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地貧篩查中的血紅蛋白電泳 操作技術 解放軍第三0三醫(yī)院血液實驗室 王榮新,血紅蛋白的組成,血紅蛋白由血紅素與珠蛋白組成 血紅素：鐵原子與原卟啉復合物。 珠蛋白：包括、和 珠蛋白6種。 血紅蛋是由兩種不同的鰲合了血紅素的 珠蛋白肽鏈所形成的四聚體結構，在人體的 不同發(fā)育時期，其主要的血紅蛋白（Hb）組 成不同。,人體發(fā)育過程中H的組成,Hb的種類,A.正常的Hb分三類 a.HbA(22) b.HbF(22) c.HA2(22) B.異常Hb有兩類 a.快速異常Hb:穩(wěn)定Hb b.慢速異常Hb:不穩(wěn)定Hb,基層常用的電泳分析方法,醋酸纖維膜電泳 瓊脂凝膠電泳,醋酸纖維膜電泳主要過程瓊脂凝膠電泳 RBC洗滌 制備溶血 點樣 電泳 染色與脫色 掃描法 比色法:分區(qū)剪下色帶，洗脫 分區(qū)切割色帶,融化瓊脂，干燥,透明比色,血紅蛋白電泳設備,醋酸纖維膜電泳,HbA2的常用測定方法,原理:根據(jù)不同Hb自帶電荷的不同、分子量大小的不 同、結構和等電點的不同,在一定pH值的緩沖液中朝 特定方向泳動，在一定的電壓下經(jīng)一定時間，可分 離出各自的區(qū)帶。 主要類別: 醋酸纖維素膜電泳法 瓊脂凝膠電泳法 HbA2含量測定: 洗脫法 掃描法,血紅蛋白A2測定,不連續(xù)電泳將HbA2分離后，分別剪 出膜條中的HbA和HbA2區(qū)帶，分別放入試 管中，HbA加蒸餾水20ml， HbA2加4ml ，浸泡30分鐘，不定時搖動，使Hb完全 冼脫下來后混勻，用721分光光度計以波 長413nm蒸餾水校正零點，讀取光密度OD 值并計算出結果。,抗堿血紅蛋白(HbF)測定,設備：721分光光度計，刻度吸管，秒表，玻璃漏斗 ，濾紙。 試劑：1/12mol/LKOH或NaOH溶液，酸性半飽和硫酸 銨溶液。 方法：取兩支試管，測定管加入溶血液0.1ml，對照 管加入0.02ml，于測定管中加入KOH1.6ml，搖勻， 1分鐘時立即加入酸性半飽和硫酸銨溶液3.4ml，倒 轉6次，放10分鐘，濾取溶液檢測，用波長 540nm 蒸餾水校正零點，分別讀取測定管和對照管光密度 OD值，計算出結果。,HbCS的區(qū)帶多在HbA2位置的前 后，含量低，2左右，很不穩(wěn)定， 有時還可分開成三或四小區(qū)帶，用聯(lián)苯胺染色可確定。HbE為慢速異常區(qū)帶，其位置相當于HbA2。HbH和HbBarts為快速異常區(qū)帶。,全自動Hb電泳儀,目前國內使用的主要有 美國的Helena電泳儀、掃描儀和分析系統(tǒng)。 法國的Sebia電泳儀、掃描儀和分析系統(tǒng)。 國產(chǎn)的金桑特電泳儀、掃描儀和分析系統(tǒng)。 1.通過掃描定量給出HbA、 HbA2和HbF值。 2.異常區(qū)帶通過查表確定。,HbE區(qū)帶的鑒別,A.聯(lián)苯胺染色,鑒定是否為Hb B.區(qū)帶位于HbA2 區(qū)帶位置上,在陰性(-)泳動速度最慢的一種異常Hb,難與A2區(qū)分開 C.HbA2定量在10%以上,應考慮為HbE D.HbE純合子只有HbF和HbE,HbE高達95%以上,HbH區(qū)帶的鑒定,A.聯(lián)苯胺染色,確定是否為Hb B.在陽極(+)泳動速度最大的Hb區(qū)帶 C.HbH包含體陽性(+) D.pH6.5緩沖液(酸性)唯一向陽性(+)移動的Hb區(qū)帶 E.HbMCVMCH F.HbBarts 區(qū)帶在HbH區(qū)帶后,泳動速度比HbH稍慢 些,有Barts 區(qū)帶,一般都有H區(qū)帶,H含量高達30% 多,但不會超出40%,低少到1%左右。,HbA2 在血紅蛋白病中的意義,HbA2組成: 2 2 HbA2參考值:1.2%-3.5% HbA2含量的改變: HbA2水平升高,是地 貧基因攜帶者的特征性標志, 故HbA2定 量的準確與否,對于臨床一線地貧基因 攜帶者的篩查至關重要。,血紅蛋白（Hb）病,1.血紅蛋白?。夯蛲蛔儗е潞铣傻闹榈鞍?肽鏈結構異常（如：鐮狀細胞血紅蛋白病 /HbS） 2.地中海貧血：基因突變導致一種或多種珠 蛋白肽鏈合成減少或缺如（/地貧） 3.獲得性血紅蛋白?。航佑|或誤服化學藥物,Hb病為世界上發(fā)病率最高危害最大的單基因遺 傳病，被WHO列為嚴重危害人類健康六大疾病之一。 全球約有4.83%的人口攜帶Hb病基因,每年各類 重型地貧(包括地貧復合異常Hb病類型)患兒的出生 率不低于2.4。據(jù)此推算,全球每年至少約35萬Hb 病患兒出生; 至今為止，全球在分子水平上已鑒定出近1000 種不同的珠蛋白突變基因，其中包括700多種異常Hb 變異體和200余種地貧基因以及70多種地貧突變 ,其中中國人群中異常Hb、地貧基因和地貧突變 各占70多種、34種和11種。,臨床常見的異常血紅蛋白,以速度快慢排序 1.血紅蛋白E/A2 2.血紅蛋白D/S 3.血紅蛋白G 4.血紅蛋白K 5.血紅蛋白J 6.血紅蛋白H,Hb電泳操作中的經(jīng)驗與教訓,1.RBC洗滌：離心的速度和時間要夠，生理鹽水與血 比例要5：1，血漿與冼滌生理鹽水要盡量吸干凈。 2.制備溶血：加入的溜水、溶血劑與紅細胞體積要 符合要求。離心的速度和時間要夠。 3.點樣:血紅蛋白液適量，不能太寬。 4.電泳:醋纖膜浸泡時間要夠長，平衡時間要夠。 5.染色與脫色:時間要夠。,1.正常新生兒 9.輕型地中海貧血 2.胎兒水腫綜合征 10.異常HbD雜合子 3.地中海貧血1(臍血) 11.異常HbG雜合子 4.HbCS-HbH病型 12.輕型地中海貧血復合HbE 5.重型地中海貧血復合HbE 13.正常成人 6.輕型地中海貧血 14.正常成人