GB4789.11-2014食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)β型溶血性鏈球菌檢驗(yàn).pdf

中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn) GB 4789.11-2014 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 型溶血性鏈球菌檢驗(yàn) 2014-12-01 發(fā)布 2015-05-01 實(shí)施 GB 4789.112014 I 前 言 本標(biāo)準(zhǔn)代替 GB/T 4789.112003食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 溶血性鏈球菌檢驗(yàn) 。 本標(biāo)準(zhǔn)與GB/T 4789.112003 相比， 主要變化如下： 修改了標(biāo)準(zhǔn)名稱； 修改了范圍； 增加了術(shù)語和定義； 修改了設(shè)備與材料； 修改了培養(yǎng)基與試劑； 刪除了以無菌生理鹽水稀釋樣品的步驟和桿菌肽敏感試驗(yàn)； 增加了觸酶試驗(yàn)； 增加了附錄A。 GB 4789.112014 1 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 型溶血性鏈球菌檢驗(yàn) 1 范圍 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中 型溶血性鏈球菌（Streptococcus）的檢驗(yàn)方法。 本標(biāo)準(zhǔn)適用于食品中 型溶血性鏈球菌的檢驗(yàn)。 2 術(shù)語和定義 2.1 型溶血 在菌落周圍形成完全透明的溶血環(huán)，紅細(xì)胞完全溶解。 2.2 型溶血性鏈球菌 能夠產(chǎn)生 型溶血的化膿（或 A 群）鏈球菌（Streptococcus pyogenes）和無乳（或 B 群）鏈球菌（Streptococcus agalactiae） 。 3 設(shè)備和材料 除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下： a) 恒溫培養(yǎng)箱： 36 1 ； b) 冰箱：2 5 ； c) 厭氧培養(yǎng)裝置； d) 天平：感量 0.1 g； e) 均質(zhì)器與配套均質(zhì)袋； f) 顯微鏡：10 倍100 倍； g) 無菌吸管：1 mL（具 0.01 mL 刻度） 、10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸頭； h) 無菌錐形瓶：容量 100 mL、200 mL、2 000 mL； i) 無菌培養(yǎng)皿：直徑 90 mm； j) pH 計(jì)或 pH 比色管或精密 pH 試紙； k) 水浴裝置：36 1 ； l) 微生物生化鑒定系統(tǒng)。 4 培養(yǎng)基和試劑 4.1 改良胰蛋白胨大豆肉湯（Modified tryptone soybean broth, mTSB） ：見附錄 A 中 A.1。 4.2 哥倫比亞 CNA 血瓊脂(Columbia CNA blood agar)：見附錄 A 中 A.2。 4.3 哥倫比亞血瓊脂(Columbia blood agar)：見附錄 A 中 A.3。 4.4 革蘭氏染色液：見附錄 A 中 A.4。 4.5 胰蛋白胨大豆肉湯（Tryptone soybean broth, TSB） ：見附錄 A 中 A.5。 4.6 草酸鉀血漿：見附錄 A 中 A.6。 GB 4789.112014 2 4.7 0.25氯化鈣(CaCl2)溶液：見附錄 A 中 A.7。 4.8 3過氧化氫(H2O2)溶液：見附錄 A 中 A.8。 4.9 生化鑒定試劑盒或生化鑒定卡。 5 檢驗(yàn)程序 溶血性鏈球菌檢驗(yàn)程序見圖 1。 圖1 溶血性鏈球菌檢驗(yàn)程序 6 操作步驟 6.1 樣品處理及增菌 按無菌操作稱取檢樣 25 g （mL） ， 加入盛有 225 mL mTSB 的均質(zhì)袋中， 用拍擊式均質(zhì)器均質(zhì) 1 min2 min；或加入盛有 225 mL mTSB 的均質(zhì)杯中，以 8000 r/min10000 r/min 均質(zhì) 1 min2 min。若樣品為液態(tài)，振蕩均勻即可。36 1 培養(yǎng) 18 h24 h。 6.2 分離 將增菌液劃線接種于哥倫比亞 CNA 血瓊脂平板，36 1 厭氧培養(yǎng) 18 h24 h，觀察菌落形態(tài)。 溶血性鏈球菌在哥倫比亞 CNA 血瓊脂平板上的典型菌落形態(tài)為直徑約 2 mm3 mm， 灰白色、 半透18 h 24 h 樣品 25g（或 mL）+ 225 mL mTSB 劃線接種哥倫比亞 CNA 血瓊脂平板 革蘭氏染色鏡檢/觸酶試驗(yàn) 確定鑒定 生化鑒定 鏈激酶試驗(yàn) (選做項(xiàng)目) 報(bào) 告 挑取可疑菌落，接種哥倫比亞血瓊脂平板和 TSB 36 1 18 h24 h ，厭氧培養(yǎng) 36 1 18 h24 h 36 1 GB 4789.112014 3 明、光滑、表面突起、圓形、邊緣整齊，并產(chǎn)生 型溶血。 6.3 鑒定 6.3.1 分純培養(yǎng) 挑取 5 個(gè) （如小于 5 個(gè)則全選） 可疑菌落分別接種哥倫比亞血瓊脂平板和 TSB 增菌液， 36 1 培養(yǎng) 18 h24 h。 6.3.2 革蘭氏染色鏡檢 挑取可疑菌落染色鏡檢。 型溶血性鏈球菌為革蘭氏染色陽性，球形或卵圓形，常排列成短鏈狀。 6.3.3 觸酶試驗(yàn) 挑取可疑菌落于潔凈的載玻片上，滴加適量 3%過氧化氫溶液，立即產(chǎn)生氣泡者為陽性。 型溶血性鏈球菌觸酶為陰性。 6.3.4 鏈激酶試驗(yàn)（選做項(xiàng)目） 吸取草酸鉀血漿 0.2 mL 于 0.8 mL 滅菌生理鹽水中混勻，再加入經(jīng) 36 1 培養(yǎng) 18 h24 h 的可疑菌的 TSB 培養(yǎng)液 0.5 mL 及 0.25%氯化鈣溶液 0.25 mL，振蕩搖勻，置于 36 1 水浴中 10 min，血漿混合物自行凝固（凝固程度至試管倒置，內(nèi)容物不流動(dòng)） 。繼續(xù) 36 1 培養(yǎng) 24 h，凝固塊重新完全溶解為陽性，不溶解為陰性， 型溶血性鏈球菌為陽性。 6.3.5 其他檢驗(yàn) 使用生化鑒定試劑盒或生化鑒定卡對(duì)可疑菌落進(jìn)行鑒定。 7 結(jié)果與報(bào)告 綜合以上試驗(yàn)結(jié)果，報(bào)告每 25 g（mL）檢樣中檢出或未檢出溶血性鏈球菌。 GB 4789.112014 4 附錄 A 培養(yǎng)基與試劑 A.1 改良胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（Modified tryptone soybean broth, mTSB） A.1.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基（胰蛋白胨大豆肉湯 TSB） A.1.1.1 成分 胰蛋白胨 17.0 g 大豆蛋白胨 3.0 g 氯化鈉 5.0 g 磷酸二氫鉀（無水） 2.5 g 葡萄糖 2.5 g 蒸餾水 1000.0 mL A.1.1.2 制法 將A.1.1.1中各成分溶于蒸餾水中，加熱溶解，校正pH至7.3 0.2，121 滅菌15 min，備用。 A.1.2 抗生素溶液 A.1.2.1 多黏菌素溶液 稱取10 mg多黏菌素B于10 mL滅菌蒸餾水中，振搖混勻, 充分溶解后過濾除菌。 A.1.2.2 萘啶酮酸鈉溶液 稱取10 mg萘啶酮酸于10 mL 0.05 mol/L氫氧化鈉溶液中，振搖混勻,充分溶解后過濾除菌。 A.1.3 完全培養(yǎng)基 A.1.3.1 成分 胰蛋白胨大豆肉湯(TSB) 1 000.0 mL 多黏菌素溶液 10.0 mL 萘啶酮酸鈉溶液 10.0 mL A.1.3.2 制法 無菌條件下，將A.1.3.1中各成分進(jìn)行混合，充分混勻，分裝備用。 A.2 哥倫比亞CNA血瓊脂(Columbia CNA blood agar) A.2.1 成分 胰酪蛋白胨 12.0 g 動(dòng)物組織蛋白消化液 5.0 g 酵母提取物 3.0 g 牛肉提取物 3.0 g GB 4789.112014 5 玉米淀粉 1.0 g 氯化鈉 5.0 g 瓊脂 13.5 g 多黏菌素 0.01 g 萘啶酸 0.01 g 蒸餾水 1000.0 mL A.2.2 制法 將 A.2.1 中各成分溶于蒸餾水中，加熱溶解，校正 pH 至 7.3 0.2，121 滅菌 12 min，待冷卻至50 左右時(shí)加 50 mL；無菌脫纖維綿羊血，搖勻后倒平板。 A.3 哥倫比亞血瓊脂(Columbia blood agar) A.3.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 A.3.1.1 成分 動(dòng)物組織酶解物 23.0 g 淀粉 1.0 g 氯化鈉 5.0 g 瓊脂 8.0 g18.0 g 蒸餾水 1 000.0 mL A.3.1.2 制法 將基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分溶解于蒸餾水中，加熱促其溶解。121 高壓滅菌 15 min。 A.3.2 無菌脫纖維綿羊血 無菌操作條件下，將綿羊血加入到盛有滅菌玻璃珠的容器中，振搖約 10 min，靜置后除去附有血纖維的玻璃珠即可。 A.3.3 完全培養(yǎng)基 A.3.3.1 組分 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 1 000.0 mL 無菌脫纖維綿羊血 50.0 mL A.3.3.2 制法 當(dāng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基的溫度為 45 左右時(shí)，無菌加入綿羊血，混勻。校正 pH 至 7.20.2。傾注 15 mL 于無菌平皿中，靜置至培養(yǎng)基凝固。使用前需預(yù)先干燥平板。預(yù)先制備的平板未干燥時(shí)在室溫放置不得超過 4 h，或在 4 冷藏不得超過 7 d。 A.4 革蘭氏染色液 A.4.1 結(jié)晶紫染色液基礎(chǔ)培養(yǎng)基 A.4.1.1 成分 GB 4789.112014 6 結(jié)晶紫 1.0 g 95乙醇 20.0 mL 1草酸銨水溶液 80.0 mL A.4.1.2 制法 將結(jié)晶紫完全溶解于乙醇中，然后與草酸銨溶液混合。 A.4.2 革蘭氏碘液 A.4.2.1 成分 碘 1.0 g 碘化鉀 2.0 g 蒸餾水 300.0 mL A.4.2.2 制法 將碘與碘化鉀先進(jìn)行混合，加入蒸餾水少許充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水至 300 mL。 A.4.3 沙黃復(fù)染液 A.4.3.1 成分 沙黃 0.25 g 95乙醇 10.0 mL 蒸餾水 90.0 mL A.4.3.2 制法 將沙黃溶解于乙醇中，然后用蒸餾水稀釋。 A.4.4 染色操作步驟 將涂片在酒精燈火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染色液，染 1 min，水洗；滴加革蘭氏碘液，作用 1 min，水洗；滴加 95乙醇脫色，約 15 s30 s，直至染色液被洗掉，不要過分脫色，水洗；滴加復(fù)染液，復(fù)染 1 min，水洗后進(jìn)行干燥，鏡檢。 A.5 胰蛋白胨大豆肉湯（Tryptone soybean broth, TSB） A.5.1 成分 胰蛋白胨 17.0 g 大豆蛋白胨 3.0 g 氯化鈉 5.0 g 磷酸二氫鉀（無水） 2.5 g 葡萄糖 2.5 g 蒸餾水 1000.0 mL A.5.2 制法 將A.5.1中各成分溶于蒸餾水中，加熱溶解，校正pH至7.3 0.2，121 滅菌15 min，分裝備用。 GB 4789.112014 7 A.6 草酸鉀血漿 A.6.1 成分 草酸鉀 0.01 g 人血 5.0 mL A.6.2 制法 草酸鉀0.01 g放入滅菌小試管中，再加入5 mL人血，混勻，經(jīng)離心沉淀，