生物分離工程細胞分離與胞內產(chǎn)物的溶解.ppt

1,細 胞 破 碎,2,生物分離過程的一般流程,本章內容,3,常見的細胞壁結構,細胞破碎技術,包涵體的純化方法,本章的主要內容,4,概述,不同類型的細胞分泌目標產(chǎn)物的類型： 動物細胞多分泌到細胞外培養(yǎng)液 植物細胞多為胞內產(chǎn)物 微生物（細菌/酵母/真菌）胞內、胞外 對于胞內產(chǎn)物需要收集菌體或細胞進行破碎。,5,概述,大多數(shù)情況下，抗生素，胞外酶，一些多糖，及氨基酸等目標產(chǎn)物存在于發(fā)酵液中。 有些目標產(chǎn)物存在于生物體中。 尤其是由基因工程菌產(chǎn)生的大多數(shù)蛋白質是在細胞內沉積。 脂類物質和一些抗生素包含在生物體中。,6,概 述,細胞破碎（cell rupture）技術是指利用外力破壞細胞膜和細胞壁，使細胞內物質包括目的產(chǎn)物成分釋放出來的技術。 細胞破碎技術是分離純化細胞內合成的非分泌型生化物質（產(chǎn)品）的基礎。 為了研究細胞破碎，提高其破碎率，有必要了解各種微生物細胞壁的組成和結構。,7,15.1 細胞壁結構對破碎的影響,微生物細胞和植物細胞外層均為細胞壁，細胞壁里面是細胞膜，動物細胞沒有細胞壁，僅有細胞膜。 通常細胞壁較堅韌，細胞膜脆弱，易受滲透壓沖擊而破碎，因此細胞破碎的阻力主要來自于細胞壁。 不同細胞壁的結構和組成不完全相同，故細胞壁的機械強度不同，細胞破碎的難易程度也就不同。,8,細菌細胞壁結構,幾乎所有細菌的細胞壁都是由肽聚糖組成，它是難溶性的聚糖鏈； 相鄰聚糖鏈上的短肽又交叉相聯(lián)，構成了細胞壁的三維網(wǎng)狀結構，包圍在細胞周圍； 使細胞具有一定的形狀和強度。,9,細菌細胞壁結構,破碎細菌的主要阻力是來自于肽聚糖的網(wǎng)狀結構，其網(wǎng)結構的致密程度和強度取決于聚糖鏈上所存在的肽鍵的數(shù)量和其交聯(lián)的程度。 革蘭氏陰性菌的細胞壁結構與革蘭氏陽性菌有很大不同。 革蘭氏陰性菌典型的生物是大腸桿菌，通過這種細胞生產(chǎn)了很多細胞重組的產(chǎn)物。,10,酵母細胞壁的結構示意圖,最里層是由葡聚糖的細纖維組成，它構成了細胞壁的剛性骨架，使細胞具有一定的形狀， 上面的是一層糖蛋白， 最外層是甘露聚糖，由1,6-磷酸二酯鍵連接成網(wǎng)狀。在該層的內部，有甘露聚糖-酶的復合物。 破碎酵母細胞壁的阻力主要決定于壁結構交聯(lián)的緊密程度和它的厚度。,11,真菌的細胞壁,真菌的細胞壁較厚，主要由多糖組成，其次還含有較少量的蛋白質和脂類。 不同的真菌，細胞壁的組成有很大的不同，其中大多數(shù)真菌的多糖壁是由幾丁質和葡聚糖構成，少數(shù)含纖維素。 與酵母和細菌的細胞壁一樣，真菌細胞壁的強度和聚合物的網(wǎng)狀結構有關，不僅如此，它還含有幾丁質或纖維素的纖維狀結構，所以強度有所提高。,12,紅面包霉菌細胞壁具有同心圓層狀結構主要存在三種聚合物 最外層(a)是-和-葡聚糖的混合物， 第2層(b)是糖蛋白的網(wǎng)狀結構 第3層(c)主要是蛋白質， 最內層(d)主要是幾丁質。,紅面包霉菌細胞壁的結構示意圖,13,細胞壁的組成和結構,細胞壁的組成和結構,14,植物細胞壁的結構,對于已生長結束的植物細胞壁可分為初生壁和次生壁兩部分。 初生壁是細胞生長期形成的。初生壁一般較?。?3m），富有彈性。 由多糖和蛋白質構成，多糖主要成分為纖維素、半纖維素和果膠類物質。纖維素是長鏈D-葡聚糖，許多這樣的長鏈形成微纖絲。 它是構成細胞壁的骨架，細胞壁的機械強度主要來自于微纖絲。,15,植物次生細胞壁,某些植物細胞，當生長停止后，在細胞質和初生細胞壁之間形成了次生細胞壁。次生壁一般較厚(4m以上)，常有三層組成。 在次生壁中，纖維素和半纖維素含量比初生壁增加很多，纖維素的微纖絲排列得更緊密和有規(guī)則，而且存在木質素的沉積。 因此次生壁的形成提高了細胞壁的堅硬性，使植物細胞具有很高的機械強度。,16,研 磨,15.2 細胞破碎技術,17,機械破碎,搗碎法 研磨法 勻漿法 超聲法,物理破碎,溫度差破碎法 壓力差破碎法,化學破碎,有機溶劑： 表面活性劑： 酸堿,酶促破碎,自溶法 外加酶制劑法,通過機械運動產(chǎn)生的剪切力，使組織、細胞破碎。,通過各種物理因素的作用，使組織、細胞的外層結構破壞，而使細胞破碎。,通過各種化學試劑對細胞膜的作用，而使細胞破碎,通過細胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細胞外層結構受到破壞，而達到細胞破碎,細胞破碎方法及其原理,18,一 機械法,機械破碎法又可分為 高壓勻漿破碎法（homogenization） 高速珠研磨破碎法（bead grinding） 超聲波破碎法（ultrasonication）,19,采用高壓勻漿器（由高壓泵和勻漿閥組成）。,1.高壓勻漿法 （High-pressure homogenization）,細胞懸浮液自高壓室針形閥噴出時，每秒速度高達幾百米，高速噴出的漿液又射到靜止的撞擊環(huán)上，被迫改變方向從出口管流出。細胞在這一系列高速運動過程中經(jīng)歷了高速剪切、碰撞及壓力驟降，造成細胞破碎。,20,21,高壓勻漿器的種類,高壓勻漿器的種類較多： WAB公司的AVP Gaulin 31MR型 Bran and luebbe 公司SHL40型 意大利Niro Soavi,高壓勻漿機,22,高壓勻漿法使用時注意事項,高壓勻漿器的操作溫度上升約-/10MPa為了控制溫度的升高，可在進口處用干冰調節(jié)溫度，使出口溫度調節(jié)在20左右。 可以采用單次通過勻漿器或多次循環(huán)通過等方式。 在工業(yè)規(guī)模的細胞破碎中，對于酵母等難破碎的及濃度高或處于生長靜止期的細胞，常采用多次循環(huán)的操作方法。,23,高壓勻漿法適用的范圍,大規(guī)模細胞破碎的常用方法 高壓勻漿法適用的范圍： 酵母和大多數(shù)細菌細胞的破碎； 料液細胞濃度可以很高，20%左右。 不宜使用高壓勻漿法。 易造成堵塞的團狀或絲狀真菌， 較小的革蘭氏陽性菌， 含有包含體的基因工程菌（因包含體堅硬，易損傷勻漿閥）,24,影響高壓勻漿器細胞破碎因素,被破碎的細胞分率符合如下公式： ln1/(1-R)=KNP (15-1) 式中 R 破碎率，為N次循環(huán)后，蛋白質的釋放量Rn與最大釋放量Rm之比； K 與溫度有關的速度常數(shù)； P 操作壓力，MPa； 與微生物種類有關的常數(shù)。,25,升高壓力有利于破碎， 減少細胞的循環(huán)次數(shù)，甚至一次通過勻漿閥就可達到幾乎完全的破碎，這樣就可避免細胞碎片不至過小。 但p大到一定值時對勻漿器的磨損增加，也有實驗表明p超生一定值時，R增加但很慢。 在工業(yè)生產(chǎn)中，通常采用的壓力為5570Mpa。 破碎性能還隨菌體種類和生長環(huán)境的不同而不同 大腸桿菌的細胞比酵母細胞容易破碎， 生長在簡單的合成培養(yǎng)基上的大腸桿菌比生長在復雜培養(yǎng)基上容易破碎。,影響高壓勻漿器細胞破碎因素,26,高壓勻漿法-X-擠壓器,改進的高壓方法：將濃縮的菌體懸液冷卻至-25至-30形成冰晶體，利用500MPa以上的高壓沖擊，冷凍細胞從高壓閥小孔中擠出。 細胞破碎是由于冰晶體在受壓時的相變，包埋在冰中的細胞變形所引起的。 主要用于實驗室中。 優(yōu)點是適用的范圍廣，破碎率高，細胞碎片的粉碎程度低以及活性的保留率高 對冷凍一融解敏感的生化物質不適用。,27,2）珠磨法 bead mill,珠磨是常用的方法 細胞懸浮液與極細的玻璃小珠、石英砂、氧化鋁等研磨劑（直徑小于1mm）一起快速攪拌或研磨，研磨劑、珠子與細胞之間的互相剪切、碰撞，使細胞破碎，釋放出內含物。 在工業(yè)規(guī)模的破碎中，常采用高速珠磨機,WSK臥式高效全能珠磨機,28,高速珠磨機工作原理,磨室內放置玻璃小珠，裝在同心軸上的園盤攪拌器高速旋轉，使細胞懸浮液和玻離小珠相互攪動； 細胞破碎是由剪切力層之間的碰撞和磨料滾動引起 在出口處，旋轉園盤和出口平 板之間的狹縫很小，可阻擋玻 離小珠，使不被料液帶出。 由于操作過程中會產(chǎn)生熱量， 故磨室還裝有冷卻夾套，以冷 卻細胞懸浮液和玻離小珠。,29,Netzsch LM-20型珠磨機,A-具有冷卻夾套的圓筒形磨室 B-具有冷卻裝置的攪拌軸和圓盤 C-環(huán)形震動俠縫分離器 D-變速馬達 1和2料液進出口 3和4 攪拌冷卻劑進出口 5和6磨室冷卻劑進出口,園盤以兩種位置交錯地安裝在軸上， 一種處于徑向，一種與軸傾斜， 徑向盤使磨料沿徑向運動，傾斜盤則產(chǎn)生軸向運動。 由于交錯的運動，提高了破碎效率。,30,珠磨機破碎作用方程,破碎作用是相對于時間的一級反應速度過程，符合下列公式： ln1/(1-R)=Kt 15-2 R 破碎率；K一 一級反應速度常數(shù)；t一 時間。 K與攪拌轉速、細胞懸浮液濃度和循環(huán)速度、玻璃小珠裝量和珠體直徑，以及溫度等相關。,珠磨法的破碎率一般控制在80%以下：降低能耗、減少大分子目的產(chǎn)物的失活、減少由于高破碎率產(chǎn)生的細胞小碎片不易分離而給后續(xù)操作帶來的困難。,31,3）超聲波破碎,超聲波破碎法（Ultrasonication)利用超聲波振蕩器發(fā)射的15-25kHz的超聲波探頭處理細胞懸浮液。 超聲波振蕩器以可分為槽式和探頭直接插入介質兩種型式，一般破碎效果后者比前者好。 超聲波的細胞破碎效率與細胞種類、濃度和超聲波的聲頻、聲能有關。,32,超聲波破碎的機理,JY92-II D超聲波 細胞粉碎機,一般認為在超聲波作用下液體發(fā)生空化作用（cavitation), 液體中局部空穴的形成、增大和閉合產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力，引起的粘滯性旋渦在細胞上造成了剪切力，使細胞內液體發(fā)生流動，從而使細胞破碎。 操作過程產(chǎn)生大量的熱，因此操作需在冰水或外部冷卻的容器中進行。,33,超聲波破碎的適用范圍,超聲波破碎是很強烈的破碎方法，適用于多數(shù)微生物的破碎。 一般桿菌比球菌易破碎，G-細菌比G+細菌易破碎，對酵母菌的效果較差。 但超聲波產(chǎn)生的化學自由基團能使某些敏感性活性物質失活。 超聲波破碎的有效能量利用率極低 由于對冷卻的要求相當苛刻，所以不易放大，但在實驗室小規(guī)模細胞破碎中常用。,34,不同機械破碎方法的比較,35,非機械破碎方法,酶溶破碎法（enzyme lysis） 化學破碎法（chemical treatment） 去垢劑破碎法（detergents） 滲透壓沖擊破碎法（osmotic shock） 凍融破碎法（freezing and thawing）,36,二 非機械法,非機械方法很多 1 酶解 2 化學法溶胞 3 物理法 滲透壓沖擊 凍結和融化 干燥法 其中酶法和化學法溶胞應用最廣。,二,37,1 酶解（酶溶法 Enymatic lysis),酶解是利用溶解細胞壁的酶處理菌體細胞，使細胞壁受到破壞后，再利用滲透壓沖擊等方法破壞細胞膜。 1）外加酶法,38,外加酶法,酶解法的特點是專一性強，因此在選擇酶系統(tǒng)時，必須根據(jù)細胞的結構和化學組成來選擇。 溶菌酶（lysozyme)能專一性地分解細胞壁上肽聚糖分子的-1,4糖苷鍵，因此主要用于細菌類細胞壁的裂解。革蘭氏陽性菌懸浮液中加入溶菌酶，很快就產(chǎn)生溶壁現(xiàn)象。但對于革蘭氏陰性菌，單獨采用溶菌酶無效果，必須與螯合劑EDTA一起使用。 放線菌的細胞壁結構類似于革蘭氏陽性菌，以肽聚糖為主要成分，所以也能采用溶菌酶， 酵母和真菌由于細胞壁的組分主要是纖維素、葡聚糖、幾丁質等，常用蝸牛酶、纖維素酶、多糖酶等。 植物細胞壁的主要成分是纖維素，常采用纖維素酶和半纖維素酶裂解。,39,外加酶法,有時采用幾種酶的混合物會產(chǎn)生更好的效果，加入時需確定相應的次序。 對酵母細胞采用酶法破碎時，先加入蛋白酶作用蛋白質-甘露聚糖結構，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖層，最后只剩下原生質體，這時若緩沖液的滲透壓變化，則細胞膜破裂，釋出胞內產(chǎn)物。,40,酶解法的特點,優(yōu)點： 發(fā)生酶解的條件溫和 能選擇性地釋放產(chǎn)物 胞內核酸等泄出量少，細胞外形較完整,缺點： 溶酶價格高， 溶酶法通用性差（不同菌種需選擇不同的酶) 產(chǎn)物抑制的存在。,41,酶解-自溶作用,自溶作用是酶解的另一種方法，利用生物體自身產(chǎn)生的酶來溶胞，而不需外加其他的酶。 在微生物代謝過程中，大多數(shù)都能產(chǎn)生一種能水解細胞壁上聚合物的酶，以便生長過程繼續(xù)下去。 自溶作用：改變其生長環(huán)境（溫度、緩沖液），可以誘發(fā)產(chǎn)生過剩的這種酶或激發(fā)產(chǎn)生其它的自溶酶，以達到自溶目的。 缺點是：易引起所需蛋白質的變性，自溶后細胞懸浮液粘度增大，過濾速度下降。,42,某些化學試劑，如有機溶劑、變性劑、表面活性劑、抗生素、金屬螯合劑等，可以改變細胞壁或膜的通透性（滲透性），從而使胞內物質有選擇地滲透出來。,2 化學滲透法（Chemical permeation）,該法取決于化學試劑的類型以及細胞壁膜的結構與組成。,43,酸處理可以使蛋白質水解成氨基酸，通常采用6mol/L HCl。 堿能溶解細胞壁上脂類物質或使某些組分從細胞內滲漏出來。 成本低，反應激烈，不具選擇性。,（1）酸、堿處理法,44,細胞破碎常用的表面活性劑： 十二烷基硫酸鈉（SDS，陰離子型）；。 非離子型如Triton X-100和吐溫（Tween）等 對疏水性物質具有很強的親和力，能結合并溶解磷脂，破壞內膜的磷脂雙分子層，使某些胞內物質釋放出來。,（2）表面活性劑,無論表面活性劑是陰離子、陽離子還是非離子型，都是兩性的，既能和水作用也能和脂作用， 能與細胞壁上的脂蛋白結合，形成微泡，使膜的通透性增加或溶解,45,能分解細胞壁中的磷脂，使細胞結構破壞，胞內物質被釋放出來。 有機溶劑可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等,（3）有機溶劑,（4）EDTA螯合劑,處理G-細菌，對細胞壁外層有破壞作用。 G-細菌的壁外層結構通?？慷r陽離子Ca2+或Mg2+結合脂多糖和蛋白質來維持，一旦EDTA將Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子將脫落，使細胞壁外層膜出現(xiàn)洞穴。,46,通用性差； 時間長，效率低，一般胞內物質釋放率不超過50%； 有些化學試劑有毒。 化學試劑的加入常會給隨后產(chǎn)物的純化帶來困難， 并影響最終產(chǎn)物純度,化學滲透法特點：,缺點,對產(chǎn)物釋放有一定的選擇性，可使一些較小分子量的溶質如多肽和小分子的酶蛋白透過，而核酸等大分子量的物質仍滯留在胞內； 細胞外形完整，碎片少，漿液粘度低，易于固液分離和進一步提取。,優(yōu)點,47,3 物理法,滲透壓沖擊法 凍結-融化法 干燥法,48,1）滲透壓沖擊法,滲透壓沖擊是較溫和的一種破碎方法， 將細胞放在高滲透壓的溶液中（如一定濃度的甘油或蔗糖溶液），由于滲透壓的作用，細胞內水分便向外滲出，細胞發(fā)生收縮，當達到平衡后，將介質快速稀釋，或將細胞轉入水或緩沖液中，由于滲透壓的突然變化，胞外的水迅速滲入胞內，引起細胞快速膨脹而破裂。 僅適用于細胞壁較脆弱的細胞或細胞壁預先用酶處理或在培養(yǎng)過程中加入某些抑制劑（如抗生素等），使細胞壁有缺陷，強度減弱。,49,2）凍結-融化法,將細胞放在低溫下冷凍（約-15），然后在室溫中融化，反復多次而達到破壁作用。 一方面能使細胞膜的疏水鍵結構破裂，從而增加細胞的親水性能， 另一方面胞內水結晶，形成冰晶粒，引起細胞膨脹而破裂。 適用于細胞壁較脆弱的菌體，破碎率較低，需反復多次，此外，在凍融過程中可能引起某些蛋白質變性。,50,使細胞結合水分喪失，從而改變細胞的滲透性。當采用丙酮、丁醇或緩沖液等對干燥細胞進行處理時，胞內物質就容易被抽提出來。 氣流干燥主要適用于酵母菌，一般在25-30的氣流中吹干； 真空干燥多用于細菌。 冷凍干燥適用于不穩(wěn)定的生化物質,3）干燥法,51,52,選擇破碎方法的依據(jù)：,細胞處理量； 細胞壁強度和結構(高聚物交聯(lián)程度、種類和壁厚度)； 目標產(chǎn)物對破碎條件的敏感性； 破碎程度； 目標產(chǎn)物的選擇性釋放,53,選擇性釋放目標產(chǎn)物的一般原則,僅破壞或破碎存在目標產(chǎn)物的位置周圍 當目標產(chǎn)物存在于細胞膜附近時，可采用較混和的方法，如酶溶法、滲透壓沖擊法和凍結融化法等。當目標產(chǎn)物存在于細胞質內時，則需采用強烈的機械破碎法 當目標產(chǎn)物處于與細胞膜或細胞壁結合的狀態(tài)時，調節(jié)溶液PH值，離子強度或添加與目標產(chǎn)物具有親和性的試劑如：螯合劑、表面活性劑等，使目標產(chǎn)物容易溶解釋放。 (2)機械破碎法和化學法并用可使操作條件更加溫和，在相同的目標產(chǎn)物釋放率條件下，降低細胞的破碎程度。,54,討論題：青霉素?；讣毎扑榈难芯?一. 化學法 20%(W/V)大腸桿菌懸浮液 + B.A 37攪拌 高速離心 測上清液酶活。,1.處理時間 R% 2.5h,2. 丁酯用量 條件：37 ，攪拌3小時 適宜的B.A加量為12% ， 釋放率R=55%,55,二. 化學法凍融法結合 加B.A(12%,37攪拌3h） 菌懸液 凍融(凍結14h 融化) 釋放率70%；比活2.69 u/mg,三. 化學超聲波振蕩法結合 先丁酯處理，再超聲波（90秒），釋放率72% 小型設備，不能工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)。 四. 高壓勻漿法 20%(W/V)菌懸液，P=50MPa，N=3。釋放率R=38.4%， 原因:細胞破碎后,仍有較多酶吸附在細胞碎片上。 五. 高壓勻漿化學法結合 先高壓勻漿，再加10%丁酯，37攪拌3h，高速離心(3萬rpm)，釋放率：R=60% 六. 珠磨 直徑0.4mm玻璃珠。釋放率：R=95%,56,破碎率的測定,細胞破碎后，大量帶電荷的內含物被釋放到水相，使導電率上升。,直接測定法 目的產(chǎn)物測定法 導電率測定法,采用染色法把破碎的細胞與未破碎的細胞區(qū)別開來。 如破碎的革蘭氏陽性菌可染成革蘭氏陰性菌的顏色； 采用革蘭氏染色法染色酵母破碎液，完整的細胞呈紫色，而受損害的細胞呈亮紅色。,將破碎后的細胞懸浮液離心，測定上清液中目的產(chǎn)物含量或活性，并與100%破碎率的標準值比較，計算其破碎率。,57,破碎技術的研究方向,多種破碎方法相結合,化學法、酶法、機械法相結合。 酶法與高壓勻漿、超聲波震蕩、鰲合劑、滲透壓法結合 如用溶解酶預處理面包酵母，然后高壓勻漿，95MPa壓力下勻漿4次，總破碎率接近100%。而單獨采用高壓勻漿法，同樣條件下破碎率只有32%。 有機溶劑與凍融法、干燥法結合,58,破碎技術的研究方向 -與上游過程相結合,在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基、生長期、操作參數(shù)（如pH、溫度、通氣量、攪拌轉速、稀釋率等）等因素都對細胞壁膜的結構與組成有一定的影響。 在生長后期，加入某些能抑制或阻止細胞壁物質合成的抑制劑(如青霉素)，繼續(xù)培養(yǎng)一段時間后，新分裂的細胞其細胞壁有缺陷，利于破碎； 選擇較易破碎的菌種作為寄主細胞，如革蘭氏陰性細菌； 用基因工程的方法對菌種進行改造，如在細胞內引進噬菌體基因，培養(yǎng)結束后，控制一定條件（如溫度等），激活噬菌體基因，使細胞自內向外溶解，釋放出內含物。,59,破碎技術研究方向-與下游工程相結合 舉例：萃取破碎法提取酵母醇脫氫酶,60,（ inclusion bodies IBs),15.4 基因工程包含體的純化,基因工程菌培養(yǎng)液不同表達形式的前處理 胞外分泌型表達：離心,收集液相濃縮純化。 胞內表達： 胞內可溶性表達：離心,收集菌體細胞破碎離心，收集上清純化 胞內周質表達：離心,收集菌體低濃度溶菌酶或滲透壓沖擊等溶解目標物離心,收集上清液純化。 不溶性包涵體：離心,收集菌體細胞破碎離心,收集沉淀包涵體洗滌目標蛋白變性溶解復性純化。,61,外源蛋白在大腸桿菌中的積累,62,包涵體：一種蛋白質不溶性聚集體，包括目標蛋白、菌體蛋白等。目標蛋白一級結構是正確的，但立體結構是錯誤的，所以沒有生物活性。 包涵體的形成：大腸桿菌中目標產(chǎn)物的表達水平過高，超過正常代謝水平，過多表達產(chǎn)物聚集在細胞內，形成不溶性的包涵體。 高表達產(chǎn)生的積聚物在細胞內部形成不溶物原因？ 蛋白過量積聚，超過溶解度，導致沉淀； 蛋白生成太快，分子間疏水基團相互作用而聚集沉淀； 蛋白生成太快，分子內部二硫鍵的錯誤連接導致沉淀； 表達蛋白過多，與其結合/誘導組分不足，不能形成溶解狀態(tài) 蛋白質自身不穩(wěn)定。,包含體的構成,63,基因工程包涵體的純化方法,收集菌體細胞,細胞破碎,包涵體的洗滌,目標蛋白的變性溶解,目標蛋白的復性,包含體的出現(xiàn)不僅增加了生物分離設計的難度，也為蛋白質折疊機理研究提出了新的課題。 欲獲得天然活性態(tài)的目標產(chǎn)物，必需分離包含體后，溶解包含體并使其中的目標蛋白恢復應有的天然活性。,64,包涵體獲得 幾種常見的工藝路線(一),機械破碎 (高壓勻漿、高速珠磨）,離心提取包含體,加變性劑溶解,除變性劑復性,65,特點:是利用了包含體與細胞碎片的密度差，用離心法將包含體與細胞碎片和可溶性蛋白質分開，獲得了干凈的包含體，再對包含體溶解復性。 優(yōu)點：擺脫了大量的雜蛋白、核酸、熱原、內毒素等雜質，使后面的分離純化簡單了。從這個角度上講，包含體的形成對分離純化亦有好處。 缺點:要經(jīng)過幾次離心才能除去大部分的細胞碎片，加工時間較長。,路線1 的特點,66,包涵體獲得 幾種常見的工藝路線（二）,機械破碎,膜分離獲得包涵體,加變性劑溶解包含體,除變性劑復性,67,路線（二）應用了膜分離技術，用微孔膜除去可溶性蛋白質。 優(yōu)點是封閉式操作，不污染環(huán)境也不受環(huán)境污染，能量消耗也比離心法少。 缺點：細胞碎片和包含體一起被膜擋住，難以分開；而且膜的堵塞和濃差極化常常導致可溶性蛋白質的滯留。,路線2 的特點,68,包涵體獲得 幾種常見的工藝路線（三）,化學破碎 （加變性劑）,離心除細胞碎片,除變性劑復性,69,用化學法破碎，所采用的試劑既可以破碎又可以溶解包含體，將兩道工序和為一道，節(jié)省了設備和時間，比前兩者更適合于實驗室操作。 缺點是所有的可溶性雜質都沒有除去，混雜在產(chǎn)物中間，給后續(xù)分離帶來困難。,路線三：,70,1）包涵體的洗滌 細胞破碎后，包含體呈顆粒狀，致密。 洗滌的重要性：收集的沉淀中，除包涵體外，還包括許多雜質，如膜蛋白、肽聚糖、脂多糖等，復性時會與目標蛋白一起復性形成雜交分子而聚集，給后步純化帶來困難。 洗滌劑：溫和的表面活性劑、蔗糖、低濃度的弱變性劑（如尿素）或脫氧膽酸等。能溶解除去部分膜蛋白和脂質類雜質。 洗滌劑濃度以溶解雜質，不溶解包涵體中表達產(chǎn)物為原則。,71,2）目標蛋白的變性溶解 包涵體中不溶性的目標蛋白必須溶解到液相中，才能進一步純化。一般水溶液很難將其溶解，只有采用蛋白質變性才能使其形成可溶性的形式。 常用變性劑： 5-8 mol/L鹽酸胍和6-8 mol/L尿素, 作用：破壞離子間相互作用； 表面活性劑如1-2 SDS， 作用：破壞蛋白質肽鏈間的疏水相互作用。 PH9.0的堿溶液和有機溶劑，使用較少。 影響變性因素：時間、pH、離子強度、變性劑種類和濃度。,72,原理：在變性劑溶液中，溶解的蛋白質呈變性狀態(tài)，即蛋白質高級結構被破壞，但一級結構和共價鍵沒有破壞。當部分變性劑被除去后，蛋白質會重新折疊成具有活性的正確構型，該過程稱復性。 復性方法： 稀釋法除變性劑 加入大量水或緩沖液。 膜分離法除變性劑 透析、超濾、電滲析。 層析法：凝膠層析，高效疏水層析,3） 目標蛋白的復性,73,蛋白質復性影響因素： 變性劑濃度 目標蛋白濃度； pH和離子強度； 氧化還原條件。 還原劑： 二硫蘇糖醇、-巰基乙醇、還原型谷胱甘肽； 氧化劑： 氧化型谷胱甘肽; 堿性下通空氣。,鹽酸胍濃度mol/L,紅血球碳酐酶復性操作中變性劑 與蛋白質濃度對復性的影響,蛋白質濃度 mol/L,74,腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體蛋白在E.coli中的高密度發(fā)酵過程中以兩種形式表達： 細胞內有活性的可溶性蛋白形式（約占目標蛋白的30%） 無活性的包涵體形式（約占目標蛋白的70%）。,懸浮破壁,PBS,洗滌,離心,硫銨沉淀,親和層析,陽離子交換層析,溶解,復性,親和層析,濕菌體,發(fā)酵液,干凈菌體,上清液,包涵體,純品,活性檢測,破壁液