雙縮脲法測(cè)定血清蛋白質(zhì)含量—比色技術(shù).ppt

生物化學(xué)實(shí)驗(yàn) CQMU,雙縮脲法測(cè)定血清蛋白質(zhì)含量,張瑩 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室,蛋白質(zhì)的定量分析是生物化學(xué)和其他生命學(xué)科最常涉及的分析內(nèi)容，是臨床上診斷疾病及檢查康復(fù)情況的重要指標(biāo)，也是許多生物制品，藥物、食品質(zhì)量檢測(cè)的重要指標(biāo)。在生化實(shí)驗(yàn)中，對(duì)樣品中的蛋白質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確可靠的定量分析，則是經(jīng)常進(jìn)行的一項(xiàng)非常重要的工作。,目前測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法有很多種，下面列出根據(jù)蛋白質(zhì)不同性質(zhì)建立的一些蛋白質(zhì)測(cè)定方法： 物理性質(zhì)：紫外分光光度法。 化學(xué)性質(zhì)：凱氏定氮法、雙縮脲法、Lowry法 染色性質(zhì)：考馬斯亮藍(lán)染色法、銀染法。 其他性質(zhì)：熒光法。,掌握雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)的原理 掌握分光光度計(jì)的使用 掌握標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 學(xué)習(xí)分光光度法測(cè)定的原理和方法,實(shí)驗(yàn)?zāi)康?實(shí)驗(yàn)原理,雙縮脲反應(yīng)（Biuret reaction）,兩分子尿素加熱脫氨縮合成的雙縮脲（H2N-OC-NH-CO-NH2），因分子內(nèi)含有兩個(gè)鄰接的酰胺鍵，在堿性溶液中可與Cu2+發(fā)生雙縮脲反應(yīng)，生成紫紅色絡(luò)合物。,雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)的原理,蛋白質(zhì)分子含有大量彼此相連的肽鍵（-CO-NH-），同樣可以與堿性銅溶液中的Cu2+發(fā)生雙縮脲反應(yīng)而生成紫紅色的Cu2+-蛋白質(zhì)絡(luò)合物。在一定范圍內(nèi)紫紅色顏色的深淺與蛋白質(zhì)含量成正比，因此可以用分光光度法測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)的含量。,方法學(xué)評(píng)價(jià),操作簡(jiǎn)便、迅速、受蛋白質(zhì)性質(zhì)的影響較小； 靈敏度較差，需要樣本含蛋白質(zhì)120 mg水平才能檢測(cè)到； 且特異性不高，除含-CONH-的化合物有此反應(yīng)外，凡是含-CONH2、-CH2NH2 、 -CS-NH2等基團(tuán)的化合物也有此反應(yīng)。,分光光度法的基本原理,分光光度法是利用物質(zhì)具有對(duì)光的選擇性吸收特征而建立起來的一種定量、定性分析方法。 當(dāng)一束單色光通過均勻的溶液時(shí)，入射光強(qiáng)度為Io，透射光強(qiáng)度為It。,透光率（Transmittance）T：透射光的強(qiáng)度It與入射光強(qiáng)度I0之比。,透光率愈大，溶液對(duì)光的吸收愈少；透光率愈小，溶液對(duì)光的吸收愈多。,吸光度（Absorbance）A:透光率的負(fù)對(duì)數(shù)。,A愈大，溶液對(duì)光的吸收愈多。,Lambert-Beer定律吸收光譜法基本定律,描述物質(zhì)對(duì)單色光吸收強(qiáng)弱與厚度和待測(cè)物濃度的關(guān)系。 含義：一束單色光通過溶液時(shí)，光能被吸收的程度與溶液的濃度和液層厚度成正比。,AKCL,A為溶液對(duì)光的吸光度，反映了物質(zhì)對(duì)光的吸收程度； K為吸光系數(shù)，是物質(zhì)在單位濃度和單位厚度的條件下對(duì)入射光的吸光度。 C為溶液濃度； L為溶液厚度； 實(shí)驗(yàn)中溶液厚度不變，則AKC,分光光度法的基本應(yīng)用,利用吸收光譜對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性分析 利用吸收光譜對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定量分析,原理：根據(jù)物質(zhì)對(duì)于入射光的特征吸收，可應(yīng)用于物質(zhì)溶液的定性檢測(cè) 常用方法： 比較吸收光譜曲線：在相同的條件下，吸收光譜曲線不同，表明物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)不同。 比較最大吸收波長(zhǎng)：不同物質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)不同；化學(xué)結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)最大吸收波長(zhǎng)相同，吸收系數(shù)不同。 比較吸光度的比值：多用于檢測(cè)物質(zhì)的純度（DNA A260/A280=1.8 純度鑒定),利用吸收光譜對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性分析,原理： Lambert-Beer定律 常用方法： 標(biāo)準(zhǔn)曲線法 配制一系列已知不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用選定的顯色劑顯色。選用合適波長(zhǎng)的入射光。測(cè)定時(shí)先以空白溶液調(diào)節(jié)透光率100%，然后分別測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)系列的吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)作圖得到一條通過原點(diǎn)的直線，叫做標(biāo)準(zhǔn)曲線（或稱A-C曲線）。,利用吸收光譜對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定量分析,標(biāo)準(zhǔn)曲線,標(biāo)準(zhǔn)曲線與樣品的測(cè)定條件必須一致。,常用方法： 標(biāo)準(zhǔn)曲線法 標(biāo)準(zhǔn)管法： 對(duì)個(gè)別樣品進(jìn)行測(cè)定，且A-C曲線線性良好直接比較測(cè)定結(jié)果。 A標(biāo) =K標(biāo)c標(biāo)b標(biāo) A測(cè) =K測(cè) c測(cè) b測(cè) c測(cè) =A測(cè) /A標(biāo) c標(biāo),分光光度計(jì)的使用,分光光度計(jì)設(shè)計(jì)的原理,分光光度計(jì)操作,打開電源開關(guān)，使儀器預(yù)熱20分鐘 用“波長(zhǎng)設(shè)置”按鈕將波長(zhǎng)設(shè)置在您將要使用的分析波長(zhǎng)位置上 打開樣品室蓋，按“0%T”鍵調(diào)透射比零 蓋好樣品室蓋，按“100%T”調(diào)100%透射比 按“方式鍵”（MODE）將測(cè)試方式設(shè)置為吸光度方式(A) 將參比溶液和被測(cè)溶液分別倒入比色皿中 打開樣品室蓋，將盛有溶液的比色皿分別插入比色皿槽中，蓋上樣品室蓋 將參比溶液推入或拉入光路中，按“100%T”調(diào)零A 將被測(cè)溶液拉入光路中，此時(shí)，顯示器上所顯示是被測(cè)樣品的吸光度參數(shù) 實(shí)驗(yàn)完成后，關(guān)閉電源，洗凈比色皿，并蓋好蓋布。,實(shí)驗(yàn)步驟,取試管7支，按下表操作并記錄：,混勻各管，室溫放置30分鐘。以空白管調(diào)零，在波長(zhǎng)540 nm比色，讀取各管光吸收值，并記錄。,在座標(biāo)紙上以各管蛋白質(zhì)含量為橫座標(biāo)，兩管平均光吸收值為縱座標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 以測(cè)定管的光吸收值在標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出該待測(cè)血清樣本的蛋白質(zhì)含量。 計(jì)算待測(cè)血清樣本中蛋白質(zhì)的濃度（g/L）。,注意事項(xiàng),本實(shí)驗(yàn)是定量實(shí)驗(yàn)，要求所有玻璃儀器必須潔凈、干燥，蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液和血清取量必須準(zhǔn)確。 雙縮脲試劑應(yīng)該在最后同時(shí)加入各個(gè)試管，以保證各管反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行。 各管加好樣后必須充分混勻。顯色反應(yīng)需要2030 min才能完成，顯色后放置4小時(shí)光吸收值穩(wěn)定。 注意