GB4789.10-2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn).pdf

中 華 人 民 共 和 國(guó) 國(guó) 家 標(biāo) 準(zhǔn)G B4 7 8 9 .1 02 0 1 6食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)2 0 1 6 - 1 2 - 2 3發(fā)布2 0 1 7 - 0 6 - 2 3實(shí)施中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)國(guó) 家 食 品 藥 品 監(jiān) 督 管 理 總 局發(fā) 布G B4 7 8 9.1 02 0 1 6 前 言 本標(biāo)準(zhǔn)代替G B4 7 8 9.1 02 0 1 0 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn) 、S N/T0 1 7 22 0 1 0 進(jìn)出口食品中金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)方法 、S N/T2 1 5 42 0 0 8 進(jìn)出口食品中凝固酶陽(yáng)性葡萄球菌檢測(cè)方法 兔血漿纖維蛋白原瓊脂培養(yǎng)基技術(shù) 。本標(biāo)準(zhǔn)與G B4 7 8 9.1 02 0 1 0相比, 主要變化如下: 試驗(yàn)用增菌液統(tǒng)一為7.5%氯化鈉肉湯。G B4 7 8 9.1 02 0 1 61 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中金黃色葡萄球菌(S t a p h y l o c o c c u sa u r e u s) 的檢驗(yàn)方法。本標(biāo)準(zhǔn)第一法適用于食品中金黃色葡萄球菌的定性檢驗(yàn); 第二法適用于金黃色葡萄球菌含量較高的食品中金黃色葡萄球菌的計(jì)數(shù); 第三法適用于金黃色葡萄球菌含量較低的食品中金黃色葡萄球菌的計(jì)數(shù)。2 設(shè)備和材料除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外, 其他設(shè)備和材料如下:2.1 恒溫培養(yǎng)箱:3 61。2.2 冰箱:25。2.3 恒溫水浴箱:3 65 6。2.4 天平: 感量0.1g。2.5 均質(zhì)器。2.6 振蕩器。2.7 無(wú)菌吸管:1m L( 具0.0 1m L刻度) 、1 0m L( 具0.1m L刻度) 或微量移液器及吸頭。2.8 無(wú)菌錐形瓶: 容量1 0 0m L、5 0 0m L。2.9 無(wú)菌培養(yǎng)皿: 直徑9 0mm。2.1 0 涂布棒。2.1 1 p H計(jì)或p H比色管或精密p H試紙。3 培養(yǎng)基和試劑3.1 7.5%氯化鈉肉湯: 見(jiàn)A.1。3.2 血瓊脂平板: 見(jiàn)A.2。3.3 B a i r d - P a r k e r瓊脂平板: 見(jiàn)A.3。3.4 腦心浸出液肉湯(B H I) : 見(jiàn)A.4。3.5 兔血漿: 見(jiàn)A.5。3.6 稀釋液: 磷酸鹽緩沖液: 見(jiàn)A.6。3.7 營(yíng)養(yǎng)瓊脂小斜面: 見(jiàn)A.7。3.8 革蘭氏染色液: 見(jiàn)A.8。3.9 無(wú)菌生理鹽水: 見(jiàn)A.9。第一法 金黃色葡萄球菌定性檢驗(yàn)4 檢驗(yàn)程序金黃色葡萄球菌定性檢驗(yàn)程序見(jiàn)圖1。G B4 7 8 9.1 02 0 1 62 圖1 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)程序5 操作步驟5.1 樣品的處理稱取2 5g樣品至盛有2 2 5m L7.5%氯化鈉肉湯的無(wú)菌均質(zhì)杯內(nèi),80 0 0r/m i n 1 00 0 0r/m i n均質(zhì)1m i n 2m i n, 或放入盛有2 2 5m L7.5%氯化鈉肉湯無(wú)菌均質(zhì)袋中, 用拍擊式均質(zhì)器拍打1m i n2m i n。若樣品為液態(tài), 吸取2 5m L樣品至盛有2 2 5m L7.5%氯化鈉肉湯的無(wú)菌錐形瓶( 瓶?jī)?nèi)可預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無(wú)菌玻璃珠) 中, 振蕩混勻。5.2 增菌將上述樣品勻液于3 61培養(yǎng)1 8h2 4h。金黃色葡萄球菌在7.5%氯化鈉肉湯中呈混濁生長(zhǎng)。5.3 分離將增菌后的培養(yǎng)物, 分別劃線接種到B a i r d - P a r k e r平板和血平板, 血平板3 61培養(yǎng)1 8h2 4h。B a i r d - P a r k e r平板3 61培養(yǎng)2 4h4 8h。5.4 初步鑒定金黃色葡萄球菌在B a i r d - P a r k e r平板上呈圓形, 表面光滑、 凸起、 濕潤(rùn)、 菌落直徑為2mm3mm,顏色呈灰黑色至黑色, 有光澤, 常有淺色( 非白色) 的邊緣, 周圍繞以不透明圈( 沉淀) , 其外常有一清晰帶。當(dāng)用接種針觸及菌落時(shí)具有黃油樣黏稠感。有時(shí)可見(jiàn)到不分解脂肪的菌株, 除沒(méi)有不透明圈和清晰帶外, 其他外觀基本相同。從長(zhǎng)期貯存的冷凍或脫水食品中分離的菌落, 其黑色常較典型菌落淺些,且外觀可能較粗糙, 質(zhì)地較干燥。在血平板上, 形成菌落較大, 圓形、 光滑凸起、 濕潤(rùn)、 金黃色( 有時(shí)為白G B4 7 8 9.1 02 0 1 63 色) , 菌落周圍可見(jiàn)完全透明溶血圈。挑取上述可疑菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢及血漿凝固酶試驗(yàn)。5.5 確證鑒定5.5.1 染色鏡檢: 金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽(yáng)性球菌, 排列呈葡萄球狀, 無(wú)芽胞, 無(wú)莢膜, 直徑約為0.5m1m。5.5.2 血漿凝固酶試驗(yàn): 挑取B a i r d - P a r k e r平板或血平板上至少5個(gè)可疑菌落( 小于5個(gè)全選) , 分別接種到5m LB H I和營(yíng)養(yǎng)瓊脂小斜面,3 61培養(yǎng)1 8h2 4h。取新鮮配制兔血漿0.5m L, 放入小試管中, 再加入B H I培養(yǎng)物0.2m L0.3m L, 振蕩搖勻, 置3 61溫箱或水浴箱內(nèi), 每半小時(shí)觀察一次, 觀察6h, 如呈現(xiàn)凝固( 即將試管傾斜或倒置時(shí), 呈現(xiàn)凝塊) 或凝固體積大于原體積的一半, 被判定為陽(yáng)性結(jié)果。同時(shí)以血漿凝固酶試驗(yàn)陽(yáng)性和陰性葡萄球菌菌株的肉湯培養(yǎng)物作為對(duì)照。也可用商品化的試劑, 按說(shuō)明書操作, 進(jìn)行血漿凝固酶試驗(yàn)。結(jié)果如可疑, 挑取營(yíng)養(yǎng)瓊脂小斜面的菌落到5m LB H I,3 61培養(yǎng)1 8h4 8h, 重復(fù)試驗(yàn)。5.6 葡萄球菌腸毒素的檢驗(yàn)( 選做)可疑食物中毒樣品或產(chǎn)生葡萄球菌腸毒素的金黃色葡萄球菌菌株的鑒定, 應(yīng)按附錄B檢測(cè)葡萄球菌腸毒素。6 結(jié)果與報(bào)告6.1 結(jié)果判定: 符合5.4、5.5, 可判定為金黃色葡萄球菌。6.2 結(jié)果報(bào)告: 在2 5g(m L) 樣品中檢出或未檢出金黃色葡萄球菌。第二法 金黃色葡萄球菌平板計(jì)數(shù)法7 檢驗(yàn)程序金黃色葡萄球菌平板計(jì)數(shù)法檢驗(yàn)程序見(jiàn)圖2。圖2 金黃色葡萄球菌平板計(jì)數(shù)法檢驗(yàn)程序G B4 7 8 9.1 02 0 1 64 8 操作步驟8.1 樣品的稀釋8.1.1 固體和半固體樣品: 稱取2 5g樣品置于盛有2 2 5m L磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)杯內(nèi),80 0 0r/m i n 1 00 0 0r/m i n均質(zhì)1m i n2m i n, 或置于盛有2 2 5m L稀釋液的無(wú)菌均質(zhì)袋中, 用拍擊式均質(zhì)器拍打1m i n 2m i n, 制成11 0的樣品勻液。8.1.2 液體樣品: 以無(wú)菌吸管吸取2 5m L樣品置于盛有2 2 5m L磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌錐形瓶( 瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無(wú)菌玻璃珠) 中, 充分混勻, 制成11 0的樣品勻液。8.1.3 用1m L無(wú)菌吸管或微量移液器吸取11 0樣品勻液1m L, 沿管壁緩慢注于盛有9m L磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌試管中( 注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面) , 振搖試管或換用1支1m L無(wú)菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻, 制成11 0 0的樣品勻液。8.1.4 按8.1.3操作程序, 制備1 0倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次, 換用1次1m L無(wú)菌吸管或吸頭。8.2 樣品的接種根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì), 選擇2個(gè)3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液( 液體樣品可包括原液) , 在進(jìn)行1 0倍遞增稀釋的同時(shí), 每個(gè)稀釋度分別吸取1m L樣品勻液以0.3m L、0.3m L、0.4m L接種量分別加入三塊B a i r d - P a r k e r平板, 然后用無(wú)菌涂布棒涂布整個(gè)平板, 注意不要觸及平板邊緣。使用前, 如B a i r d - P a r k e r平板表面有水珠, 可放在2 55 0的培養(yǎng)箱里干燥, 直到平板表面的水珠消失。8.3 培養(yǎng)在通常情況下, 涂布后, 將平板靜置1 0m i n, 如樣液不易吸收, 可將平板放在培養(yǎng)箱3 61培養(yǎng)1h; 等樣品勻液吸收后翻轉(zhuǎn)平板, 倒置后于3 61培養(yǎng)2 4h4 8h。8.4 典型菌落計(jì)數(shù)和確認(rèn)8.4.1 金黃色葡萄球菌在B a i r d - P a r k e r平板上呈圓形, 表面光滑、 凸起、 濕潤(rùn)、 菌落直徑為2 mm3mm, 顏色呈灰黑色至黑色, 有光澤, 常有淺色( 非白色) 的邊緣, 周圍繞以不透明圈( 沉淀) , 其外常有一清晰帶。當(dāng)用接種針觸及菌落時(shí)具有黃油樣黏稠感。有時(shí)可見(jiàn)到不分解脂肪的菌株, 除沒(méi)有不透明圈和清晰帶外, 其他外觀基本相同。從長(zhǎng)期貯存的冷凍或脫水食品中分離的菌落, 其黑色常較典型菌落淺些, 且外觀可能較粗糙, 質(zhì)地較干燥。8.4.2 選擇有典型的金黃色葡萄球菌菌落的平板, 且同一稀釋度3個(gè)平板所有菌落數(shù)合計(jì)在2 0C F U2 0 0C F U之間的平板, 計(jì)數(shù)典型菌落數(shù)。8.4.3 從典型菌落中至少選5個(gè)可疑菌落( 小于5個(gè)全選) 進(jìn)行鑒定試驗(yàn)。分別做染色鏡檢, 血漿凝固酶試驗(yàn)( 見(jiàn)5.5) ; 同時(shí)劃線接種到血平板3 61培養(yǎng)1 8h2 4h后觀察菌落形態(tài), 金黃色葡萄球菌菌落較大, 圓形、 光滑凸起、 濕潤(rùn)、 金黃色( 有時(shí)為白色) , 菌落周圍可見(jiàn)完全透明溶血圈。9 結(jié)果計(jì)算9.1 若只有一個(gè)稀釋度平板的典型菌落數(shù)在2 0C F U2 0 0C F U之間, 計(jì)數(shù)該稀釋度平板上的典型菌G B4 7 8 9.1 02 0 1 65 落, 按式(1) 計(jì)算。9.2 若最低稀釋度平板的典型菌落數(shù)小于2 0C F U, 計(jì)數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落, 按式(1) 計(jì)算。9.3 若某一稀釋度平板的典型菌落數(shù)大于2 0 0C F U, 但下一稀釋度平板上沒(méi)有典型菌落, 計(jì)數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落, 按式(1) 計(jì)算。9.4 若某一稀釋度平板的典型菌落數(shù)大于2 0 0C F U, 而下一稀釋度平板上雖有典型菌落但不在2 0C F U2 0 0C F U范圍內(nèi), 應(yīng)計(jì)數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落, 按式(1) 計(jì)算。9.5 若2個(gè)連續(xù)稀釋度的平板典型菌落數(shù)均在2 0C F U2 0 0C F U之間, 按式(2) 計(jì)算。9.6 計(jì)算公式式(1) :T=A BC d(1) 式中:T 樣品中金黃色葡萄球菌菌落數(shù);A 某一稀釋度典型菌落的總數(shù);B 某一稀釋度鑒定為陽(yáng)性的菌落數(shù);C 某一稀釋度用于鑒定試驗(yàn)的菌落數(shù);d 稀釋因子。式(2) :T=A1B1/C1+A2B2/C21.1d(2) 式中:T 樣品中金黃色葡萄球菌菌落數(shù);A1 第一稀釋度( 低稀釋倍數(shù)) 典型菌落的總數(shù);B1 第一稀釋度( 低稀釋倍數(shù)) 鑒定為陽(yáng)性的菌落數(shù);C1 第一稀釋度( 低稀釋倍數(shù)) 用于鑒定試驗(yàn)的菌落數(shù);A2 第二稀釋度( 高稀釋倍數(shù)) 典型菌落的總數(shù);B2 第二稀釋度( 高稀釋倍數(shù)) 鑒定為陽(yáng)性的菌落數(shù);C2 第二稀釋度( 高稀釋倍數(shù)) 用于鑒定試驗(yàn)的菌落數(shù);1.1 計(jì)算系數(shù);d 稀釋因子( 第一稀釋度) 。1 0 報(bào)告根據(jù)9中公式計(jì)算結(jié)果, 報(bào)告每g(m L) 樣品中金黃色葡萄球菌數(shù), 以C F U/g(m L) 表示; 如T值為0, 則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報(bào)告。第三法 金黃色葡萄球菌MP N計(jì)數(shù)1 1 檢驗(yàn)程序金黃色葡萄球菌MP N計(jì)數(shù)檢驗(yàn)程序見(jiàn)圖3。G B4 7 8 9.1 02 0 1 66 圖3 金黃色葡萄球菌MP N法檢驗(yàn)程序1 2 操作步驟1 2.1 樣品的稀釋按8.1進(jìn)行。1 2.2 接種和培養(yǎng)1 2.2.1 根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì), 選擇3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液( 液體樣品可包括原液) , 在進(jìn)行1 0倍遞增稀釋的同時(shí), 每個(gè)稀釋度分別接種1 m L樣品勻液至7.5%氯化鈉肉湯管( 如接種量超過(guò)1m L, 則用雙料7.5%氯化鈉肉湯) , 每個(gè)稀釋度接種3管, 將上述接種物3 61培養(yǎng),1 8h2 4h。1 2.2.2 用接種環(huán)從培養(yǎng)后的7.5%氯化鈉肉湯管中分別取培養(yǎng)物1環(huán), 移種于B a i r d - P a r k e r平板3 61培養(yǎng),2 4h4 8h。1 2.3 典型菌落確認(rèn)按8.4.1、8.4.3進(jìn)行。1 3 結(jié)果與報(bào)告根據(jù)證實(shí)為金黃色葡萄球菌陽(yáng)性的試管管數(shù), 查MP N檢索表( 見(jiàn)附錄C) , 報(bào)告每g(m L) 樣品中金黃色葡萄球菌的最可能數(shù), 以MP N/g(m L) 表示。G B4 7 8 9.1 02 0 1 67 附 錄 A培養(yǎng)基和試劑A.1 7.5%氯化鈉肉湯A.1.1 成分蛋白胨 1 0.0g牛肉膏 5.0g氯化鈉 7 5g蒸餾水 10 0 0m LA.1.2 制法將上述成分加熱溶解, 調(diào)節(jié)p H至7.40.2, 分裝, 每瓶2 2 5m L,1 2 1高壓滅菌1 5m i n。A.2 血瓊脂平板A.2.1 成分豆粉瓊脂(p H7.50.2)1 0 0m L脫纖維羊血( 或兔血)5m L1 0m LA.2.2 制法加熱溶化瓊脂, 冷卻至5 0, 以無(wú)菌操作加入脫纖維羊血, 搖勻, 傾注平板。A.3 B a i r d - P a r k e r瓊脂平板A.3.1 成分胰蛋白胨 1 0.0g牛肉膏 5.0g酵母膏 1.0g丙酮酸鈉 1 0.0g甘氨酸 1 2.0g氯化鋰(L i C l6 H2O)5.0g瓊脂 2 0.0g蒸餾水 9 5 0m LA.3.2 增菌劑的配法3 0%卵黃鹽水5 0m L與通過(guò)0.2 2m孔徑濾膜進(jìn)行過(guò)濾除菌的1%亞碲酸鉀溶液1 0m L混合, 保存于冰箱內(nèi)。G B4 7 8 9.1 02 0 1 68 A.3.3 制法將各成分加到蒸餾水中, 加熱煮沸至完全溶解, 調(diào)節(jié)p H至7.00.2。分裝每瓶9 5m L,1 2 1高壓滅菌1 5m i n。臨用時(shí)加熱溶化瓊脂, 冷至5 0 , 每9 5m L加入預(yù)熱至5 0 的卵黃亞碲酸鉀增菌劑5m L搖勻后傾注平板。培養(yǎng)基應(yīng)是致密不透明的。使用前在冰箱儲(chǔ)存不得超過(guò)4 8h。A.4 腦心浸出液肉湯(B H I)A.4.1 成分胰蛋白質(zhì)胨 1 0.0g氯化鈉 5.0g磷酸氫二鈉(1 2 H2O)2.5g葡萄糖 2.0g牛心浸出液 5 0 0m LA.4.2 制法加熱溶解, 調(diào)節(jié)p H至7.40.2, 分裝1 6mm1 6 0mm試管, 每管5m L置1 2 1,1 5m i n滅菌。A.5 兔血漿取檸檬酸鈉3.8g, 加蒸餾水1 0 0m L, 溶解后過(guò)濾, 裝瓶,1 2 1高壓滅菌1 5m i n。兔血漿制備: 取3.8%檸檬酸鈉溶液一份, 加兔全血4份, 混好靜置( 或以30 0 0r/m i n離心3 0m i n) , 使血液細(xì)胞下降, 即可得血漿。A.6 磷酸鹽緩沖液A.6.1 成分磷酸二氫鉀(KH2P O4) 3 4.0g蒸餾水 5 0 0m LA.6.2 制法貯存液: 稱取3 4.0g的磷酸二氫鉀溶于5 0 0m L蒸餾水中, 用大約1 7 5m L的1m o l/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)p H至7.2, 用蒸餾水稀釋至10 0 0m L后貯存于冰箱。稀釋液: 取貯存液1.2 5 m L, 用蒸餾水稀釋至10 0 0 m L, 分裝于適宜容器中,1 2 1 高壓滅菌1 5m i n。A.7 營(yíng)養(yǎng)瓊脂小斜面A.7.1 成分蛋白胨 1 0.0gG B4 7 8 9.1 02 0 1 69 牛肉膏 3.0g氯化鈉 5.0g瓊脂 1 5.0g 2 0.0g蒸餾水 10 0 0m LA.7.2 制法將除瓊脂以外的各成分溶解于蒸餾水內(nèi), 加入1 5%氫氧化鈉溶液約2m L調(diào)節(jié)p H至7.30.2。加入瓊脂, 加熱煮沸, 使瓊脂溶化, 分裝1 3mm1 3 0mm試管,1 2 1高壓滅菌1 5m i n。A.8 革蘭氏染色液A.8.1 結(jié)晶紫染色液A.8.1.1 成分結(jié)晶紫 1.0g9 5%乙醇 2 0.0m L1%草酸銨水溶液 8 0.0m LA.8.1.2 制法將結(jié)晶紫完全溶解于乙醇中, 然后與草酸銨溶液混合。A.8.2 革蘭氏碘液A.8.2.1 成分碘 1.0g碘化鉀 2.0g蒸餾水 3 0 0m LA.8.2.2 制法將碘與碘化鉀先行混合, 加入蒸餾水少許充分振搖, 待完全溶解后, 再加蒸餾水至3 0 0m L。A.8.3 沙黃復(fù)染液A.8.3.1 成分沙黃 0.2 5g9 5%乙醇 1 0.0m L蒸餾水 9 0.0m LA.8.3.2 制法將沙黃溶解于乙醇中, 然后用蒸餾水稀釋。A.8.4 染色法a) 涂片在火焰上固定, 滴加結(jié)晶紫染液, 染1m i n, 水洗。G B4 7 8 9.1 02 0 1 61 0 b) 滴加革蘭氏碘液, 作用1m i n, 水洗。c) 滴加9 5%乙醇脫色約1 5s 3 0s, 直至染色液被洗掉, 不要過(guò)分脫色, 水洗。d) 滴加復(fù)染液, 復(fù)染1m i n, 水洗、 待干、 鏡檢。A.9 無(wú)菌生理鹽水A.9.1 成分氯化鈉 8.5g蒸餾水 10 0 0m LA.9.2 制法稱取8.5g氯化鈉溶于10 0 0m L蒸餾水中,1 2 1高壓滅菌1 5m i n。G B4 7 8 9.1 02 0 1 61 1 附 錄 B葡萄球菌腸毒素檢驗(yàn)B.1 試劑和材料除另有規(guī)定外, 所用試劑均為分析純, 試驗(yàn)用水應(yīng)符合G B/T6 6 8 2對(duì)一級(jí)水的規(guī)定。B.1.1 A、B、C、D、E型金黃色葡萄球菌腸毒素分型E L I S A檢測(cè)試劑盒。B.1.2 p H試紙, 范圍在3.58.0, 精度0.1。B.1.3 0.2 5m o l/L、p H8.0的T r i s緩沖液: 將1 2 1.1g的T r i s溶解到8 0 0m L的去離子水中, 待溫度冷至室溫后, 加4 2m L濃HC L, 調(diào)p H至8.0。B.1.4 p H 7. 4的磷 酸 鹽 緩 沖 液: 稱 取N a H2P O4H2O0. 5 5g( 或N a H2P O42 H2O0. 6 2g) 、N a2H P O42 H2O2.8 5g( 或N a2H P O41 2 H2O5.7 3g) 、N a C l 8.7g溶于10 0 0m L蒸餾水中, 充分混勻即可。B.1.5 庚烷。B.1.6 1 0%次氯酸鈉溶液。B.1.7 腸毒素產(chǎn)毒培養(yǎng)基B.1.7.1 成分蛋白胨 2 0.0g胰消化酪蛋白 2 0 0m g( 氨基酸)氯化鈉 5.0g磷酸氫二鉀 1.0g磷酸二氫鉀 1.0g氯化鈣 0.1g硫酸鎂 0.2g菸酸 0.0 1g蒸餾水 10 0 0m Lp H7.30.2B.1.7.2 制法將所有成分混于水中, 溶解后調(diào)節(jié)p H,1 2 1高壓滅菌3 0m i n。B.1.8 營(yíng)養(yǎng)瓊脂B.1.8.1 成分蛋白胨 1 0.0g牛肉膏 3.0g氯化鈉 5.0g瓊脂 1 5.0g 2 0.0g蒸餾水 10 0 0m LB.1.8.2 制法將除瓊脂以外的各成分溶解于蒸餾水內(nèi), 加入1 5%氫氧化鈉溶液約2m L校正p H至7.30.2。G B4 7 8 9.1 02 0 1 61 2 加入瓊脂, 加熱煮沸, 使瓊脂溶化。分裝燒瓶,1 2 1高壓滅菌1 5m i n。B.2 儀器和設(shè)備B.2.1 電子天平: 感量0.0 1g。B.2.2 均質(zhì)器。B.2.3 離心機(jī): 轉(zhuǎn)速30 0 0g50 0 0g。B.2.4 離心管:5 0m L。B.2.5 濾器: 濾膜孔徑0.2m。B.2.6 微量加樣器:2 0L2 0 0L、2 0 0L10 0 0L。B.2.7 微量多通道加樣器:5 0L3 0 0L。B.2.8 自動(dòng)洗板機(jī)( 可選擇使用) 。B.2.9 酶標(biāo)儀: 波長(zhǎng)4 5 0n m。B.3 原理本方法可用A、B、C、D、E型金黃色葡萄球菌腸毒素分型酶聯(lián)免疫吸附試劑盒完成。本方法測(cè)定的基礎(chǔ)是酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)(E L I S A) 。9 6孔酶標(biāo)板的每一個(gè)微孔條的AE孔分別包被了A、B、C、D、E型葡萄球菌腸毒素抗體,H孔為陽(yáng)性質(zhì)控, 已包被混合型葡萄球菌腸毒素抗體,F和G孔為陰性質(zhì)控,包被了非免疫動(dòng)物的抗體。樣品中如果有葡萄球菌腸毒素, 游離的葡萄球菌腸毒素則與各微孔中包被的特定抗體結(jié)合, 形成抗原抗體復(fù)合物, 其余未結(jié)合的成分在洗板過(guò)程中被洗掉; 抗原抗體復(fù)合物再與過(guò)氧化物酶標(biāo)記物( 二抗) 結(jié)合, 未結(jié)合上的酶標(biāo)記物在洗板過(guò)程中被洗掉; 加入酶底物和顯色劑并孵育, 酶標(biāo)記物上的酶催化底物分解, 使無(wú)色的顯色劑變?yōu)樗{(lán)色; 加入反應(yīng)終止液可使顏色由藍(lán)變黃, 并終止了酶反應(yīng); 以4 5 0n m波長(zhǎng)的酶標(biāo)儀測(cè)量微孔溶液的吸光度值, 樣品中的葡萄球菌腸毒素與吸光度值成正比。B.4 檢測(cè)步驟B.4.1 從分離菌株培養(yǎng)物中檢測(cè)葡萄球菌腸毒素方法待測(cè)菌株接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面( 試管1 8mm1 8 0mm)3 6培養(yǎng)2 4h, 用5m L生理鹽水洗下菌落,傾入6 0m L產(chǎn)毒培養(yǎng)基中,3 6 振蕩培養(yǎng)4 8h, 振速為1 0 0次/m i n, 吸出菌液離心,80 0 0r/m i n2 0m i n, 加熱1 0 0,1 0m i n, 取上清液, 取1 0 0L稀釋后的樣液進(jìn)行試驗(yàn)。B.4.2 從食品中提取和檢測(cè)葡萄球菌毒素方法B.4.2.1 牛奶和奶粉將2 5g奶粉溶解到1 2 5m L、0.2 5M、p H 8.0的T r i s緩沖液中, 混勻后同液體牛奶一樣按以下步驟制備。將牛奶于1 5,35 0 0g離心1 0m i n。將表面形成的一層脂肪層移走, 變成脫脂牛奶。用蒸餾水對(duì)其進(jìn)行稀釋(12 0) 。取1 0 0L稀釋后的樣液進(jìn)行試驗(yàn)。B.4.2.2 脂肪含量不超過(guò)4 0%的食品稱取1 0g樣品絞碎, 加入p H7.4的P B S液1 5m L進(jìn)行均質(zhì)。振搖1 5m i n。于1 5,35 0 0g離心G B4 7 8 9.1 02 0 1 61 3 1 0m i n。必要時(shí), 移去上面脂肪層。取上清液進(jìn)行過(guò)濾除菌。取1 0 0L的濾出液進(jìn)行試驗(yàn)。B.4.2.3 脂肪含量超過(guò)4 0%的食品稱取1 0g樣品絞碎, 加入p H7.4的P B S液1 5m L進(jìn)行均質(zhì)。振搖1 5m i n。于1 5,35 0 0g離心1 0m i n。吸取5m L上層懸浮液, 轉(zhuǎn)移到另外一個(gè)離心管中, 再加入5m L的庚烷, 充分混勻5m i n。于1 5,35 0 0g離心5m i n。將上部有機(jī)相( 庚烷層) 全部棄去, 注意該過(guò)程中不要?dú)埩舾?。將下部水相層進(jìn)行過(guò)濾除菌。取1 0 0L的濾出液進(jìn)行試驗(yàn)。B.4.2.4 其他食品可酌情參考上述食品處理方法。B.4.3 檢測(cè)B.4.3.1 所有操作均應(yīng)在室溫(2 0 2 5 ) 下進(jìn)行,A、B、C、D、E型金黃色葡萄球菌腸毒素分型E L I S A檢測(cè)試劑盒中所有試劑的溫度均應(yīng)回升至室溫方可使用。測(cè)定中吸取不同的試劑和樣品溶液時(shí)應(yīng)更換吸頭, 用過(guò)的吸頭以及廢液處理前要浸泡到1 0%次氯酸鈉溶液中過(guò)夜。B.4.3.2 將所需數(shù)量的微孔條插入框架中( 一個(gè)樣品需要一個(gè)微孔條) 。將樣品液加入微孔條的AG孔, 每孔1 0 0L。H孔加1 0 0L的陽(yáng)性對(duì)照, 用手輕拍微孔板充分混勻, 用黏膠紙封住微孔以防溶液揮發(fā), 置室溫下孵育1h。B.4.3.3 將孔中液體傾倒至含1 0%次氯酸鈉溶液的容器中, 并在吸水紙上拍打