肺炎鏈球菌莢膜改良染色法研究.doc

肺炎鏈球菌莢膜改良染色法研究蔣蓮秀，黃光玲，何義，吳丹，鐘毓娟*（桂林醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心廣西桂林541004）摘要：目的探索一種新的細(xì)菌莢膜改良染色法，提高細(xì)菌莢膜染色質(zhì)量。方法涂片用A液60水蒸汽蒸染、B液媒染、C液固定脫色、D液復(fù)染。結(jié)果改良法菌體紫紅色，背景淺藍(lán)，莢膜無色透明，涂片背景干凈，菌體、莢膜、背景三者對(duì)比明顯。結(jié)論改良法莢膜染色莢膜清晰，菌體與莢膜之間對(duì)比明顯，方法簡便，重復(fù)性好，便于批量教學(xué)標(biāo)本制作。關(guān)鍵詞：莢膜；染色法；改良莢膜是某些細(xì)菌的特殊結(jié)構(gòu)，具有黏附、抗吞噬作用，與細(xì)菌的致病性有關(guān)，在細(xì)菌的鑒定中有重要意義。莢膜的形成主要受遺傳因素決定，但也與環(huán)境條件有關(guān)，如在動(dòng)物體內(nèi)和營養(yǎng)豐富（含大量血清和糖）的培養(yǎng)基中容易形成，而在普通培養(yǎng)基上極易消失1。細(xì)菌的莢膜染色在微生物學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)和某些細(xì)菌學(xué)診斷中是一種常用的也是較難掌握的染色技術(shù)。目前常用的染色法有Hiss、Muir，Olt、濕（干）墨水負(fù)染法以及改良染色法等，但這些方法仍然存在染色繁瑣、效果不理想等缺點(diǎn)。我們?cè)趥鹘y(tǒng)的染色技術(shù)的基礎(chǔ)上經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)，探討建立一種新的肺炎球菌莢膜染色法，現(xiàn)報(bào)道如下。1材料和方法1.1肺炎鏈球菌（本室保存菌種）。1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小白鼠（本院動(dòng)物中心清潔級(jí)）。1.3莢膜染色液A液（鞭毛染色液）：甲液為5%石炭酸5份，20%飽和鉀明礬溶液2份，20%鞣酸2份混合，乙液為堿性復(fù)紅酒精飽和液1份，甲、乙兩液混合過濾后第三天使用；B液：碘液（革蘭染色第二液）；C液：20%甲醇；D液：乳酸酚棉蘭（石炭酸20g，乳酸20mL，甘油40mL，棉藍(lán)0.05g，蒸餾水20mL）。1.4莢膜保護(hù)液15%葡萄糖溶液9份，無菌滅活兔血清1份，臨用時(shí)混勻。1.5培養(yǎng)基血清肉湯培養(yǎng)基（普通肉湯培養(yǎng)基，臨用時(shí)加5-8%的無菌滅活兔血清）。1.6方法1.6.1細(xì)菌涂片的制備將肺炎鏈球菌接種于血清肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24h，以比濁法稀釋菌液濃度為3108CFU/ml，取1ml培養(yǎng)物注射于體重約20g小白鼠腹腔內(nèi)，16h發(fā)病后，在瀕死的小白鼠腹腔內(nèi)注射1ml莢膜保護(hù)液，輕揉腹部，無菌條件下取腹腔液，再注射至另外健康小白鼠腹腔內(nèi)，每只0.3ml，連續(xù)轉(zhuǎn)種2次，待最后一次小鼠發(fā)病時(shí)，于小鼠腹腔內(nèi)注射1ml無菌生理鹽水，輕揉腹部2min，最后取腹腔液涂片。1.6.2染色方法涂片先滴加A液60水蒸汽蒸染（60水浴箱）5min，水洗；B液作用5min，水洗；C液作用30s，水洗；D液復(fù)染2-5min，水洗，干燥，油鏡觀察。2.結(jié)果背景沉渣較少，肺炎鏈球菌菌體染成紫紅色，菌體外為一無色透明莢膜區(qū)，背景淺藍(lán)或淺紅（因染色時(shí)間不一而不同），菌體、背景、莢膜對(duì)比非常明顯。3.討論莢膜的形成使大多數(shù)致病菌在動(dòng)物體內(nèi)起到保護(hù)細(xì)菌抵抗吞噬細(xì)胞的吞噬和消化作用，使細(xì)菌在體內(nèi)不易被殺滅，因此細(xì)菌的莢膜與其致病力有著密切的關(guān)系。有文獻(xiàn)報(bào)道2-3將莢膜保護(hù)液直接滴在載玻片上與細(xì)菌混合以保護(hù)莢膜，但這種方法存在一定的缺點(diǎn)：如血清干燥固定后蛋白質(zhì)凝固黏附在玻片上，染色背景不干凈等。本實(shí)驗(yàn)將莢膜保護(hù)液注射到小白鼠體內(nèi)，細(xì)菌在大量血清和糖的環(huán)境中形成更厚、更明顯的莢膜，染色后菌體和莢膜容易分辨，與凌體淑等報(bào)道的相一致4。大多數(shù)細(xì)菌的莢膜是多糖，與一般堿性染料結(jié)合力低，不易著色；而且可溶于水、易在用水沖洗時(shí)被除去5，因而莢膜染色法是一種較難掌握的特殊染色技術(shù)。傳統(tǒng)的Hiss、Muir，Olt等染色法，采用酒精燈火焰直接加熱，火焰溫度過高，溫度難以控制且加熱過程不穩(wěn)定，染液易在玻片上干涸附著6；另若加熱的溫度和時(shí)間掌握不好，容易使莢膜破壞和皺褶，在菌體的周圍出現(xiàn)殘缺及模糊不清的環(huán)圈，即出現(xiàn)假莢膜現(xiàn)象7。我們對(duì)傳統(tǒng)的染色法做了改進(jìn)，采用鞭毛染色液60水蒸汽蒸染，由于溫度適中，沒有破壞莢膜結(jié)構(gòu)，無假莢膜現(xiàn)象；另外鞭毛染色液，可增強(qiáng)染液的著色性；碘液媒染，使菌體與媒染劑結(jié)合緊密，再滴加20%甲醇起到固定和溫和脫色作用；乳酸酚棉蘭是真菌孢子的特殊染色劑，能使有莢膜的菌體周圍出現(xiàn)一圈無色透明的光圈，菌體、莢膜和背景對(duì)比分明，更易于分辨；乳酸酚棉蘭中的甘油有保濕封片作用，制片不易干燥，便于長期保存。本文探討的莢膜染色法，增加了媒染、脫色、復(fù)染的步驟，使菌體著色好；莢膜厚而肥大，背景及菌體之間對(duì)比鮮明，易于觀察；操作過程的每一步驟均有定量指標(biāo)，適合一次性制作大量教學(xué)標(biāo)本片；本細(xì)菌莢膜染色法效果明顯、穩(wěn)定，成功率高，較易掌握，值得在教學(xué)、科研、臨床中廣泛推廣。參考文獻(xiàn)1周正任主編.醫(yī)學(xué)微生物學(xué)M.第六版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2004：132于江，楊靖，曹慧.細(xì)菌莢膜染色法的改進(jìn)J.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1993，（1）：43張鵬程.細(xì)菌莢膜染色法的改進(jìn)J.微生物學(xué)通報(bào)，1984，（2）：834凌體淑，趙世鴻，夏世萍.細(xì)菌莢膜染色的創(chuàng)新J.現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2004，19（4）：355管遠(yuǎn)志、王艾玲、李堅(jiān)主編.醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)M.2006:186陳文文，張維，沈況敏等.恒溫水浴加熱染色法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌效果分析J.中外醫(yī)療，2011，（16）：727盧嘉，張昌菊.莢膜染色法的改進(jìn)及與應(yīng)用J.宜昌醫(yī)學(xué)專科學(xué)校學(xué)報(bào)，1991，18（1）：68基金項(xiàng)目：作者