ELISA基礎(chǔ)知識及常見問題的處理.ppt

ELISA基礎(chǔ)知識及常見問題處理,北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司技術(shù)工程師崔偉,ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗）,ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗）是一種酶免疫測定。在臨床檢驗中主要通過抗原抗體于固相或液相載體中反應(yīng)檢測體液中的抗體或抗原性物質(zhì)。通過辣根過氧化物酶（HRP)與底物液TBM的反應(yīng)指示出所檢測物質(zhì)的有無。1抗原：抗原是能在機體中引起特異性免疫應(yīng)答的物質(zhì)。2抗體：抗體是能與抗原特異性結(jié)合的免疫球蛋白。Ig分五類，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。與免疫測定有關(guān)的Ig主要為IgG和IgM。機體被微生物感染后，先產(chǎn)生IgM抗體，然后產(chǎn)生IgG抗體。經(jīng)過一段時間，IgM抗體量逐漸減少而消失，而IgG抗體可長期存在，在疾病痊愈后可持續(xù)數(shù)年之久。,ELISA檢測方法,夾心法:雙抗原（抗體）夾心法是檢測抗原最常用的方法，其檢測方法：雙抗原夾心：固相(包被)抗原Ag+樣品(抗體Ab)+酶標抗原Ag*Ag-Ab-Ag*+底物(TMB)顯色雙抗體夾心：固相(包被)抗體Ab+樣品(抗原Ag)+酶標抗體Ab*Ab-Ag-Ab*+底物(TMB)顯色,間接法間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標記的抗抗體（抗人免疫球蛋白抗體）以檢測與固相抗原結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。其檢測方法：固相(包被)抗原Ag+樣品(抗體Ab)+酶標二抗Ab*Ag-Ab-抗Ab*+底物(TMB)顯色,競爭法其原理為標本中的抗體和一定量的酶標抗體競爭與固相抗原結(jié)合。標本中抗體量越多，結(jié)合在固相上的酶標抗體愈少，因此陽性反應(yīng)呈色淺于陰性反應(yīng)：固相(包被)抗原Ag+樣品(抗體Ab)+酶標抗體Ab*Ag-Ab+底物(TMB)不顯色(+)固相(包被)抗原Ag+樣品(無抗體Ab)+酶標抗體Ab*Ag-Ab*+底物(TMB)顯色(-),診斷試劑所用的質(zhì)量指標及相互關(guān)系：,靈敏度：能檢測到的分析物的最小量，表示檢測下限的能力。相對靈敏度=真陽性/（真陽性+假陰性）100%測定方法及表示方法：靈敏度標準品、質(zhì)控血清、陽性標本稀釋終點、血清盤（pannel）及臨床標本陽性率。靈敏度標準品可以從衛(wèi)生部臨檢中心購買，質(zhì)控血清可以從衛(wèi)生部臨檢中心購買，也可以自己配制。因為質(zhì)控血清不一定是原倍血清，或由于片段、亞型、位點等原因，評定試劑盒的靈敏度都帶有一定的片面性。陽性標本稀釋終點的方法常用于不同試劑盒的比較，但也有上述的片面性。陽性pannel有些可以從衛(wèi)生部臨檢中心購買，如HBsAg陽性pannel，也可以自己配制。臨床標本陽性率，是一種粗略的估計，但對臨床很實用。,特異性：真陰性標本的檢出能力。相對特異性=真陰性/（真陰性+假陽性）100%測定及表示方法：質(zhì)控血清、血清盤、臨床標本陰性率。質(zhì)控血清、血清盤可以從衛(wèi)生部臨檢中心購買，也可以自己配制。自己配制時注意陰性標本的在血清盤中的比例以及代表性。臨床標本陰性百分率是臨床使用中對試劑盒特異性的粗略的判斷。如果數(shù)批產(chǎn)品都通過了特異性參比測定，是否產(chǎn)品的特異性就一樣了呢？不一定。因為特異性參比品的數(shù)量不可能很大（樣本與整體的差異），引起非特異性的因素很多，目前尚不完全清楚。質(zhì)控血清盤也存在同樣的問題。,有關(guān)名詞簡介,質(zhì)控血清：質(zhì)控血清是為了對實驗結(jié)果進行控制而配制的血清。質(zhì)控血清可以是定值也可以是不定值，可以購置也可以自配。自己配制時要注意選用無脂血的血清或血漿，不能用試劑盒內(nèi)的陽性對照。若用稀釋的血清作為質(zhì)控血清，應(yīng)考慮稀釋基質(zhì)成分對結(jié)果的影響。因質(zhì)控血清與臨床標本不一致，應(yīng)該注意對結(jié)果的分析，應(yīng)該注意質(zhì)控血清只能用于質(zhì)控活動，不可用于標定儀器或評價方法。用于室內(nèi)質(zhì)控的質(zhì)控血清一般選取CUTOFF值2-3倍的質(zhì)控品。,室內(nèi)質(zhì)控：實驗室內(nèi)部使用控制實驗結(jié)果可靠性的一種質(zhì)量控制。室間質(zhì)評：用于考核各個實驗室結(jié)果可靠性的一種考核，可分為國家級和地方級的室間質(zhì)評。可以理解為“各個實驗室的質(zhì)量評比”。,臨界值（CUTOFF值）：臨界值是判斷陰陽性或有臨床意義水平的數(shù)值，臨界值的確定是測定大量數(shù)據(jù)后應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)方法確定的。許多試劑都會給出臨界值或臨界值的計算方法。本底：就是底色。如ELISAHBsAg，陽性顯色，陰性不顯色，本底就是整個陰性顯色的情況。ELISA抗HBcAb，陽性不顯色，陰性顯色，本底就是整個陽性顯色的情況。,陰性對照及陽性對照：陰、陽性對照若有正確的結(jié)果，對試劑盒操作的結(jié)果可以有粗略的判斷。空白對照：對ELISA試劑來說，空白對照實際上是不加標本不加酶做對照。空白對照主要測系統(tǒng)的吸光率?？瞻讓φ赵趩尾ㄩL測量時顯得尤其重要。,ELISA試劑常見問題及解答,ELISA試劑的原理基礎(chǔ)為抗原抗體免疫反應(yīng)，在生產(chǎn)、儲存、運輸、使用等各環(huán)節(jié)中，對其質(zhì)量特性產(chǎn)生影響的因素眾多。此外，其顯色系統(tǒng)中的過氧化物酶在生物樣品中普遍存在，故在客戶使用過程中經(jīng)常會產(chǎn)生某種非期望的結(jié)