魚腥藻PCC7120基因asr0757alr0758的初步研究.doc

魚腥藻PCC7120基因asr0757alr0758的初步研究 李麗君，陳思禮，馬凱，蔣澤鳳，周江旭 （中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，武漢） 摘要：為研究魚腥藻PCC7120（nabaenasp.）基因在毒素抗毒素系統(tǒng)中的相關(guān)生物學(xué)功能，設(shè)計了特異性引物，擴增目的片段和，將目的基因與載體連接構(gòu)建克隆載體，并對其進行和雙酶切，再與表達載體連接構(gòu)建表達重組菌，重組菌的體外表達在的誘導(dǎo)下進行。經(jīng)瓊脂糖電泳檢測，結(jié)果擴增出了大小為的和的目的基因。經(jīng)電泳檢測，表達出相對分子質(zhì)量分別為和的蛋白質(zhì)。根據(jù)結(jié)果可初步認(rèn)定為毒素基因，為抗毒素基因，共同構(gòu)成魚腥藻PCC7120毒素抗毒素系統(tǒng)。 關(guān)鍵詞：魚腥藻（nabaenasp.）；毒素抗毒素系統(tǒng)；/alr ：（） 魚腥藻的毒素抗毒素（，）系統(tǒng)是由編碼毒素蛋白和抗毒素蛋白的個基因?qū)餐M成的，毒素蛋白可通過影響細(xì)胞的相關(guān)生物學(xué)功能使其死亡，同時毒素也可能對人類及其他生物體造成威脅。研究表明，根據(jù)系統(tǒng)編碼產(chǎn)物的序列相似性可將其分為、等個系統(tǒng)家族，且大腸桿菌染色體上的家族是目前研究最廣、遺傳背景相對清楚的系統(tǒng)之一，。本試驗通過分子生物學(xué)分析，對魚腥藻基因進行了相關(guān)研究，旨在為該基因在毒素抗毒素系統(tǒng)中的相關(guān)生物學(xué)功能的研究提供基礎(chǔ)，為治理水華污染和開發(fā)高效的蛋白表達系統(tǒng)提供新思路。 材料與方法 試驗材料 藻種藻種為魚腥藻（），由中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院病原分子生物學(xué)研究室保存（購于中國科學(xué)院水生生物研究所）。 主要試劑及儀器克隆載體、限制性內(nèi)切酶、連接酶（公司），聚合酶（Fermentas公司），瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒（公司），、表達載體為本實驗室保存，引物合成、克隆載體及表達載體的測序均由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。 型空氣浴振蕩器（哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠）、型高速離心機（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）、型臺式高速離心機（湖南星科科學(xué)儀器有限公司）、型雙人單面凈化工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、型三恒電泳儀（上海金鵬分析儀器有限公司）。 試驗方法 程序：，個循環(huán)；，（）（），個循環(huán)；，個循環(huán)；，個循環(huán)。 重組克隆載體的構(gòu)建擴增目的片段通過V轉(zhuǎn)化到法制備的感受態(tài)細(xì)胞中，并通過藍白斑篩選在氨芐青霉素抗性固體培養(yǎng)基上進行雙重陽性篩選，最終挑取白色菌斑進行菌落，通過測序比對，從而確定克隆載體構(gòu)建成功與否?？寺◇w系為載體、純化產(chǎn)物、溶液。 重組表達載體的構(gòu)建用和對重組質(zhì)粒進行雙酶切獲取目的基因片段，雙酶切體系見表。通過DNA連接酶將目的片段與表達載體相連，連接體系見表。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入中，使其在含卡那霉素抗性的固體培養(yǎng)上培養(yǎng)，進行陽性篩選。有菌落白斑長出后，挑菌搖床過夜并取適量菌液測序以確定表達載體是否構(gòu)建成功。 毒素抗毒素蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達將含有重組質(zhì)粒的菌液接種于新鮮的含抗生素（卡那霉素）的抗性液體培養(yǎng)基中，搖床過夜，再取菌液活化，而后加入搖床誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達。對樣品進行處理后，用分離膠和的濃縮膠進行電泳檢測蛋白質(zhì)表達的相對分子質(zhì)量。 結(jié)果與分析 基因的擴增 應(yīng)用擴增技術(shù)擴增0基因，并對擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果表明，基因片段的實際大小與預(yù)期大?。ê停┫喾▓D、圖）。 克隆載體的構(gòu)建 擴增后的目的片段通過與載體在條件下連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到用法制備的感受態(tài)細(xì)胞中，進行藍白斑篩選，挑取陽性單菌落進行菌落檢測，將菌液進行測序，結(jié)果表明個目的基因、均成功轉(zhuǎn)入（圖）。 表達載體的構(gòu)建 選取上的酶切位點和，對克隆重組質(zhì)粒進行雙酶切，并將回收后的目的基因片段連接到表達載體上，再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌細(xì)胞中，挑取陽性單菌落，進行質(zhì)粒提取及雙酶切檢測，通過初步鑒定后進行測序。結(jié)果表明，表達載體成功構(gòu)建（圖、圖）。 由圖可知，在基因表達菌序列比對結(jié)果中，配對率為，基因覆蓋率為。圖為基因表達菌序列比對結(jié)果，結(jié)果表明其配對率為，基因覆蓋率為。個基因引物設(shè)計時，均敲除了終止密碼子。 毒素抗毒素蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達 經(jīng)測序成功的表達載體重組質(zhì)粒，在的誘導(dǎo)下進行體外表達（圖）。結(jié)果表明，毒素抗毒素蛋白質(zhì)在、的條件下經(jīng)誘導(dǎo)時有蛋白質(zhì)表達，但基因表達量較少，且誘導(dǎo)劑本身對細(xì)胞生長有一定的毒性作用，所以初步認(rèn)為其為毒素基因。目的毒素蛋白質(zhì)、抗毒素蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量分別為和，再加上其組氨酸標(biāo)記及相應(yīng)的酶切位點，分子量增加約為，故實際檢測到的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量約和。經(jīng)電泳檢測，在k之間及之間分別有一較為明顯的條帶，與理論值基本相符。 討論 本試驗設(shè)計了和基因的特異性引物，采用降落擴增目的基因構(gòu)建相應(yīng)的克隆載體，再利用經(jīng)測序檢測正確的克隆重組質(zhì)粒來構(gòu)建表達載體，測序并進行序列比對后表明，目的基因均正確插入到表達載體中，且沒有任何堿基突變出現(xiàn)，故個目的基因表達載體均成功構(gòu)建。在表達載體的構(gòu)建過程中，載體與目的片段的最佳濃度比例為，此比例下菌落生長狀況較好。大于的比例時，菌落幾乎不生長，故載體與目的片段比例的選取是該步驟中的一個重要因素。此外，正常生長的單菌落中，由于載體未完全切開或載體自連等原因產(chǎn)生假陽性，因此必須對重組質(zhì)粒進行測序以驗證試驗結(jié)果。 含目的基因的和含目的基因的經(jīng)誘導(dǎo)表達，經(jīng)軟件分析可知，蛋白質(zhì)表達的大小分別為和，再加上k左右的組氨酸標(biāo)記及相應(yīng)酶切位點，理論大小為和。檢測結(jié)果表明，目的蛋白質(zhì)的分子實際大小與理論值基本相符。目的蛋白質(zhì)在、條件下培養(yǎng)表達，但其最佳表達條件有待進一步研究。毒素基因可能具有核酸酶活性，而已有的研究表明，具有核酸酶活性的毒素蛋白質(zhì)可通過降解抑制細(xì)胞生長，故其表達量較少。 目前，淡水湖泊的污染形勢日趨嚴(yán)峻，而藻類是水體富營養(yǎng)化的主要媒介，且大腸桿菌細(xì)胞染色體上系統(tǒng)基因參與了一種特殊的環(huán)境脅迫應(yīng)答并介導(dǎo)細(xì)菌的程序性死亡，使得對系統(tǒng)的研究具有十分重要的指導(dǎo)意義。本試驗成功克隆和表達了魚腥藻染色體基因和，并對其相關(guān)性質(zhì)進行了初步研究，為后續(xù)的相關(guān)試驗奠定基礎(chǔ)。 參考文獻： ，： 陳思禮，梅菊魚腥藻染色體上同源基因的克隆及表達中南民族大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），（1）： ，： ，（）： 楊自言，馮婷婷，寧德剛