VEGF165 表達(dá)載體的構(gòu)建及其對(duì)人胃癌生長(zhǎng)的作用.doc

VEGF165表達(dá)載體的構(gòu)建及其對(duì)人胃癌生長(zhǎng)的作用作者：劉都戶，張學(xué)庸，黃裕新，樊代明【關(guān)鍵詞】胃腫瘤關(guān)鍵詞:胃腫瘤；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；基因轉(zhuǎn)染摘要:目的構(gòu)建血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF165）真核表達(dá)載體，研究其對(duì)胃癌生成的作用.方法用DNA重組方法，將編碼VEGF165的全長(zhǎng)cDNA克隆于pcDNA3載體中，構(gòu)建VEGF165mRNA真核表達(dá)載體；用陽(yáng)性脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，將重組體轉(zhuǎn)入人胃癌細(xì)胞（SGC-7901）省系；觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞周期、增殖能力及致瘤生長(zhǎng)情況等生物學(xué)指標(biāo).結(jié)果斑點(diǎn)雜交、間接免疫熒光等分析顯示，正義VEGF基因轉(zhuǎn)染技術(shù)可使VEGF的表達(dá)得到明顯地加強(qiáng).與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染細(xì)胞的G2/M期細(xì)胞增加（0.44）而S期細(xì)胞減少（0.17），克隆形成率（9.0%）明顯高于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞（4.0%）.瘤細(xì)胞接種裸鼠后33d，過表達(dá)VEGF人胃癌細(xì)胞所致的移植瘤體積（2351638）mm3明顯大于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞所致的移植瘤體積（1534363）mm3.結(jié)論VEGF可以通過加強(qiáng)腫瘤組織血管生成而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)，另外，VEGF的表達(dá)可能與細(xì)胞增殖能力有關(guān).Keywords:stomachneoplasms；vascularendothelialgrowthfactor；genetransfectionAbstract:AIMToconstructaeukaryoticexpressionvectorofVEGF165（vascularendothelialgrowthfactor）gene，andtomoredirectlyestablishtheroleofVEGFintheoncogenesisofhumangastriccarcinoma.METHODSVEGF165senseRNAexpressionvectorwasconstructedbyinsertingtheVEGF165cDNAintoSGC-7901cellsbylipofecttechnique.Thenthecellcycle，proliferativeabilityinvitroandgrowthinnudemiceoftransfectedcellswereexamined.RESULTSIntroductionoftheVEGFsenseconstructintoSGC-7901cellsresultedinamarkedincreaseintheexpressionofVEGF-specificmRNAandproteinbydotblotandim-munofluorescencestaininganalysisintransfectedtumorcells.Cellcycleanalysisshowedthat，comparedwiththeparentalcellsthenumberoftransfectedcellshadanincrease（0.44）inG2phaseandadecrease（0.17）inSphase，anditscolonyformingrate（9.0%）washigherthanthatofthecontrolcells（4.0%）；Thevolumeoftumor（2351638）mm3inthenudemiceinoculatedwiththecellstransfectedbyVEGF165expres-sionvectorgreatlyincreasedincomparisonwiththat（1534363）mm3innudemiceinoculatedwithSGC-7901cells.CONCLUSIONAsstartingangiogenesis，VEGFmightpro-motethegrowthofsolidtumor；inaddition，itmightcorre-latewiththeproliferationoftumorcell.0引言目前的研究已經(jīng)表明，血管生成是惡性腫瘤迅速增殖并轉(zhuǎn)移擴(kuò)散的主要條件之一1.隨著人們對(duì)血管生成誘導(dǎo)劑的深入研究，已發(fā)現(xiàn)有許多生長(zhǎng)因子，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子刺激新生血管形成的作用是通過全部或部分誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的.VEGF是一類特異性血管內(nèi)皮刺激因子，它高效特異地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，對(duì)其有強(qiáng)烈的促分裂作用和趨化作用2-4:增強(qiáng)微血管通透性，促進(jìn)血漿纖維蛋白外滲，為血管形成過程中多種細(xì)胞遷移提供一個(gè)纖維網(wǎng)絡(luò)；通過與內(nèi)皮細(xì)胞上兩個(gè)特殊受體flt和flk（KDR）作用，直接刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖，并產(chǎn)生纖維蛋白溶酶原激活劑和膠原酶，這不僅可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞移動(dòng)，有利于血管生成，而且還有利于癌細(xì)胞脫落進(jìn)入血管或向鄰近纖維蛋白和結(jié)締組織基質(zhì)擴(kuò)散，此方式為腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件5，6.另有實(shí)驗(yàn)表明，胃癌組織高水平表達(dá)VEGF，其表達(dá)量與腫瘤的惡性程度呈正相關(guān)7.我們通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)使胃癌細(xì)胞過表達(dá)VEGF，更直接地研究VEGF對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響.1材料和方法1.1材料限制性核酸內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、TaqDNA聚合酶、無DNA酶的Rnase購(gòu)自Promega公司，LipofectAmine由Gibco公司提供，G418由Sigma公司提供，RNA地高辛標(biāo)記試劑盒（SP6/T7）購(gòu)自BoehringerMannheim公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗兔IgG由Vector公司提供.人胃癌細(xì)胞系SGC-7901、宿主菌E.coliDH5和JM109均為本校西京醫(yī)院全軍消化性疾病研究所保存.含有605bp的人VEGF165cDNA基因被克隆在pGEM-3Zf（+）的BamHI位點(diǎn)質(zhì)粒pGEM-hVEGF由美國(guó)加利福尼亞大學(xué)醫(yī)學(xué)院癌癥研究所Abraham教授惠贈(zèng)；pcDNA3真核表達(dá)載體由本校生物化學(xué)教研室柴玉波博士惠贈(zèng).BALB/c裸小鼠由本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供并飼養(yǎng).1.2方法1.2.1VEGF165真核表達(dá)載體的構(gòu)建、鑒定、擴(kuò)增及純化采用小量酶切反應(yīng)法，應(yīng)用BamHI，EcoRI+HindIII，EcoRI，PstI分別對(duì)pGEM-hVEGF進(jìn)行初步酶切鑒定，并對(duì)其進(jìn)行T7測(cè)序.根據(jù)pGEM-3Zf（+）及pcDNA3圖譜確定克隆策略.用EcoRI+XbaI消化pGEM-hVEGF后得到VEGF的cDNA可正向克隆于由此兩種酶消化后的pcDNA3中.連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)增.挑單一菌落，以堿裂解法小量提取質(zhì)粒，對(duì)其進(jìn)行酶切鑒定，然后對(duì)陽(yáng)性重組子進(jìn)行大量質(zhì)粒提取，并純化再進(jìn)行酶切鑒定.1.2.2VEG165基因轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染細(xì)胞的鑒定將SGC-7901細(xì)胞以1107L-1的密度接種于24孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的G418，G418抗性克隆的篩選濃度為14d內(nèi)殺死SGC-7901的最低濃度.按5105細(xì)胞/孔的量在6孔板中接種指數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞，在37，50mLL-1CO2孵箱中培養(yǎng)過夜，直到細(xì)胞50%匯片.用無血清RPMI1640培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞1次，然后將DNA/Liposome復(fù)合物及無血清RPMI1640液加入轉(zhuǎn)染細(xì)胞孔中.孵育5h后，加入含200mLL-1小牛血清的完全RPMI1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)48h后，將其傳代于G418選擇培養(yǎng)液，選擇G418抗性克隆細(xì)胞并擴(kuò)增培養(yǎng)，待進(jìn)一步鑒定.VEGFRNA檢測(cè)探針的制備，帶有hVEGF165的質(zhì)粒，經(jīng)合適的核酸內(nèi)切酶酶切后，對(duì)待轉(zhuǎn)錄的線性DNA質(zhì)粒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，加入Dig標(biāo)記用的NTP混合底物，即可以T7RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄出反義VEGFRNA，用以檢測(cè)正義RNA表達(dá)；RNA斑點(diǎn)雜交，用異硫氰酸胍一步法提取細(xì)胞總RNA，變性后，將其點(diǎn)樣于NC膜上，干燥后，80烘烤2h，6SSC浸濕，65水浴3h進(jìn)行預(yù)雜交.加入地高辛標(biāo)記的VEGFRNA探針，60水浴18h進(jìn)行雜交.然后用SSC洗膜、加封閉液，加堿性磷酸酶標(biāo)記的抗Dig抗體檢測(cè)，NBT/BCIP呈色.1.2.3細(xì)胞生長(zhǎng)試驗(yàn)集落形成試驗(yàn):將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞作梯度倍數(shù)稀釋，接種于含10mL預(yù)溫37培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，輕輕晃動(dòng)使細(xì)胞分散均勻.培養(yǎng)2wk左右，當(dāng)出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)，甲醇固定，姬姆薩染色，克隆計(jì)數(shù)，計(jì)算克隆形成率.細(xì)胞周期測(cè)定:分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的轉(zhuǎn)染細(xì)胞5105，PBS洗后加入700mLL-1乙醇固定，加PI染料，4放置30min，進(jìn)行FCM分析.流式細(xì)胞儀免疫熒光測(cè)定:將室溫固定的細(xì)胞離心后，重新懸浮于染色液（PBS+1gL-1Triton-X-100+100mLL-1羊血清）中，封閉1h后，分別加入第一抗體及正常兔IgG，室溫孵育60min，加入FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG.30min后，用PBS洗滌細(xì)胞，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè).裸鼠移植瘤生長(zhǎng):經(jīng)G418篩選的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)后，分別以1.4106個(gè)細(xì)胞接種于BALB/c裸小鼠右大腿背側(cè)皮下.測(cè)量腫瘤最大直徑和橫徑.腫瘤體積為V=1/2（db2）8.對(duì)不同數(shù)據(jù)采用相應(yīng)的分析方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理.2結(jié)果2.1pGEMhVEGF165的鑒定用限制性內(nèi)切酶EcoRI和HindIII對(duì)pGEM-hVEGF165進(jìn)行酶切，電泳后得到640bp片段.測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)VEGF165cD-NA正向克隆于T7啟動(dòng)子的下游，序列完全正確.用計(jì)算機(jī)基因酶譜分析軟件對(duì)hVEGFcDNA進(jìn)行分析，其上不含EcoRI，HindIII，XbaI等限制性內(nèi)切酶位點(diǎn).2.2hVEGF165真核表達(dá)載體的鑒定對(duì)VEGF165cDNA正向插入pcDNA3構(gòu)建的重組質(zhì)粒，分別以EcoRI，XbaI，EcoRI+XbaI酶切后電泳，電泳相應(yīng)片段大小與圖譜序列大小一致.然后再用EcoRI+HindIII對(duì)其進(jìn)行雙酶切，未發(fā)現(xiàn)含有目的基因的相應(yīng)大小片段.2.3目的基因?qū)肴宋赴┘?xì)胞的證據(jù)G418抗性篩選:G418篩選濃度為350gmL-1.與未轉(zhuǎn)染的SGC-7901細(xì)胞相比，10d后可見轉(zhuǎn)染pcDNA3空載體對(duì)照組、pcDNA-hVEGF實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)，而SGC-7901細(xì)胞大部分死亡，14d后全部死亡，G418抗性克?。‵ig1）.經(jīng)G418篩選2mo后，轉(zhuǎn)染細(xì)胞仍繼續(xù)生長(zhǎng)；核酸分子雜交:應(yīng)用VEGF反義RNA單鏈探針進(jìn)行雜交時(shí)，各組細(xì)胞中的RNA均出現(xiàn)雜交信號(hào)，但其中轉(zhuǎn)染pcDNA-hVEGF的細(xì)胞（SGC-hVEGF）中的雜交信號(hào)明顯增強(qiáng)（Fig2）；流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞內(nèi)VEGF免疫熒光染色:用FCM測(cè)定經(jīng)FITC染色后的細(xì)胞熒光強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，間接反映細(xì)胞為VEGF含量變化.當(dāng)陰性對(duì)照組細(xì)胞（一抗為正常兔IgG）的熒光強(qiáng)度為1.8%時(shí)，SGC-7901細(xì)胞為31.6%，SGC/hVEGF為75.4%.2.4細(xì)胞生長(zhǎng)試驗(yàn)集落形成試驗(yàn):當(dāng)平板培養(yǎng)14d時(shí)，終止培養(yǎng)，并計(jì)算克隆數(shù).SGC-hVEGF的克隆形成率為9.0%，SGC-pcDNA為4.8%，SGC-7901為4.0%；轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞周期分布:SGC-hVEGF細(xì)胞與SGC-7901未轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，G2/M期細(xì)胞增加了0.44，而S期細(xì)胞減少了0.17，G0/G1期細(xì)胞無明顯變化（Tab1）；VEGF對(duì)胃癌細(xì)胞裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響:實(shí)驗(yàn)分2組，SGC-hVEGF細(xì)胞接種的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)組和SGC-7901細(xì)胞接種的對(duì)照組，每組5只裸鼠.裸鼠在細(xì)胞接種后6d可見腫瘤長(zhǎng)出，8d始測(cè)量腫瘤大小.結(jié)果可以看出，接種后8d時(shí)，各組間的腫瘤大小無差別.從13d開始，VEGF轉(zhuǎn)染細(xì)胞所致的實(shí)體腫瘤生長(zhǎng)速度增快（Tab2），腫瘤倍增時(shí)間縮短.33d時(shí)處死動(dòng)物，取腫瘤組織進(jìn)行組織學(xué)檢查，與SGC-7901細(xì)胞組相比，轉(zhuǎn)染VEGF細(xì)胞組的腫瘤組織切片可見血管豐富，細(xì)胞增生活躍，少見有組織缺血壞死現(xiàn)象.表1轉(zhuǎn)染細(xì)胞周期分布（略）表2裸鼠移植瘤體積（略）3討論腫瘤在直徑2mm時(shí)，腫瘤細(xì)胞通過彌散作用吸取營(yíng)養(yǎng)，當(dāng)腫瘤進(jìn)一步長(zhǎng)大時(shí)，必須依賴新生的毛細(xì)血管提供充足的血液，因此，腫瘤細(xì)胞誘發(fā)血管生成因子，作用于內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管形成9.胃癌的生長(zhǎng)依賴于血管生成，而且腫瘤組織前緣VEGF表達(dá)較其他部位明顯，微血管密度較高，血管生成活躍，說明VEGF表達(dá)與血管生成部位是一致的，它有助于胃癌細(xì)胞的增殖，有利于胃癌的生長(zhǎng)10，11.我們構(gòu)建了hVEGF165真核表達(dá)載體，通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，使人胃癌細(xì)胞過表達(dá)VEGF，從而以更直接的實(shí)驗(yàn)方法研究了VEGF對(duì)腫瘤發(fā)生、進(jìn)展的作用.Tischer等12首先對(duì)人VEGF基因的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析研究，并完成了人VEGF165的cDNA克隆，包括信號(hào)肽全長(zhǎng)約為600bp.他們并將VEGF165基因重組在pGEM-3Zf（+）載體的BamHI位點(diǎn).我們用限制性內(nèi)切酶分析其正確性，并對(duì)其進(jìn)行了DNA測(cè)序分析，進(jìn)一步確定了其可靠性及質(zhì)量.根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，我們成功?gòu)建了VEGF165真核表達(dá)載體.克隆了一個(gè)基因之后，許多研究者希望將其導(dǎo)入各種類型細(xì)胞中，對(duì)其特征加以分析.而這一目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)需要將目的DNA有效地導(dǎo)入表達(dá)細(xì)胞.本實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞為人胃癌細(xì)胞SGC-7901，目的是增強(qiáng)VEGF的表達(dá)，以觀察其對(duì)人胃癌生成的生物學(xué)作用.哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的蛋白質(zhì)在翻譯后被加工的機(jī)會(huì)較多（如糖基化），可提高產(chǎn)物正確構(gòu)型的機(jī)率；另外，哺乳動(dòng)物細(xì)胞易被重組DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，具有遺傳穩(wěn)定性和可