GB4789.36-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸埃希氏菌O157H7NM檢驗(yàn).pdf

中 華 人 民 共 和 國 國 家 標(biāo) 準(zhǔn)G B4 7 8 9 .3 62 0 1 6食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸埃希氏菌O 1 5 7:H 7/NM檢驗(yàn)2 0 1 6 - 1 2 - 2 3發(fā)布2 0 1 7 - 0 6 - 2 3實(shí)施中華人民共和國國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)國 家 食 品 藥 品 監(jiān) 督 管 理 總 局發(fā) 布G B4 7 8 9.3 62 0 1 6 前 言 本標(biāo)準(zhǔn)代替G B/T4 7 8 9.3 62 0 0 8 食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸埃希氏菌O 1 5 7:H 7/NM檢驗(yàn) 。本標(biāo)準(zhǔn)與G B/T4 7 8 9.3 62 0 0 8相比, 主要變化如下: 標(biāo)準(zhǔn)名稱修改為“ 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸埃希氏菌O 1 5 7:H 7/NM檢驗(yàn)” ; 修改了標(biāo)準(zhǔn)的范圍; 修改了設(shè)備和材料; 修改了培養(yǎng)基和生化反應(yīng)的文字描述; 刪除“ 第二法 免疫磁珠捕獲法的原理” ; 刪除“ 第三法 全自動(dòng)酶聯(lián)熒光免疫分析儀篩選法” ; 刪除“ 第四法 全自動(dòng)病原菌檢測(cè)系統(tǒng)篩選法” 。G B4 7 8 9.3 62 0 1 61 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸埃希氏菌O 1 5 7:H 7/NM檢驗(yàn)1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中大腸埃希氏菌O 1 5 7:H 7/NM(E s c h e r i c h i ac o l iO 1 5 7:H 7/NM) 的檢驗(yàn)方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于食品中大腸埃希氏菌O 1 5 7:H 7/NM的檢驗(yàn)。2 設(shè)備和材料除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外, 其他設(shè)備和材料如下:2.1 恒溫培養(yǎng)箱:3 61。2.2 冰箱:25。2.3 恒溫水浴箱:4 61。2.4 天平: 感量0.1g、0.0 1g。2.5 均質(zhì)器。2.6 顯微鏡:1 0倍1 0 0倍。2.7 無菌吸管:1m L( 具0.0 1m L刻度) 、1 0m L( 具0.1m L刻度) 或移液器及吸頭。2.8 無菌均質(zhì)杯或無菌均質(zhì)袋: 容量5 0 0m L。2.9 無菌培養(yǎng)皿: 直徑9 0mm。2.1 0 p H計(jì)或精密p H試紙。2.1 1 長(zhǎng)波紫外光燈:3 6 5n m, 功率6W。2.1 2 微量離心管:1.5m L或2.0m L。2.1 3 磁板、 磁板架、 樣品混合器。2.1 4 微生物鑒定系統(tǒng)。3 培養(yǎng)基和試劑3.1 改良E C肉湯(m E C+n) : 見A.1。3.2 改良山梨醇麥康凱瓊脂(C T - S MA C) : 見A.2。3.3 三糖鐵瓊脂(T S I) : 見A.3。3.4 營養(yǎng)瓊脂: 見A.4。3.5 半固體瓊脂: 見A.5。3.6 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯- MUG(MUG - L S T) : 見A.6。3.7 氧化酶試劑: 見A.7。3.8 革蘭氏染色液: 見A.8。3.9 P B S - T w e e n2 0洗液: 見A.9。3.1 0 亞碲酸鉀(A R級(jí)) 。G B4 7 8 9.3 62 0 1 62 3.1 1 頭孢克肟(C e f i x i m e) 。3.1 2 大腸埃希氏菌O 1 5 7顯色培養(yǎng)基。3.1 3 大腸埃希氏菌O 1 5 7和H 7診斷血清或O 1 5 7乳膠凝集試劑。3.1 4 鑒定試劑盒。3.1 5 抗-E.c o l iO 1 5 7免疫磁珠。第一法 常規(guī)培養(yǎng)法4 檢驗(yàn)程序大腸埃希氏菌O 1 5 7:H 7/NM常規(guī)培養(yǎng)法檢驗(yàn)程序見圖1。圖1 大腸埃希氏菌O 1 5 7:H 7/NM常規(guī)培養(yǎng)法檢驗(yàn)程序5 操作步驟5.1 增菌以無菌操作取檢樣2 5g( 或2 5m L) 加入到含有2 2 5m Lm E C+n肉湯的均質(zhì)袋中, 在拍擊式均質(zhì)器上連續(xù) 均 質(zhì)1 m i n2 m i n; 或 放 入 盛 有2 2 5 m L m E C+n肉 湯 的 均 質(zhì) 杯 中,80 0 0r/m i n1 00 0 0r/m i n均質(zhì)1m i n 2m i n。3 61培養(yǎng)1 8h2 4h。G B4 7 8 9.3 62 0 1 63 5.2 分離取增菌后的m E C+n肉湯, 劃線接種于C T - S MA C平板和大腸埃希氏菌O 1 5 7顯色瓊脂平板上,3 61培養(yǎng)1 8h2 4h, 觀察菌落形態(tài)。在C T - S MA C平板上, 典型菌落為圓形、 光滑、 較小的無色菌落, 中心呈現(xiàn)較暗的灰褐色; 在大腸埃希氏菌O 1 5 7顯色瓊脂平板上的菌落特征按產(chǎn)品說明書進(jìn)行判定。5.3 初步生化試驗(yàn)在C T - S MA C和大腸埃希氏菌O 1 5 7顯色瓊脂平板上分別挑取5個(gè)1 0個(gè)可疑菌落, 分別接種T S I瓊脂, 同時(shí)接種MUG - L S T肉湯, 并用大腸埃希氏菌株(AT C C 2 5 9 2 2或等效標(biāo)準(zhǔn)菌株) 做陽性對(duì)照和大腸埃希氏菌O 1 5 7:H 7(N C T C 1 2 9 0 0或等效標(biāo)準(zhǔn)菌株) 做陰性對(duì)照, 于3 6 1 培養(yǎng)1 8h2 4h。 必要時(shí)進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)和革蘭氏染色。在T S I瓊脂中, 典型菌株為斜面與底層均呈黃色, 產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣, 不產(chǎn)生硫化氫(H2S) 。置MUG - L S T肉湯管于長(zhǎng)波紫外燈下觀察,MUG陽性的大腸埃希氏菌株應(yīng)有熒光產(chǎn)生,MUG陰性的應(yīng)無熒光產(chǎn)生, 大腸埃希氏菌O 1 5 7:H 7/NM為MUG試驗(yàn)陰性, 無熒光。挑取可疑菌落, 在營養(yǎng)瓊脂平板上分純, 于3 61培養(yǎng)1 8h2 4h, 并進(jìn)行下列鑒定。5.4 鑒定5.4.1 血清學(xué)試驗(yàn)在營養(yǎng)瓊脂平板上挑取分純的菌落, 用O 1 5 7和H 7診斷血清或O 1 5 7乳膠凝集試劑作玻片凝集試驗(yàn)。對(duì)于H 7因子血清不凝集者, 應(yīng)穿刺接種半固體瓊脂, 檢查動(dòng)力, 經(jīng)連續(xù)傳代3次, 動(dòng)力試驗(yàn)均陰性, 確定為無動(dòng)力株。如使用不同公司生產(chǎn)的診斷血清或乳膠凝集試劑, 應(yīng)按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。5.4.2 生化試驗(yàn)5.4.2.1 自營養(yǎng)瓊脂平板上挑取菌落, 進(jìn)行生化試驗(yàn)。大腸埃希氏菌O 1 5 7:H 7/NM生化反應(yīng)特征見表1。表1 大腸埃希氏菌O 1 5 7:H 7/NM生化反應(yīng)特征生化試驗(yàn)特征反應(yīng)三糖鐵瓊脂底層及斜面呈黃色,H2S陰性山梨醇陰性或遲緩發(fā)酵靛基質(zhì)陽性甲基紅-伏普試驗(yàn)(MR - V P)MR陽性,V P陰性氧化酶陰性西蒙氏檸檬酸鹽陰性賴氨酸脫羧酶陽性( 紫色)鳥氨酸脫羧酶陽性( 紫色)纖維二糖發(fā)酵陰性棉子糖發(fā)酵陽性MUG試驗(yàn)陰性( 無熒光)動(dòng)力試驗(yàn)有動(dòng)力或無動(dòng)力G B4 7 8 9.3 62 0 1 64 5.4.2.2 如選擇生化鑒定試劑盒或微生物鑒定系統(tǒng), 應(yīng)從營養(yǎng)瓊脂平板上挑取菌落, 用稀釋液制備成濁度適當(dāng)?shù)木鷳乙? 使用生化鑒定試劑盒或微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。5.4.3 毒力基因測(cè)定( 可選項(xiàng)目)樣品中檢出大腸埃希氏菌O 1 5 7:H 7或O 1 5 7:NM時(shí), 如需要進(jìn)一步檢測(cè)V e r o細(xì)胞毒素基因的存在, 可通過接種V e r o細(xì)胞或H e L a細(xì)胞, 觀察細(xì)胞病變進(jìn)行判定; 也可使用基因探針檢測(cè)或聚合酶鏈反應(yīng)(P C R) 方法進(jìn)行志賀毒素基因(s t x1、s t x2) 、e a e、h l y等基因的檢測(cè)。如使用試劑盒檢測(cè)上述基因, 應(yīng)按照產(chǎn)品的說明書進(jìn)行。6 結(jié)果報(bào)告綜合生化和血清學(xué)試驗(yàn)結(jié)果, 報(bào)告2 5g( 或2 5m L) 樣品中檢出或未檢出大腸埃希氏菌O 1 5 7:H 7或大腸埃希氏菌O 1 5 7:NM。第二法 免疫磁珠捕獲法7 檢驗(yàn)程序大腸埃希氏菌O 1 5 7:H 7/NM免疫磁珠捕獲法檢驗(yàn)程序見圖2。圖2 大腸埃希氏菌O 1 5 7:H 7/NM免疫磁珠捕獲法檢驗(yàn)程序G B4 7 8 9.3 62 0 1 65 8 操作步驟8.1 增菌同5.1。8.2 免疫磁珠捕獲與分離8.2.1 應(yīng)按照生產(chǎn)商提供的使用說明進(jìn)行免疫磁珠捕獲與分離。當(dāng)生產(chǎn)商的使用說明與下面的描述可能有偏差時(shí), 按生產(chǎn)商提供的使用說明進(jìn)行。8.2.2 將微量離心管按樣品和質(zhì)控菌株進(jìn)行編號(hào), 每個(gè)樣品使用1只微量離心管, 然后插入到磁板架上。在漩渦混合器上輕輕振蕩E.c o l iO 1 5 7免疫磁珠混懸液后, 用開蓋器打開每個(gè)微量離心管的蓋子,每管加入2 0LE.c o l iO 1 5 7免疫磁珠懸液。8.2.3 取m E C+n肉湯增菌培養(yǎng)物1m L, 加入到微量離心管中, 蓋上蓋子, 然后輕微振蕩1 0s。每個(gè)樣品更換1只加樣吸頭, 質(zhì)控菌株必須與樣品分開進(jìn)行, 避免交叉污染。8.2.4 結(jié)合: 在1 83 0環(huán)境中, 將上述微量離心管連同磁板架放在樣品混合器上轉(zhuǎn)動(dòng)或用手輕微轉(zhuǎn)動(dòng)1 0m i n, 使E.c o l iO 1 5 7與免疫磁珠充分接觸。8.2.5 捕獲: 將磁板插入到磁板架中濃縮磁珠。在3m i n內(nèi)不斷地傾斜磁板架, 確保懸液中與蓋子上的免疫磁珠全部被收集起來。此時(shí), 在微量離心管壁中間明顯可見圓形或橢圓形棕色聚集物。8.2.6 吸取上清液: 取1支無菌加長(zhǎng)吸管, 從免疫磁珠聚集物對(duì)側(cè)深入液面, 輕輕吸走上清液。當(dāng)吸到液面通過免疫磁珠聚集物時(shí), 應(yīng)放慢速度, 以確保免疫磁珠不被吸走。如吸取的上清液內(nèi)含有磁珠, 則應(yīng)將其放回到微量離心管中, 并重復(fù)8.2.5步驟。每個(gè)樣品換用1支無菌加長(zhǎng)吸管。免疫磁珠的滑落: 某些樣品特別是那些富含脂肪的樣品, 其磁珠聚集物易于滑落到管底。在吸取上清液時(shí), 很難做到不丟失磁珠, 在這種情況下, 可保留5 0L1 0 0L上清液于微量離心管中。如果在后續(xù)的洗滌過程中也這樣做的話, 脂肪的影響將減小, 也可達(dá)到充分捕獲的目的。8.2.7 洗滌: 從磁板架上移走磁板, 在每個(gè)微量離心管中加入1m LP B S - T w e e n 2 0洗液, 放在樣品混合器上轉(zhuǎn)動(dòng)或用手輕微轉(zhuǎn)動(dòng)3m i n, 洗滌免疫磁珠混合物。重復(fù)上述步驟8.2.58.2.7。8.2.8 重復(fù)上述步驟8.2.58.2.6。8.2.9 免疫磁珠懸浮: 移走磁板, 將免疫磁珠重新懸浮在1 0 0LP B S - T w e e n 2 0洗液中。8.2.1 0 涂布平板: 將免疫磁珠混勻, 各取5 0L免疫磁珠懸液分別轉(zhuǎn)移至C T - S MA C平板和大腸埃希氏菌O 1 5 7顯色瓊脂平板一側(cè), 然后用無菌涂布棒將免疫磁珠涂布平板的一半, 再用接種環(huán)劃線接種平板的另一半。待瓊脂表面水分完全吸收后, 翻轉(zhuǎn)平板, 于3 61培養(yǎng)1 8h2 4h。注:若C T - S MA C平板和大腸埃希氏菌O 1 5 7顯色瓊脂平板表面水分過多時(shí),應(yīng)在3 6 1 下干燥1 0m i n2 0m i n, 涂布時(shí)避免將免疫磁珠涂布到平板的邊緣。8.3 菌落識(shí)別大腸埃希氏菌O 1 5 7:H 7/NM在C T - S MA C平板和大腸埃希氏菌O 1 5 7顯色瓊脂平板上的菌落特征同5.2。8.4 初步生化試驗(yàn)同5.3。8.5 鑒定同5.4。G B4 7 8 9.3 62 0 1 66 9 結(jié)果報(bào)告同第6章。G B4 7 8 9.3 62 0 1 67 附 錄 A培養(yǎng)基和試劑A.1 改良E C肉湯(m E C+n)A.1.1 成分胰蛋白胨2 0.0g3號(hào)膽鹽1.1 2g乳糖5.0gK2H P O47 H2O4.0gKH2P O41.5gN a C l5.0g新生霉素鈉鹽溶液(2 0m g/m L)1.0m L蒸餾水10 0 0m LA.1.2 制法除新生霉素外, 所有成分溶解在水中, 加熱煮沸, 在2 02 5下校正p H至6.90.1, 分裝。于1 2 1高壓滅菌1 5m i n, 備用。制備濃度為2 0m g/m L的新生霉素儲(chǔ)備溶液, 過濾法除菌。待培養(yǎng)基溫度冷至5 0以下時(shí), 按10 0 0m L培養(yǎng)基內(nèi)加1m L新生霉素儲(chǔ)備液, 使最終濃度為2 0m g/L。A.2 改良山梨醇麥康凱(C T - S MA C) 瓊脂A.2.1 山梨醇麥康凱(S MA C) 瓊脂A.2.1.1 成分蛋白胨2 0.0g山梨醇1 0.0g3號(hào)膽鹽1.5g氯化鈉5.0g中性紅0.0 3g結(jié)晶紫0.0 0 1g瓊脂1 5.0g蒸餾水10 0 0m LA.2.1.2 制法除瓊脂、 結(jié)晶紫和中性紅外, 所有成分溶解在蒸餾水中, 加熱煮沸, 在2 0 2 5 下校正p H至7.20.2, 加入瓊脂、 結(jié)晶紫和中性紅, 煮沸溶解, 分裝。于1 2 1高壓滅菌1 5m i n。A.2.2 亞碲酸鉀溶液A.2.2.1 成分亞碲酸鉀0.5gG B4 7 8 9.3 62 0 1 68 蒸餾水2 0 0m LA.2.2.2 制法將亞碲酸鉀溶于水, 過濾法除菌。A.2.3 頭孢克肟(C e f i x i m e) 溶液A.2.3.1 成分頭孢克肟1.0m g9 5%乙醇2 0 0m LA.2.3.2 制法將頭孢克肟溶解于9 5%乙醇中, 靜置1h待其充分溶解后過濾除菌。分裝試管, 儲(chǔ)存于-2 0, 有效期1年。解凍后的頭孢克肟溶液不應(yīng)再凍存, 且在28下有效期1 4d。A.2.4 C T - S MA C制法取10 0 0m L滅菌融化并冷卻至4 61的山梨醇麥康凱(S MA C) 瓊脂, 加入1m L亞碲酸鉀溶液和1 0m L頭孢克肟溶液, 使亞碲酸鉀濃度達(dá)到2.5m g/L, 頭孢克肟濃度達(dá)到0.0 5m g/L, 混勻后傾注平板。A.3 三糖鐵瓊脂(T S I)A.3.1 成分蛋白胨2 0.0g牛肉浸膏5.0g乳糖1 0.0g蔗糖1 0.0g葡萄糖1.0g硫酸亞鐵銨 (NH4)2F e(S O4)26 H2O0.2g氯化鈉5.0g硫代硫酸鈉0.2g酚紅0.0 2 5g或5.0g/L溶液5.0m L瓊脂1 2.0g蒸餾水10 0 0m LA.3.2 制法除酚紅和瓊脂外, 將其他成分加于4 0 0m L蒸餾水中, 煮沸溶解, 在2 02 5下校正p H至7.40.2。另將瓊脂加于6 0 0m L蒸餾水中, 煮沸溶解。將上述兩溶液混合均勻后, 加入5%酚紅水溶液5m L, 混勻, 分裝小號(hào)試管, 每管約2m L4m L。于1 2 1 C1 0m i n或1 1 5 C1 5m i n, 制成高層斜面。冷卻后呈桔紅色。如不立即使用, 在28條件下可儲(chǔ)存一個(gè)月。G B4 7 8 9.3 62 0 1 69 A.4 營養(yǎng)瓊脂A.4.1 成分蛋白胨1 0.0g牛肉膏3.0g氯化鈉5.0g瓊脂1 5.0g蒸餾水10 0 0m LA.4.2 制法將各成分溶解于蒸餾水中, 加熱煮沸至完全溶解, 校正p H至7.40.2, 分裝。于1 2 1 高壓滅菌1 5m i n。A.5 半固體瓊脂A.5.1 成分蛋白胨1.0g牛肉膏0.3g氯化鈉0.5g瓊脂0.3g 0.4g蒸餾水1 0 0m LA.5.2 制法將各成分溶解于蒸餾水中, 加熱煮沸至完全溶解, 校正p H至7.40.2, 分裝小試管, 于1 2 1高壓滅菌1 5m i n。直立凝固備用。A.6 月桂基硫酸鹽蛋白胨肉湯- MU G(L S T - MU G)A.6.1 成分胰蛋白胨2 0.0g氯化鈉5.0g乳糖5.0g磷酸氫二鉀 (K2H P O4)2.7 5g磷酸二氫鉀(KH2P O4)2.7 5g十二烷基硫酸鈉0.1g4 -甲基傘形酮- D -葡萄糖醛酸苷(MUG)0.1g蒸餾水10 0 0m LA.6.2 制法將各成分溶解于蒸餾水中, 加熱煮沸至完全溶解, 于2 02 5下校正p H至6.80.2, 分裝到帶有倒管的試管中, 每管1 0m L, 于1 2 1高壓滅菌1 5m i n。G B4 7 8 9.3 62 0 1 61 0 A.7 氧化酶試劑A.7.1 成分N,N -二甲基對(duì)苯二胺鹽酸鹽或N,N,N ,N -四甲基對(duì)苯二胺鹽酸鹽1.0g蒸餾水1 0 0m LA.7.2 制法少量新鮮配制, 于冰箱內(nèi)避光保存, 在7d內(nèi)使用。A.7.3 試驗(yàn)方法用無菌棉拭子取單個(gè)菌落, 滴加氧化酶試劑,1 0s內(nèi)呈現(xiàn)粉紅或紫紅色, 即