大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離純化與成骨鑒定.doc

大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離純化與成骨鑒定作者：李顯澎樊粵光劉建仁范海蛟江曉兵孫志剛曾建春陽建權(quán)【摘要】【目的】研究大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）的分離純化和在誘導(dǎo)條件下的成骨能力。【方法】取SPF級SD大鼠6只，采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離成年大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，取傳至第3代的MSCs進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)和免疫組化鑒定；應(yīng)用含地塞米松、-甘油磷酸鈉和維生素C的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液誘導(dǎo)傳代細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，檢測堿性磷酸酶（ALP）的活性和細(xì)胞礦化作用進(jìn)行成骨細(xì)胞鑒定?！窘Y(jié)果】全骨髓貼壁培養(yǎng)法能有效分離純化大鼠骨髓MSCs，MSCs在含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的低糖DMEM（L-DMEM）培養(yǎng)液中生長性狀相對穩(wěn)定，增殖速度快；誘導(dǎo)條件下，細(xì)胞ALP活性明顯增高，并出現(xiàn)了礦化結(jié)節(jié)?！窘Y(jié)論】建立了一種體外分離純化、培養(yǎng)擴(kuò)增大鼠骨髓MSCs的方法，成骨能力肯定，為中藥蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供材料基礎(chǔ)。【關(guān)鍵詞】骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞/病理學(xué)；細(xì)胞培養(yǎng)，體外的；組織工程骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）在體內(nèi)外誘導(dǎo)因子的作用下，可向成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、肌腱細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，具有很大的可塑性1，這使其在組織工程、細(xì)胞治療等方面成為研究的熱點(diǎn)2。為更好地將MSCs應(yīng)用于骨質(zhì)疏松癥、骨壞死、骨缺損，本實(shí)驗(yàn)通過體外細(xì)胞培養(yǎng)的方法將MSCs從骨髓中分離純化，觀察MSCs在體外的擴(kuò)增、鑒定，并誘導(dǎo)其定向成骨分化?，F(xiàn)報(bào)道如下。1材料與方法1.1動物SD大鼠6只，SPF級，體質(zhì)量140160g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號為：0025033。1.2主要試劑與儀器低糖DMEM（L-DMEM，美國Gibco公司，GNM31600）；兔抗大鼠CD34（BA0532）、CD44（BA0321）、CD54（BA0541）（武漢博士德公司）；高糖DMEM（Hyclone，SH30022.01B）；胎牛血清（Hyclone，SV30087.01）；胰蛋白酶（Hyclone，SV30042.01）；-甘油磷酸鈉（美國Simga公司）；地塞米松（美國Sigma公司）；D-hanks（美國Simga公司）；維生素C（美國Sigma公司）；生物素化抗生蛋白鏈菌素復(fù)合物（streptavidinbiotincomplex，SABC）（SA1022）試劑盒（武漢博士德公司）；二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）（AR1022）（武漢博士德公司）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。C02恒溫培養(yǎng)箱（SheldonManufactruing.Inc,modelNo:2323-2shellab，USA）；3k-15低溫離心機(jī)（美國Sigma）；DL-CJ-IF超凈工作臺（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司），MPS60倒置顯微鏡（LeikaDMIRB）；超純水系統(tǒng)（MILLPORE,SAS67120MOISHEMA,France）1.3培養(yǎng)液配制完全培養(yǎng)液：低糖DMEM（含體積分?jǐn)?shù)為10胎牛血清，10g/L青霉素、鏈霉素）；誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液：高糖DMEM（含體積分?jǐn)?shù)10胎牛血清，10g/L青霉素、鏈霉素）中加入-甘油磷酸鈉、地塞米松、維生素C，終濃度分別為10mmolL、10-8molL、50mol/L。1.4骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離3-4取健康成年SD大鼠（150g左右），1g/L新潔爾滅浸泡30min后，斷頸處死，碘伏消毒，體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精消毒，鋪無菌單蓋住上身；無菌條件下取雙側(cè)股骨、脛骨，除去骨表面附著的軟組織，用L-DMEM浸泡清洗；用彎鉗將兩端骨骺切除，顯露骨髓腔。用10mL注射器吸取L-DMEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，以沖出骨髓；輕輕吹打，制成單細(xì)胞懸液；1000r/min離心20min，離心后去上清，用完全培養(yǎng)液重懸，入培養(yǎng)瓶中，用完全培養(yǎng)液培養(yǎng)。1.5骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的原代和傳代培養(yǎng)將上述所得細(xì)胞懸液接種于25mL塑料培養(yǎng)瓶中，置37、體積分?jǐn)?shù)5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。于培養(yǎng)后的第3天更換培養(yǎng)液以更新細(xì)胞代謝環(huán)境。以后每3d換液1次，去除未貼壁的細(xì)胞，待細(xì)胞匯合約80時(shí)，用2.5g/L胰蛋白酶+0.4g/L乙二胺四乙酸（EDTA）消化，按1：2傳代培養(yǎng)。1.6大鼠骨髓MSCs的生長曲線測定取生長良好的第2、3代細(xì)胞（P2、P3），2.5g/L胰蛋白酶消化，1104mL接種于24孔板，每天各取3孔消化計(jì)數(shù)，每孔計(jì)數(shù)3次，連續(xù)7d。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)，描繪生長曲線（圖1）。圖1大鼠骨髓MSCs生長曲線（略）Figure1GrowthcurveofratMSCs1.7骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定5（1）細(xì)胞形態(tài)：細(xì)胞呈梭形，邊緣清晰整齊，貼壁生長，呈成纖維細(xì)胞形態(tài)生長，呈旋渦形（圖2）。（2）免疫組化：P3培養(yǎng)3d后，去培養(yǎng)液，用40g/L多聚甲醛固定；于體積分?jǐn)?shù)3%的雙氧水中室溫下放置10min；磷酸鹽緩沖液（PBS）洗2min，共3次；滴加正常山羊血清，室溫10min，除去多余液體，滴加多克隆兔抗大鼠CD34、CD44、CD54，4過夜；0.01mol/LPBS洗5min，共3次，滴加生物素化山羊抗兔IgG，37作用20min，0.01mol/LPBS洗5min共3次；滴加SABC，37作用20min，0.01mol/LPBS洗5min，共4次；DAB顯色，取1mL雙蒸水，加試劑盒A、B、C試劑各1滴，混和后加到切片，室溫顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間。雙蒸水洗滌，蘇木素復(fù)染2min，時(shí)間按所需要的著色強(qiáng)度而定，雙蒸水洗滌3次，每次2min；放入烘箱40烘干脫水，用樹膠封片，干燥后觀察。1.8骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化6培養(yǎng)第5代MSCs以1105個(gè)mL的密度接種于6孔培養(yǎng)板（內(nèi)鋪有預(yù)處理的蓋玻片），加完全培養(yǎng)液，48h后觀察細(xì)胞融合80%后，吸去完全培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)組加入誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液，對照組加入等量完全培養(yǎng)液，每3d換液1次。1.9成骨細(xì)胞鑒定71.9.1鈣鈷法測定堿性磷酸酶（ALP）活性將細(xì)胞接種于預(yù)先放有蓋玻片的6孔板內(nèi)，于第5天時(shí)吸取出培養(yǎng)液，用PBS沖洗3次，每次1min；中性福爾馬林室溫固定10min后蒸餾水沖洗3次；加入新鮮的孵育液37孵育6h，蒸餾水沖洗3次；20g/L硝酸鈷水（現(xiàn)配現(xiàn)用）溶液浸泡5min，蒸餾水沖洗3次；10g/L硫化銨水溶液作用5min，水洗，中性樹膠固定，標(biāo)記，鏡下觀察。1.9.2礦化結(jié)節(jié)染色誘導(dǎo)10d后吸取出培養(yǎng)液，PBS清洗3次，體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇固定30min，PBS清洗3次，1g/L茜素紅染色，雙蒸水沖洗3遍，中性樹膠固定，標(biāo)記，鏡下觀察。2結(jié)果與分析2.1細(xì)胞的原代培養(yǎng)培養(yǎng)的原代細(xì)胞接種72h后，出現(xiàn)較多貼壁細(xì)胞，經(jīng)沖洗和換液，去除懸浮細(xì)胞，貼壁細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)。4d后細(xì)胞開始增殖，生長良好，貼壁較均勻，倒置顯微鏡觀察活體細(xì)胞形態(tài)：MSCs呈纖維狀，梭形，有突起；約7d時(shí)，細(xì)胞匯合成片，其融合率可達(dá)到80（圖2）。2.2細(xì)胞的傳代培養(yǎng)將原代培養(yǎng)的細(xì)胞用胰蛋白酶消化并吹打制成單細(xì)胞懸液，傳代培養(yǎng)。傳至第5代，細(xì)胞密集重疊生長，梭形，呈旋渦狀。傳代的MSCs生長快慢與接種密度關(guān)系密切（圖3）。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)骨髓MSCs的生長性狀基本穩(wěn)定，二代細(xì)胞的形態(tài)、生長曲線無顯著性差異，細(xì)胞為均一的成纖維細(xì)胞樣，潛伏適應(yīng)期在第12天（約24h），對數(shù)生長期為第35天（約72h），以后進(jìn)入平臺期，在對數(shù)生長期，群體倍增時(shí)間34h，傳代周期約6d，每傳代1次細(xì)胞增加約2.2倍，有學(xué)者統(tǒng)計(jì)單個(gè)MSC經(jīng)20次擴(kuò)增，細(xì)胞數(shù)可達(dá)81051.5106個(gè)，說明MSCs適應(yīng)能力強(qiáng)，增殖速度快，體外擴(kuò)增容易，有巨大的擴(kuò)增潛能。另外，從理論上講，在體外設(shè)法誘導(dǎo)或用外源目的基因?qū)氲燃夹g(shù)，可使細(xì)胞進(jìn)行對稱性有絲分裂，從而無限擴(kuò)增而不分化。因此，MSCs可作為組織工程的種子細(xì)胞及細(xì)胞治療和基因治療的載體，用于疾病和損傷的治療。P3培養(yǎng)5d后，進(jìn)行細(xì)胞免疫組化檢測。CD29、CD44、CD54、CD73、CD105、CD166表達(dá)陽性,而CD14、CD34、CD45表達(dá)陰性,我們選用CD44、CD34、CD54進(jìn)行鑒定。圖4結(jié)果顯示在MSCs膜上呈深紅色，不透光為MSCs特性：CD44（+）、CD54（+），不表達(dá)為造血干細(xì)胞的特性：CD34（-）。2.3細(xì)胞ALP活性測定經(jīng)誘導(dǎo)后的細(xì)胞，堿性磷酸酶染色明顯，胞質(zhì)中陽性反應(yīng)呈現(xiàn)灰黑色顆粒或塊狀沉淀，ALP活性部位呈棕黑色（圖5）。2.4細(xì)胞礦化作用檢測連續(xù)培養(yǎng)10d后，細(xì)胞呈復(fù)層生長，茜素紅染色可見紅色的礦化結(jié)節(jié)顆粒，顆粒大小不均一，提示有礦化基質(zhì)沉積（圖6）。圖2原代培養(yǎng)第7天時(shí)形成的MSCs集落（50）（略）Figure2FeatureofMSCsafterprimaryculturingfor7days圖3MSCs第5代呈旋渦狀（100）（略）Figure3FeaturesofMSCsaftersubculturefor5generationsa.CD34（-）b.CD44（+）c.CD54（+）圖4MSCs免疫組化鑒定結(jié)果（50）（略）Figure4MSCsfeaturedetectedbyimmunohistochemicalmethod圖5成骨誘導(dǎo)后第5天（堿性磷酸酶染色，100）（略）Figure5Osteoblasticidentificationafterinductionfor5days圖6成骨誘導(dǎo)后第10天（茜素紅染色，50）（略）Figure6Osteoblasticidentificationafterinductionfor10days3討論MSCs在骨髓中的豐度不高，約占有核細(xì)胞的0.0010.01，因此進(jìn)行分離純化和體外繁殖培養(yǎng)就顯得尤為重要。研究表明4，骨髓液中的造血干細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞互相影響，相互作用，維持細(xì)胞生長。為此，我們采用了全骨髓結(jié)合貼壁法。早期，培養(yǎng)成分中骨髓造血干細(xì)胞對BMSCs的生長有利；待BMSCs貼壁、生長繁殖后，造血干細(xì)胞可被清除。因此，省略前期的細(xì)胞分離對骨髓MSCs的生長影響不大。許多研究表明6-8，地塞米松、-甘油磷酸鈉和維生素C是MSCs向成骨細(xì)胞分化和體外成骨的必要條件。地塞米松可促進(jìn)成骨細(xì)胞分化成熟，同時(shí)提高ALP的活性，調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分泌胰島素樣生長因子（insulin-likegrowthfactors，IGFs），促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)膠原合成。維生素C能促進(jìn)培養(yǎng)細(xì)胞合成膠原，形成鈣化，并能調(diào)節(jié)ATP、ALP活性和非膠原基質(zhì)蛋白的合成。-甘油磷酸鈉能為成骨細(xì)胞提供磷酸離子，促進(jìn)生理性鈣鹽的沉積和鈣化，是MSCs發(fā)生礦化結(jié)節(jié)的必要條件。ALP是成骨細(xì)胞的功能性酶，在鈣鹽沉積中起關(guān)鍵性作用；ALP能夠水解有機(jī)磷酸酶，使局部磷酸根濃度增高，而且可以破壞鈣化抑制劑，從而啟動鈣化。因此ALP活性的提高是MSCs向成骨細(xì)胞分化的重要標(biāo)志。因而人們常用細(xì)胞中該酶的活性高低來檢測成骨細(xì)胞的存在和成骨細(xì)胞的分化成熟程度。誘導(dǎo)分化的MSCs隨培養(yǎng)時(shí)間的延長，ALP活性逐漸增高，大量成骨細(xì)胞形成。隨著ALP活性的提高，鈣鹽沉積在膠原纖維上，形成鈣化結(jié)節(jié)。種子細(xì)胞的選擇與培養(yǎng)是骨組織工程中的基本環(huán)節(jié)，目前可作為種子細(xì)胞的來源主要有：骨、骨髓、骨膜和骨組織中的干細(xì)胞。MSCs有取材方便、安全，對供體損傷小，易于分離培養(yǎng)，體外增殖能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在一定條件下，可以定向誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞9。本實(shí)驗(yàn)室正準(zhǔn)備篩選出一批對促進(jìn)MSCs和其成骨分化的補(bǔ)腎中藥復(fù)方，擬建立用于防治骨質(zhì)疏松癥、骨壞死、骨缺損中藥的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)平臺，利用此平臺可將中藥復(fù)方的多組分、多靶點(diǎn)、多途徑作用特點(diǎn)與蛋白表達(dá)關(guān)聯(lián)起來，比較不同治則中藥復(fù)方的各自不同的蛋白表達(dá)靶點(diǎn)和對促進(jìn)MSCs以及其成骨分化能力的影響；根據(jù)表達(dá)水平差異，闡明補(bǔ)腎中藥復(fù)方的分子作用機(jī)制。【參考文獻(xiàn)】1RingeJ，KapsC，SchmittB，eta1PorcinemesenchymalstemcellsInductionofdistinctmesenchymalcelllineagesJCellTissueRes，2002，307（3）：321.2VandammeA，VandenDesscbeT，CollenD，eta1BonemarrowstromalcellsastargetsforgenetherapyJCurrGenether，2002，2（3）：195.3郭立迭，王捷，夏冰.改良法培養(yǎng)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究J.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2006,22（2）：131.4張本斯,王凡,鄧力，等.大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離純化與初步鑒定J.中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志,2003,12（2）:161.5李連達(dá),吳理茂,劉紅.大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)和生物學(xué)特征J.科學(xué)技術(shù)與工程,2003,3（6）:457.6CoelhoMJ，F(xiàn)ernandesMHHumanbonecellculturesinbiocompatibilitytestingPartll：effectofascorbicacidbetaglycerophosphateanddexamethasoneonosteoblasticdifferentiationJBiomaterials，2000，21（11）：1095.7陳東風(fēng)，黎暉，周健洪,等.大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)條件下的成骨特性J.中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào)，2004，2（5）：375.8SierraRI,SpeckerBL,JimenezF,etal.Biochemicalbonemarker