微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng).ppt

專題2:微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用,課題1微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng),微生物包括哪五類：,病毒細(xì)菌放線菌真菌原生生物,原核生物,原生生物,真菌,病毒界,（1）按物理狀態(tài)來分：培養(yǎng)基可分為固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基和半固體培養(yǎng)基。其中固體培養(yǎng)基用于菌種分離、鑒定菌落等。（2）按成分來分，可分為天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。（3）按功能來分，可分為基本培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基。,一、培養(yǎng)基分類：,選擇培養(yǎng)基,加入青霉素的培養(yǎng)基:分離酵母菌、霉菌等真菌加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基:分離金黃色葡萄球菌不加氮源的無氮培養(yǎng)基:分離固氮菌不加含碳有機(jī)物的無碳培養(yǎng)基:分離自養(yǎng)型微生物加入青霉素等抗生素的培養(yǎng)基:分離導(dǎo)入了目的基因的受體細(xì)胞,鑒別培養(yǎng)基,伊紅-美藍(lán)培養(yǎng)基:鑒別大腸桿菌酚紅培養(yǎng)基:鑒別分解尿素的細(xì)菌剛果紅培養(yǎng)基:鑒別分解纖維素的細(xì)菌,二、培養(yǎng)基的基本成分,1.基本成分：,碳源、氮源、水、無機(jī)鹽,碳源,無機(jī)碳源：,有機(jī)碳源：,CO2、HCO3-,牛肉膏、蛋白胨等,自養(yǎng)微生物,異養(yǎng)微生物,氮源,無機(jī)氮源：,有機(jī)氮源：,NH4、NO3-（為硝化細(xì)菌提供N源和能源）,牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等,2.生長因子：,維生素、氨基酸、堿基等,三、消毒與滅菌,消毒：指使用較為溫和的物理或化學(xué)方法僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對人體有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。滅菌：指使用強(qiáng)烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有微生物，包括芽孢和孢子。,滅菌與消毒技術(shù)是微生物有關(guān)工作中最普通也是最重要的技術(shù)。,芽孢,有些細(xì)菌在一定的條件下，細(xì)胞里面形成一個橢圓形的休眠體，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，對干旱、低溫、高溫等惡劣的環(huán)境有很強(qiáng)的抵抗力。例如，有的細(xì)菌的芽孢，煮沸3小時以后才死亡。芽孢又小又輕，可以隨風(fēng)飄散。當(dāng)環(huán)境適宜（如溫度、水分適宜）的時候，芽孢又可以萌發(fā)，形成一個細(xì)菌,孢子,細(xì)菌、原生動物、真菌和植物等產(chǎn)生的一種有繁殖作用的生殖細(xì)胞。能直接發(fā)育成新個體。,消毒的方法：,1、煮沸消毒法:100煮沸5-6min2、紫外線或化學(xué)藥物消毒3、化學(xué)藥劑消毒法:用70%酒精等進(jìn)行皮膚消毒;氯氣消毒水源4、巴氏消毒法：70-75下煮30min或80下煮15min,滅菌的方法：,1、灼燒滅菌2、干熱滅菌：160-170下加熱1-2h。3、高壓蒸汽滅菌：100kPa、121下維持15-30min.,四、實(shí)驗(yàn)操作,制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基,1.計算：,培養(yǎng)基用量,依配方計算各成分的用量,2.稱量：,3.溶化：,牛肉膏黏稠，用稱量紙稱取,牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加蓋,牛肉膏、稱量紙、少量水加熱溶解,取紙,蛋白胨、NaCl,瓊脂,補(bǔ)水定容,4.滅菌：,5.倒平板：,培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿,1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50左右時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計培養(yǎng)基的溫度？,問題討論,答：可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時，就可以進(jìn)行倒平板了。,2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？,答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。,3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？,4.在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？,答：平板冷凝后，皿蓋上會凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。,答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。,純化大腸桿菌,接種方法有：平板劃線法和稀釋涂布平板法,平板劃線法:通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)畫線的操作,將聚集的菌鐘逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面.在數(shù)次畫線后,可以分離到由一個細(xì)胞繁殖而來的肉眼可見的子細(xì)胞群體,這就是菌落.,微生物的恒溫培養(yǎng),問題討論,1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？,答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。,2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？,答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。,3.在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？,答：劃線后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細(xì)菌繁殖而來的菌落。,問題討論,涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進(jìn)行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第2步應(yīng)如何進(jìn)行無菌操作？,應(yīng)從操作的各個細(xì)節(jié)保證“無菌”。例如，酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍等等。,菌種的保存,1、臨時保藏：接種到固體斜面培養(yǎng)基，菌落長成后置于4冰箱保存。2、長期保存：甘油冷凍管藏法,課題2土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計數(shù),一、課題背景,1、尿素的利用,尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥。尿素不能直接被農(nóng)作物吸收。土壤中的細(xì)菌將尿素分解成氨之后才能被植物利用。,2、細(xì)菌利用尿素的原因,土壤中的細(xì)菌分解尿素是因?yàn)樗鼈兡芎铣呻迕?4、課題目的,從土壤中分離出能夠分解尿素的細(xì)菌,統(tǒng)計每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細(xì)菌,一.研究思路,.篩選菌株,.統(tǒng)計菌落數(shù)目,.設(shè)置對照,1、實(shí)例：,啟示：尋找目的菌種時要根據(jù)它對生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。,原因：因?yàn)闊崛獪囟?0800C，淘汰了絕大多數(shù)微生物只有Taq細(xì)菌被篩選出來。,DNA多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種在體外將少量DNA大量復(fù)制的技術(shù)，此項(xiàng)技術(shù)要求使用耐高溫（930C）的DNA聚合酶。,.篩選菌株,2、實(shí)驗(yàn)室中微生物的篩選原理：,人為提供有利于目的菌株生長的條件(包括營養(yǎng)、溫度、pH等)，同時抑制或阻止其他微生物生長。,什么是選擇性培養(yǎng)基？,3、土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計數(shù)所需培養(yǎng)基：,從物理性質(zhì)看此培養(yǎng)基屬于哪類？,固體培養(yǎng)基,在此培養(yǎng)基中哪些作為碳源、氮源？,碳源：葡萄糖、尿素氮源：尿素,培養(yǎng)基的氮源為尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作為氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生長發(fā)育繁殖，而受到抑制，所以用此培養(yǎng)基就能夠選擇出分解尿素的微生物。,5、培養(yǎng)基選擇分解尿素的微生物的原理,6、怎樣證明此培養(yǎng)基具有選擇性呢？,以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基,牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,是,分離尿素細(xì)菌,判斷該培養(yǎng)基有無選擇性,只生長尿素細(xì)菌,生長多種微生物,是,6、怎樣證明此培養(yǎng)基具有選擇性呢？,以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基,牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,是,分離尿素細(xì)菌,判斷該培養(yǎng)基有無選擇性,只生長尿素細(xì)菌,生長多種微生物,是,1、顯微鏡直接計數(shù)：,利用血球計數(shù)板，在顯微鏡下計算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。,.統(tǒng)計菌落數(shù)目：,不能區(qū)分死菌與活菌；不適于對運(yùn)動細(xì)菌的計數(shù)；需要相對高的細(xì)菌濃度；個體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察；,缺點(diǎn),2.間接計數(shù)法（活菌計數(shù)法）原理：在稀釋度足夠高時，微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的一個菌落是由一個單細(xì)胞繁殖而成的，即一個菌落代表原先的一個單細(xì)胞。常用方法：稀釋涂布平板法。,每克樣品中的菌落數(shù)(CV)M其中，C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(ml)，M代表稀釋倍數(shù)。,注意事項(xiàng)為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在30300的平板上進(jìn)行計數(shù)。為使結(jié)果接近真實(shí)值可將同一稀釋度加到三個或三個以上的平皿中，經(jīng)涂布，培養(yǎng)計算出菌落平均數(shù)。統(tǒng)計的菌落往往比活菌的實(shí)際數(shù)目低。,設(shè)置對照的主要目的是排除實(shí)驗(yàn)組中非測試因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。,.設(shè)置對照：,實(shí)例：在做分解尿素的細(xì)菌的篩選與統(tǒng)計菌落數(shù)目的實(shí)驗(yàn)時，A同學(xué)從對應(yīng)的106倍稀釋的培養(yǎng)基中篩選出大約150個菌落，但是其他同學(xué)在同樣的稀釋度下只選擇出大約50個菌落。分析其原因。,原因：土樣不同，培養(yǎng)基污染或操作失誤(或者是混入了其他的含氮物質(zhì)),小結(jié)：通過這個事例可以看出，實(shí)驗(yàn)結(jié)果要有說服力，對照的設(shè)置是必不可少的。,方案一：由其他同學(xué)用與A同學(xué)相同土樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn),方案二：將A同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，作為空白對照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。,結(jié)果預(yù)測：如果結(jié)果與A同學(xué)一致，則證明A無誤；如果結(jié)果不同，則證明A同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問題。,二.實(shí)驗(yàn)的具體操作.土壤取樣從肥沃、濕潤的土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中。取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌。.制備培養(yǎng)基：制備以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基。,應(yīng)在火焰旁稱取土壤10g。在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁進(jìn)行,三樣品的稀釋,.取樣涂布,實(shí)驗(yàn)時要對培養(yǎng)皿作好標(biāo)記。注明培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時間、稀釋度、培養(yǎng)物等。,.取樣涂布,分離不同的微生物采用不同的稀釋度,原因：不同微生物在土壤中含量不同,.微生物的培養(yǎng)與觀察,思考：要將哪些培養(yǎng)皿進(jìn)行培養(yǎng)？,.微生物的培養(yǎng)與觀察,在菌落計數(shù)時，每隔24h統(tǒng)計一次菌落數(shù)目。選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結(jié)果，以防止因培養(yǎng)時間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。,培養(yǎng)不同微生物往往需要不同培養(yǎng)溫度。細(xì)菌：3037培養(yǎng)12d放線菌：2528培養(yǎng)57d霉菌：2528的溫度下培養(yǎng)34d。,如果得到了2個或2個以上菌落數(shù)目在30300的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進(jìn)行菌落的計數(shù)，如果同一稀釋倍數(shù)的三個重復(fù)的菌落數(shù)相差較大，表明試驗(yàn)不精確，需要重新實(shí)驗(yàn)。,微生物的培養(yǎng)與觀察,三.結(jié)果分析與評價1.通過對照實(shí)驗(yàn)，若培養(yǎng)物有雜菌污染，菌落數(shù)偏高；若培養(yǎng)物混入其他氮源，則菌落形態(tài)多樣，菌落數(shù)偏高，難以選擇出分解尿素的微生物。2.提示：選擇每個平板上長有30300個菌落的稀釋倍計算每克樣品的菌數(shù)最合適。同一稀釋倍數(shù)的三個重復(fù)的菌落數(shù)不能相差懸殊，如相差較大，表示實(shí)驗(yàn)不精確。,四、操作提示,無菌操作,做好標(biāo)記,規(guī)劃時間,五.課外延伸在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑。培養(yǎng)某種細(xì)菌后，如果PH升高，指示劑將變紅，說明該細(xì)菌能夠分解尿素。,測定飲水中大腸桿菌數(shù)量的方法是將一定體積的水用細(xì)菌過濾器過濾后，將濾膜放到伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，大腸桿菌菌落呈現(xiàn)黑色，通過記述得出水樣中大腸桿菌的數(shù)量。,大腸桿菌呈黑色中心,有或無金屬光澤,大腸桿菌在伊紅美藍(lán)瓊脂(E