劑性和穩(wěn)定性。細(xì)胞株： 細(xì)胞株的來源、 名稱。試驗條件： 劑量、 代謝活化系統(tǒng)、 標(biāo)準(zhǔn)誘變劑、 操作步驟等。代謝活化系統(tǒng)： 制備 所用酶的誘導(dǎo)劑、 選用的動物品種和來源、 混合液的配方。對照物： 陽性對照物的名稱、 生產(chǎn)廠家、 批號和選用濃度。培養(yǎng)液： 所用培養(yǎng)液的名稱、 血清類別和使用濃度。接種的細(xì)胞密度以及所用培養(yǎng)皿（ 瓶） 的規(guī)格。中期分裂阻斷劑： 名稱、 所用濃度、 作用時間。處理時間： 受試物與試驗系統(tǒng)的接觸時間。制片方法、 分析的中期分裂相數(shù)目、 結(jié)果評價方法。試驗結(jié)果。試驗結(jié)果應(yīng)包括細(xì)胞毒性的測定、 加受試物后的溶解情況及對 和滲透壓的影響（ 如果有影響） 。各劑量組和對照組細(xì)胞染色體畸變率。本實驗室的陽性對照組和陰性對照組（ 常用溶媒， 如 ） 在本實