（生態(tài)學專業(yè)論文）青海省部分地區(qū)冬蟲夏草遺傳多樣性rapd分析.pdf

青海省部分地區(qū)冬蟲夏草遺傳多樣性r a p d 分析 中文摘要 冬蟲夏草為傳統(tǒng)名貴中藥材。冬蟲夏草資源在青海省的分布區(qū)主要是在青南 高原的玉樹、果洛二州，在青海中部也有分布。本論文采用r a p d 分子標記技 術對青海省不同產(chǎn)地的2 0 份冬蟲夏草樣品進行了多態(tài)性分析和聚類比較，從而 為我省冬蟲夏草資源在遺傳多樣性保護，分類研究，遺傳圖譜構建等方面積累了 資料，為其他藥用物種進行r a p d 實驗提供參考和借鑒。通過研究，取得了以 下進展： 1 對分別用s d s 法、改良c t a b 法兩種方法提取的冬蟲夏草基因組d n a ， 進行電泳檢測和紫外分光光度的檢測。結果表明兩種方法均可獲得完整的冬蟲夏 草基因組d n a ，但是改良c t a b 法提取的冬蟲夏草d n a 質量較好，電泳檢測 的譜帶清晰穩(wěn)定，無降解。同時采用改良c t a b 法提取的d n a 的o d 2 6 0 0 0 2 8 0 值相對較好，間于1 6 2 0 之間，說明d n a 質量較好。因此，通過以上2 種方法 的對比可以選擇了改良的c t a b 法進行冬蟲夏草d n a 基因組的提取。 2 實驗對p c r 反應體系中5 個重要因子進行了正交試驗，篩選出最優(yōu)的反 應體系，并在此最優(yōu)體系的基礎上，分別對退火溫度、擴增循環(huán)數(shù)進行了單因素 試驗，得到了r a p d 反應合理的熱力學程序，確定了一套優(yōu)化的冬蟲夏草r a p d 反應體系和p c r 擴增條件。通過正交試驗得到了冬蟲夏草r a p d p c r 的最佳擴 增體系為：2 0p l 總反應體系中包含，3 5n g 模板d n a ，2 0ut a q 酶，0 4l u n o l l 引物，0 2m m o l l d n t p s ，1 5m m o l l m 9 2 + 。其熱循環(huán)程序為；9 5 預變性3m i n 之后進行4 0 次循環(huán)，9 4 變性6 0s ，3 7 退火lm i n ，7 2 延伸2m i n 。最后 7 2 延伸5m i n 。保存于4 。 3 用4 0 個隨機引物對2 0 份冬蟲夏草樣品進行了r a p d 分析，成功地篩選出了9 個適合于冬蟲夏草r a p d 分析的隨機引物，這些引物可以擴增出豐富清晰的條 帶。這9 個引物進行p c r 擴增后，共檢測到6 5 個位點，平均每條引物檢測到7 。2 個 位點，其中呈多態(tài)性位點5 7 個，平均多態(tài)性條帶數(shù)為6 3 條，多態(tài)性位點比率p 為8 7 6 9 ，9 - q - i ；l 物的多態(tài)位點比率從7 5 - 1 0 0 不等。 4 根據(jù)隨機引物對2 0 個冬蟲夏草樣品的擴增結果構建o 1 矩陣，在n t s y s 軟 件上計算出各品種間的相似系數(shù)，品種問的相似系數(shù)決定了品種間的親緣關系， 相似系數(shù)越大，親緣關系越近。2 0 個冬蟲夏草樣品間的相似系數(shù)介于 o 1 8 1 8 0 9 8 7 6 之間。其中樣品1 8 和2 0 的相似系數(shù)最大為0 9 8 7 6 ，表明兩者親緣關 系最近。聚類分析結果表明：五個樣地的2 卟樣品，每個樣地的樣品均聚在一類， 表明相似系數(shù)與樣品的地理位置密切相關。 關鍵詞：冬蟲夏草，遺傳多樣性，r a p d ，相似系數(shù) i i i ns o m ea r e a so fq i n g h a ic o r d y c e p ss i n e n s i sr a p d a n a l y s i so fg e n e t i cd i v e r s i t y 一一 一 j - 一一一 c o r d y c e p ss i n e n s i s ( b e r k ) s a c ci sac h i n e s et r a n d i t i o n a lm e d i c i n a lf u n g u s t h e c o r d y c e p ss i n e n s i sr e s o u r c e si nq i n g h a ip r o v i n c e sd i s t r i b u t i o na r e aa l em a i n l ys o u t h t h ep l a t e a uy u s h u , g u o l u ot w os t a t e s ，a l s oh a st h ed i s t r i b u t i o nm i d d l eq i n g h a i p r o v i n c e r a p dt e c h n i q u ei su s e di na n a l y z i n gt h eg e n e t i cd i v e r s i t yo f2 0s a m p l e s f r o mf i v ed i f f e r e n tr e g i o n so fq i n g h a ip r o v i n c e ，t h er e s u l t sw o u l dr e v e a lt h eg e n e t i c b a c k g r o u n do fc o r d y c e p ss i n e n s i so fq i n g h a ip r o v i n c ea n dp r o v i d et h eb a s i c i n f o r m a t i o nf o rp r o t e c t i o na n de v a l u a t i o n ，u s eo fg e r m p l a s mr e s o u r c e s t h em a j o r f i n d i n g sa r ea sf o l l o w s ： 1 t w om e t h o d s s d sm e t h o da n di m p r o v e dc t a bm e t h o dw e l eu s e dt oe x t r a c t g e n o m i cd n af r o mc o r d y c e p ss i n e n s i s t h ed n as a m p l e so ft w om e t h o d sw e r e t e s t e db ya g a x o s eg e l e l e c t r o p h o r e s i sa n ds p e c t r o p h o t o m e t e r t h er e s u l tw a st h a tt h e t w om e t h o d sc o u l db eu s e df o re x t r a c t i n gg e n o m i cd n af r o mc o r d y c e p ss i n e n s 趣 a n dt h a tt h ei m p r o v e dc t a bm e t h o dw a st h eb e s to n e st h r o u g hw h i c ht h ep r o d u c t i o n h a dt h eh i g h e s tp u r i t y t h eo d 2 6 0 o d 2 8 0w a sb e t t e rb yi m p r o v e dc t a bm e t h o d , b e t w e e ni n1 6 - 2 0 s o ，w ec h o i c et h ei m p r o v e dc t a bm e t h o df o re x t r a c tg e n o m i c d n a 2 i nt h ee x p e r i m e n t ，f i v ee s s e n t i a lf a c t o r sw h i c hm a ya f f e c tt h er e s u l to fr a p d w e r eo p t i m i z e db yo r t h o g o n a le x p e r i m e n ta n dt w os i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t so f a f i n e a l i n gt e m p e r a t u r ea n dc y c l et i m e s t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h eo p t i m a lc o n d i t i o n s o fr a p d - p c r s y s t e ma n d r e a c t i o np a r a m e t e r sw e r e2 0 1 x lt 0 t a lr e a c t i n gs y s t e m ：3 5 n g t e m p l a t ed n a , 2 0ut a qe n z y m e ，0 4 p m o f lr a n d o mp r i m e r ，0 2 m m o f ld n t p s ，1 5 m m o l lm g ：碭er e a c t i o np r o c e d u r ew a s9 5 ci n3m i n ，t h e n4 0c y c l et i m e sw i t h 9 4 ci n6 0s ，3 7 i l llm i n 7 2 i l l2m i n , l a s t l y7 2 i i l5m i n , a n ds t o pr e a c t i o na t 4 c 3 t h e r ew e r e4 0r a n d o mp r i m e r su s e df o rt h ep c ra m p l i f i c a t i o no f2 0g e n o m i c d n af r a g m e n t n i n eo ft h ep r i m e r sc o u l da m p l i f yp o l y m o r p h i cb a n d s ，a l t o g e t h e r6 5 w e r ea m p l i f i e d ，e v e r yp r i m e rc o u l da m p l i f ya na v e r a g eo f7 2b a n d s ，a n di nt h e r e 1 i i b a n d si n c l u d e5 7b a n d s ，p o l y m o r p h i s mp o s i t i o ns p o tr a t i oa c c o u n t sf o r8 7 6 9 e v e r yp r i m e rc o u l da m p l i f ya na v e r a g eo f 6 3p o l y m o r p h i cb a n d s ，n i n eo ft h ep r i m e r s c o u l da m p l i f yp o l y m o r p h i s mp o s i t i o ns p o tr a t i oo f7 5 10 0 4 a c c o r d i n gt or a n d o mp r i m e rp a i r so f2 0s a m p l e so fc o r d y c e p ss i n e n s i sr e s u l t s b u i l d0 1m a t r i xa n du s et h es o f t w a r en t s y st oc a l c u l a t es i m i l a r i t yc o e f f i c i e n t s b e t w e e na l lv a r i e t i e sw h i c hd e t e r m i n e st h eg e n e t i cr e l a t i o n s h i pb e t w e 肌t h et w o s p e c i e s ，t h eg r e a t e rt h es i m i l a r i t yc o e f f i c i e n t , t h ec l o s e rg e n e t i cr e l a t i o n s h i p t h e v a l u eo ft h es i m i l a r i t yc o e f f i c i e n t so f2 0s a m p l e sw e r eo 1818t o0 9 8 7 6 t h e s i m i l a r i t yc o e f f i c i e n tb e t w e e nh u m18a n dn b m2 0i st h el a r g e s to f a l lt h a tm e a n st h e c l o s e s tr e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h et w o c l u s t e ra n a l y s i ss h o w e dt h a t ：f i v ep l o t so f2 0 s a m p l e s ；e a c hs a m p l ep l o to ft h es a m p l e sw e r eg a t h e r e di nac l a s s ，i n d i c a t i n g s i m i l a r i t yc o e 銜c i e n ti sc l o s e l yr e l a t e dt ot h es a m p l ei o c a t i o n s i m i l a r i t yc o e f f i c i e n t ， i v r a p d ，g e n e t i cd i v e r s i t y , s i m i l a r i t yc o e f f i c i e n t s 中文摘要 目錄 a b s t r a c t ，i - l - 一 刖吾 第一章綜述 1 1 遺傳多樣性的研究進展 1 1 。1 形態(tài)學標記 1 1 2 細胞學標記 1 1 3 基于生 1 1 4 分子標 1 1 4 1 1 1 4 2 1 1 4 3 1 1 4 4 1 1 4 5 隨機擴增多態(tài)性d n a ( r a p d ) 技術 1 1 4 6r f l p 、r a p d 、i s s r 、a f l p 四種分子標記技術的特點對比9 1 2 冬蟲夏草的研究進展 1 2 1 冬蟲夏草的化學 1 2 1 1 蟲草多糖 1 2 1 2 氨基酸和 1 2 1 3 脂肪和脂 1 2 1 4 糖醇和甾 1 2 1 5 抗菌活性 1 2 1 6 蟲草素和生物堿 1 2 1 7 其他成分 1 2 2 冬蟲夏草生物學特性 1 2 2 1 感染 1 2 2 2 生長 1 2 2 3 形態(tài) 1 ：2 2 4 分布 1 2 3r a p d 技術在冬蟲夏草中的應用 1 2 3 1 構建遺傳指紋圖譜 1 2 3 2 品種鑒別的研究 1 2 3 3 遺傳多樣性和遺傳分化研究 1 3 本實驗研究內容 1 3 1 本實驗的研究內容主要包括以下幾個方面 1 3 2 擬解決的關鍵問題 第二章材料與方法 2 1 樣品的選取 2 2 試劑與儀器 2 2 1 主要試劑 2 2 2 試劑的配置和準備 l 2 2 2 3 4 5 6 6 7 7 7 2 3 2 4 第三章 3 1 3 1 2 紫外分光光度法的檢測 3 2d n a 濃度和純度的檢測 2 5 2 6 2 6 2 6 2 7 2 7 2 9 2 9 3 0 3 0 3 1 3 l 1 3 1 3 4 3 7 3 7 3 2 1 瓊脂糖凝膠電泳檢測 3 2 2 紫外分光光度法的檢測結果 3 3 最佳p c r 擴增反應體系的建立 3 3 1 正交試驗的結果分析 3 3 2 退火溫度的篩選結果 3 3 3 循環(huán)次數(shù)的篩選結果 3 3 4 最終p c r 擴增體系 3 3 5 最終p c r 反應程序 3 4r a p d 擴增結果與分析一 3 4 1 引物的篩選結果 3 4 2 部分r a p d 結果統(tǒng)計0 ，1 矩陣和引物擴增圖譜 3 5 相似系數(shù)，遺傳距離和聚類分析 第四章討論 4 1 基因組d n a 的提取與純化 3 8 4 3r a p d 擴增結果的統(tǒng)計與聚類分析4 0 第五章結論一4 l 參考文獻一一4 2 至； 謝一4 6 個人簡歷二一4 7 在學期間發(fā)表的學術論文4 8 青海省部分地區(qū)冬蟲夏草遺傳多樣性r a p d 分析 i 厶- 一 刖吾 冬蟲夏草為傳統(tǒng)名貴中藥材之一。冬蟲夏草( c o r d y c e p ss i n e n s i s ) t i 】屬于真菌門 ( e u m y c o t a ) 、子囊菌亞門( a s c o m y c o t i n a ) 、核菌綱( p y r e n o m y c e r e s ) 、麥角菌目 ( c l a v i c i p i t a l e s ) 、麥角菌科( c l a v i c i p i t a c e a e ) 的蟲草屬( c o r d y c e p s ) 【2 】。 冬蟲夏草為冬蟲夏草菌寄生在蝙蝠科昆蟲蝙蝠蛾( h e p i a l u sa r m o r i c a n u s o b e r t h u r ) ，越冬幼蟲上的子座及幼蟲尸體的復合體。其名日：冬則為蟲，夏則為 草，“蟲”已不是蟲，蟲體早已成了蟲草菌的養(yǎng)分，乃為菌核，外表僅具有蟲狀： “草”是蟲草菌的子座，出土的子座上部圓柱形，內有子囊殼，其中產(chǎn)生許多子囊 和子囊孢子【3 l 。它沒有繁茂的枝葉，又不能開出鮮艷的花朵，由此蟲草既不是“冬 為蟲，夏變草”，也不是“既是蟲，又是草”，而是蟲草菌和寄主昆蟲的“結合體”。 主產(chǎn)于四川、青海、西藏、云南、貴州等海拔4 0 0 0 5 1 0 0m 的山中【4 】。 近年來，冬蟲夏草對肺、腎疾病的治療及調節(jié)免疫、預防保健等方面的作用 得到肯定【5 l 。蟲草的營養(yǎng)價值也很高。每百克蟲草含有蛋白質2 5g ，脂肪8 4g ， 碳水化合物2 8 9g ，粗纖維1 8 5g ，游離氨基酸1 2 種，水解氨基酸1 8 種，并含 有無機元素、蟲草酸、蟲草素、維生素b 1 2 、六碳糖醇、生物堿等營養(yǎng)成分【6 1 。 近年來，人們對健康的要求愈加重視，冬蟲夏草則以其治療和保健效果而吸引國 內外消費者的更大關注。青海省的野生冬蟲夏草資源主要分布在青南高原的玉 樹、果洛二州，占全省天然冬蟲夏草產(chǎn)量的8 5 以上。本實驗將運用分子生物 學技術對青海省部分地區(qū)的冬蟲夏草遺傳多樣性進行研究。 應用分子生物學技術研究物種遺傳多樣性是現(xiàn)代生物多樣性研究的熱點之 一。到目前為止，有關冬蟲夏草分子生物學研究及分子水平的遺傳多樣性的研究 工作報道多數(shù)集中于形態(tài)學、生態(tài)學和生活史等方面f 7 8 】。本實驗所采用的是隨 機擴增多態(tài)性d n a ( r a p d ) 技術，從d n a 水平上對類群比較分析，確定品種間 的親緣關系，繪制親緣關系聚類分析樹狀圖。實驗的目的是為了能夠了解青海省 冬蟲夏草的遺傳多樣性背景。并且能較好的反映青海省不同地區(qū)冬蟲夏草資源親 緣關系的遠近，青海省冬蟲夏草資源的遺傳學距離。有助于我們在一定程度上解 釋青海省冬蟲夏草的道地性。在遺傳多樣性保護，分類研究，遺傳圖譜構建等方 面積累資料，為其他藥用物種進行r a p d 實驗提供參考和借鑒。 青海省師范大學碩士學位論文 第一章綜述 1 1 遺傳多樣性的研究進展 遺傳多樣性( g e n e t i cd i v e r s i t y ) 又稱為基因多樣性。廣義上講，遺傳多樣性是 指地球上所有生物所攜帶的遺傳信息的總和，包括不同物種間以及物種內的遺傳 變異f 9 1 。狹義上講，遺傳多樣性是指種內基因的變化，包括物種內顯著不同的種 群間以及同一種群內部的遺傳變異程度的總和，即遺傳多態(tài)性程度【1 0 1 。在一般情 況下，遺傳多樣性是指狹義的概念。種內多樣性是物種以上各水平多樣性的重要 來源】。種內遺傳變異的來源主要有突變、重組和染色體畸變，其中最根本的是 突變，它是所有生物多樣性產(chǎn)生的根源。這種變異致使生物在種群水平、組織和 細胞水平以及分子水平上表現(xiàn)出遺傳多樣性，并直接影響到變異水平的高低及變 異的分布格局，即種群的遺傳結構【1 2 1 。遺傳變異是決定物種可能具備的抵御外界 的不良環(huán)境能力的重要因素，一個物種的穩(wěn)定性和進化潛力依賴于其遺傳多樣 性，而物種的經(jīng)濟和生態(tài)價值也依賴于其特有的基因組成f 1 。由此可見，遺傳多 樣性的分析和研究有助于揭示生物界各種不同層次之間的遺傳分化，物種間不同 種群的親緣關系，能確保生物多樣性的合理的有效的利用以及生物多樣性的可持 續(xù)性發(fā)展的能力。 現(xiàn)在國際上的學者公認為穩(wěn)定有效的遺傳標記( g e n e t i cm a r k e r s ) 是研究遺傳 多樣性的主要方法。遺傳標記是生物體特有的性狀或物質，指與目標性狀緊密連 鎖，同該性狀共分離且易于識別的可遺傳的等位基因的變異【b l 。通過遺傳標記就 可以客觀地反映出物種個體或群體間的遺傳變異情況和規(guī)律。但是由于遺傳變異 一般都發(fā)生在分子水平上，故檢測技術的難度較高。到今天遺傳標記的發(fā)展經(jīng)歷 了四個階段，形態(tài)學標記( m o r p h o l o g i c a lm a r k e r s ) 、細胞學標記( c y t o l o g i c a l m a r k e r s ) 、基于生化水平的蛋白質標記( p r o t e i nm a r k e r s ) 和現(xiàn)階段的分子標記 ( m o l e c u l a rm a r k e r s ) 1 1 4 l 。無論采用什么標記技術，其目的都是為了從不同層次揭 示遺傳變異的情況，都能從各自的角度提供有價值的信息。 1 1 1 形態(tài)學標記 形態(tài)學標記是指那些可以利用肉眼或借助簡單測試就可以識別的能明確的 呈現(xiàn)出物種的遺傳多樣性，并且在遺傳結構上比較穩(wěn)定，較難受到外界環(huán)境的 影響的性狀。典型的形態(tài)學標記是可以直接用肉眼識別和觀察的1 1 5 1 。如冬蟲夏 草的子座直徑、長度等可以輕易識別的性狀。這些性狀可以結合野外調查、標 2 青海省部分地區(qū)冬蟲夏草遺傳多樣性r a p d 分析 本采集、移栽和子代測定等手段，采用科學的數(shù)學方法進行統(tǒng)計和分析。因此 從形態(tài)學或表型性狀來檢測遺傳變異是最直接也最簡便易行的方法。溫學森等 【1 6 】選取7 個典型的地黃栽培品種，在相同的條件下栽培，在花期和果期測量1 1 個形狀的大小，對測量數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，發(fā)現(xiàn)個品種間花果數(shù)量性狀差異 顯著，并對1 7 個測量數(shù)據(jù)和性狀進行了聚類分析，揭示了這7 個品種間的親緣 關系。梁洪卉等【1 7 】根據(jù)冬蟲夏草子座直徑、長度等形態(tài)性狀數(shù)據(jù)得出結論，認 為青海省的冬蟲夏草大致分成3 個組，即分別產(chǎn)于環(huán)青海湖地區(qū)、青海中東部 和南部。 ， 但是，由于基于形態(tài)性狀來研究特定的物種有一定缺點且不可靠【l ，而且 由于形態(tài)或表型性狀數(shù)量較少，表型和基因型之間存在著基因表達、調控、個 體發(fā)育等復雜的中間環(huán)節(jié)，且易受外界環(huán)境條件、人為因素等的影響，往往會 有表征性狀相同但遺傳物質不同或表征性狀不同而遺傳物質相同的情況存在。 因此單純依據(jù)形態(tài)學標記來反映物種的遺傳多樣性是不夠準確和完善的。 1 1 2 細胞學標記 細胞學標記是利用不同的細胞學特征來反映物質的遺傳多樣性。m e r r e l l 認 為，任何生物的天然種群中都存在著或大或小的染色體變異，這些變異在進化中 起著重要的作用【1 8 】。染色體結構特征和數(shù)量特征是常見的細胞學標記。他們分別 反映了染色體結構上和數(shù)量上的遺傳多態(tài)性。前者主要是染色體核型和帶型等， 核型特征主要是指染色體的長度、著絲粒的位置和隨體的有無等，由此可以反映 染色體的缺失、重復、倒位和易位等遺傳變異；而帶型特征是指染色體經(jīng)特殊染 色顯帶后，染色體上顯示出條帶的寬窄、位置順序和顏色深淺等，由此可以反映 常染色質和異染色質分布的差異。染色體的數(shù)量特征是指染色體數(shù)目的多少，包 括整倍體和非整倍體，前者如多倍體，后者如缺體、單體、三體等非整倍體。用 具有染色體數(shù)目和結構變異的材料與染色體正常的材料進行雜交，其后代常導致 特定染色體上的基因在減數(shù)分裂過程中的分離和重組發(fā)生偏離，由此可以測定基 因所在的染色體及其相對位置。因此染色體結構和數(shù)目可以作為一種遺傳標記 【l9 1 。石大興【2 0 】對引種墨西哥辣椒核型進行了分析，與國產(chǎn)辣椒品種比較發(fā)現(xiàn)核 型差異較大。王正詢等【2 i 】對芭蕉屬正蕉組內7 種野生蕉和1 1 種栽培蕉進行了核型 分析，認為s i m m o n d s 的分類系統(tǒng)側重于形態(tài)，與染色體組的構成并無必然的對 應關系，香蕉的進化是多元的。 細胞學標記雖然可以克服形態(tài)標記的某些不足，但是細胞學標記所需的材 料需要花費較大的人力和較長的時間來培育，同時，某些物種對染色體數(shù)目和 3 青海省師范人學碩? l 二學位論文 結構變異的反應敏感，容易死亡，有些適應變異的能力較差。而且由于受染色 體制片技術和分辨率的限制，核型分析應用于大量材料的遺傳多樣性的研究還 有一定的難度【2 2 l 。這樣一來耗費的人力物力比較大，就限制了細胞學標記的在 遺傳多樣性研究中的應用。， 1 1 3 基于生化水平的蛋白質標記 基于生物體內生化性狀為遺傳標記的有很多種，主要包括血型標記、血清蛋 白標記和同工酶標記等【2 3 1 ，其中應用最為廣泛的就是蛋白質標記。蛋白質標記 通?？梢苑譃槊傅鞍踪|和非酶蛋白質兩種。在非酶蛋白質中，應用比較多的是種 子儲藏蛋白，儲藏蛋白主要分為四類：自蛋白，球蛋白，醇溶蛋白和谷蛋白。不 同的品種由于遺傳組成不同，其蛋白質在種類，數(shù)量，大小以及結構等方面的不 同，可以通過電泳區(qū)別出不同的蛋白質圖譜，從而能夠用于物種的鑒定和遺傳多 樣性的研究。吳若菁【2 4 l 以馬尾松的胚乳為材料，證實了馬尾松種子儲藏蛋白存在 遺傳多樣性，通過分株測定，共檢測6 0 株，每株檢測6 1 0 粒種子的胚乳，共獲得 4 2 6 個有效樣品，發(fā)現(xiàn)該天然馬尾松林中存在有2 6 種類型的醇溶蛋白圖譜，群體 內的雜合單株的醇溶蛋白圖譜的表型分離，經(jīng)擴增檢驗，符合孟德爾l ：1 的分離 比。這種方法穩(wěn)定性，重復性好，有很強的實用性。但是由于儲藏蛋白具有種的 特異性，因此很難區(qū)分親緣關系較近的樣品。 酶作為遺傳標記是在m a r k e r t 和m o l l e r 提出同工酶的概念后迅速發(fā)展起來【2 5 l 。 同工酶是指催化同一化學反應，而酶蛋白的分子結構不同的一組酶。它們彼此在 氨基酸序列、底物的親和性等方面都存在著差異。這種蛋白質的多樣性，可能是 由于基因編碼的氨基酸序列的差異引起，也可能是同一基因經(jīng)過不同的剪接加工 過程引起。根據(jù)電荷性質的差異，通過蛋白質電泳或色譜技術及染色反應顯示出 同工酶的不同形式，從而反映不同的基因型。同工酶分子結構存在差異，分子大 小形狀不同，在特定p h 值條件下所帶電荷數(shù)量及性質不同，電泳時在凝膠載體 中具有不同的遷移率和遷移方向。經(jīng)染色處理后，特定的酶可以顯示出特異的酶 帶色斑。同工酶的組成由遺傳因素決定，是基因表達的產(chǎn)物，具有完全表達、共 顯性表達的特點，而且受外界環(huán)境干擾較弱，實驗程序簡單，易操作，成本較低， 比形態(tài)學標記更能提供較大的差異信息。所以同工酶作為一種遺傳標記已經(jīng)被廣 泛用于種質資源的鑒定，生物遺傳多樣性研究，生物進化，種系發(fā)生及遺傳定位 等方面。黃劍波等【2 6 】對泰國香蕉b 9 、巴西b s ，威廉斯8 1 8 和粉蕉組培生根苗進行 了過氧化物酶的檢測分析，發(fā)現(xiàn)香蕉4 個不同品種組培苗根中過氧化物同工酶共 有8 條酶帶，可分為i ，i i ，i i i 區(qū)，有共同的特征酶帶，可作這些香蕉品種的鑒 4 青海省部分地區(qū)冬蟲夏草遺傳多樣性r a p d 分析 定酶帶，同時，每一個香蕉品種又有特征酶帶，利于同工酶水平條件下鑒定香蕉 品種。周厚高等【2 7 】利用9 個等位酶系統(tǒng)的1 4 個基因位點的等位基因資料對8 個百合 品種的遺傳組成進行了分析，并探討了品種間的親緣關系，同時還利用等位酶分 析技術，檢測了新鐵炮百合自交初代各株系的遺傳多樣性與遺傳分化。 蛋白質是基因表達的產(chǎn)物，與形態(tài)性狀、細胞學特征相比，數(shù)量上更豐富， 受環(huán)境影響比較小，而且實驗材料來源多，操作簡單，結果容易進行比較，能更 好地反映遺傳多樣性，因此蛋白質標記是一種比較好的遺傳標記，已被廣泛應用 于研究遺傳多樣性的各個領域，也是檢測遺傳多樣性的最普遍的方法手段。但是 蛋白質標記仍有其局限性：( 1 ) 仍在不同程度上受到環(huán)境和發(fā)育過程的影響，( 2 ) 只能用于檢測編碼特定酶蛋白的基因，其他不參與編碼蛋白的基因或參與編碼的 蛋白無法提取的基因，以及部分變異隱蔽的基因都無法檢測，( 3 ) 標記檢測的位 點數(shù)目有限，無法提供大量的信息，( 4 ) 樣品質量的高低直接會影響到同工酶的 穩(wěn)定性。所以隨著技術的發(fā)展，分子標記將會占據(jù)遺傳標記的主導地位，成為種 群遺傳學、系統(tǒng)分類學、生物多樣性、基因表達與調控各個領域研究的主要手段。 ： 1 1 4 分子標記 近年來，隨著生命科學的不斷發(fā)展，分子遺傳標記技術在中藥材領域中日益 滲透，在分子水平上檢測基因多樣性分子標記的中藥鑒定方法得到不斷的發(fā)展與 應用，分子標記是以生物大分子，尤其是生物體的遺傳物質核酸的多樣性為基 礎的遺傳標記。近幾年來，直接檢測d n a 的分子標記技術得以迅速發(fā)展和應用。 與傳統(tǒng)的形態(tài)標記、細胞標記和蛋白質標記相比，分子標記具有以下優(yōu)點：( 1 ) 直接以d n a 的形式表現(xiàn)，在植物體的各種組織、各發(fā)育時期均可以檢測到，不 受季節(jié)、環(huán)境限制，不存在表達與否的問題；( 2 ) 數(shù)量極多，遍及整個基因組；( 3 ) 多態(tài)性水平高，自然存在著許多等位變異，不需要專門創(chuàng)造特殊的遺傳材料；( 4 ) 表現(xiàn)為“中性”，即不影響目標性狀的表達，與不良形狀無必然的連鎖；( 5 ) 許多分 子標記表現(xiàn)為共顯性，能夠鑒別出純合基因型和雜合基因型，提供完整的遺傳信 息1 2 引。目前d n a 分子標記已廣泛應用于種質資源研究、遺傳圖譜構建、目的基 因定位和分子輔助選擇等各個方面。其中新方法、新技術不斷涌現(xiàn)，而隨著d n a 多聚酶鏈式反應( p c r ) 技術的出現(xiàn)，許多新型的分子標記運用而生。根據(jù)多態(tài)性 檢測手段的不同可將其分為三類：基于s o u t h e r n 雜交技術的分子標記，如r f l p ； 基于p c r 反應的分子標記，r a p d 、p c r 與r f l p 結合產(chǎn)生的a f l p 標記等：還 有直接的片段序列測序【2 9 1 。當前應用比較廣泛的分子標記主要有顯性標記 青海省師范大學碩上學位論文 r a p d 、i s s r 、a f l p 。 1 1 4 1 限制性片段長度多態(tài)性技術 所謂限制性片段長度多態(tài)性技術( r e s t r i c t i v ef r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m s r f l p ) ，是基于s o u t h e r n 雜交的技術，是指用限制性內切酶切割不同個體基因 組d n a 后，含同源序列的酶切片段在長度上有明顯差異。將這些大小不等的片 段通過凝膠電泳時就形成不同的帶，用分子探針雜交并利用放射自顯影在感光底 片上成像，就會找出不同的位置，呈現(xiàn)出多態(tài)性。是1 9 9 0 年由美國杜邦公司的 j g kw i l l i a m s 等人建立起來的第二代分子標記技術1 3 0 l 。r f l p 技術運用于植物 抗性研究還只是近幾年的事，r f l p 能對植物的抗性基因進行定位和分離， 利用r f l p 技術，對于核基因組或葉綠體基因組、尤其是后者，若能提取純 凈d n a ，則可直接從酶切后的電泳圖譜看出其多態(tài)性，利用這一方法可以 測定種群內、種群間不同水平的物種在污染環(huán)境下抗性分化進化水平上的 差異【3 1 - 3 2 1 。 俞和韋等【3 3 】用r f l p 方法分析貢嘎蝠蛾幼蟲腸道真菌的多樣性，分別用 m s pi 、h a e i i i 和t a qi 對2 0 5 個陽性克隆的質粒酶切指紋圖譜分析，結果顯示 有2 3 個不同的r f l p 操作分類單元。為冬蟲夏草人工繁育提供基礎信息，同時 也為相關的昆蟲腸道或其它環(huán)境中的真菌多樣性及昆蟲與微生物協(xié)同進化關系 研究提供理論依據(jù)。獲得更多更全面的冬蟲夏草多樣性信息。 1 1 4 2r d n a - i t s 片段序列分析法 在r d n a 基因中，1 6 sr d n a 和2 3 sr d n a 基因間隔序列稱為( i t s ) ，它 的長度和序列變化較大。i t s 序列的分子生物學方法采用保守的引物i t s i 、i t s 對r d n a 的i s t 區(qū)域進行p c r 擴增。產(chǎn)物經(jīng)純化后，對i t s 進行測序，比較兩 者堿基序列的相似性1 3 4 】，可用于對細菌的不同生物型、菌株、種、屬進行分 類鑒定。甚至用于區(qū)分關系非常近的種。 章衛(wèi)民等【3 5 】從西藏采集的冬蟲夏草子實體中分離出3 個菌株c 3 、c 4 、c 5 ， 通過培養(yǎng)特征的研究以及采用分子生物學方法，以r d n a i t s 區(qū)為分子指標，與 冬蟲夏草的有性世代及中國被毛孢進行比較分析，發(fā)現(xiàn)c 4 的培養(yǎng)特征與c 3 、c 5 完全不同，其序列與冬蟲夏草的相似率為9 3 ，與中國被毛孢的相似率為9 4 ， 而c 3 、c 5 與冬蟲夏草的相似率很低( 分別為5 5 和6 9 ) ，從而證明c 4 是西藏 冬蟲夏草的無性型，為中國被毛孢。 魏鑫麗等1 3 6 】對內群和外群樣品的n r d n a 間隔區(qū)( i t s ) 堿基序列進行了測定； 對于測定的8 條序列連同來自基因庫中的4 條相關序列進行了分子系統(tǒng)學分析。 結果表明了中華束絲孢和中國被毛孢均是冬蟲夏草菌的無性型。 6 青海省部分地區(qū)冬蟲夏草遺傳多樣性r a p d 分析 趙錦等【3 7 】以r d n a - i t s 區(qū)為分子指標，對冬蟲夏草的有性和無性階段進行比 較分析，從分子水平證明冬蟲夏草的無性階段是中國被毛孢。 張澤文【3 8 】采用p c r 技術，以r d n a 的i t s 區(qū)為分子指標，對古尼蟲草的有 性和無性階段進行比較分析，從分子水平上證明古尼蟲草的無性階段是古尼擬青 霉。和冬蟲夏草進行了對比，為冬蟲夏草的鑒定和遺傳多樣性提供了證據(jù)。 1 1 4 3 簡單序列重復區(qū)間擴增多態(tài)性 簡單序列重復區(qū)間擴增多態(tài)性( i n t e r - s i m p l es e q u e n c er e p e a ti s s r ) 就是利用生 一 物基因組中常出現(xiàn)的簡單序列重復s s r ( s i m p l es e q u e n c er e p e a t ) 設計引物，檢測多 態(tài)性的一種分子標記。是由z i e t k i e w i c z 掣3 9 】提出的一種新的分子標記技術。i s s r 是一種類似r a p d ，但利用包含重復序列并在3 或5 錨定的單寡聚核苷酸引物對 基因組進行p c r 擴增的標記系統(tǒng)。i s s r 分子標記技術具有操作簡單、無須預先 知道d n a 序列、比r a p d 標記更為靈敏、穩(wěn)定且實驗重復性好等優(yōu)點，已用于 甘蔗、樂昌含笑、懷地黃、華木蓮等m 】的鑒定和遺傳多樣性的檢測分析。 梁洪卉掣4 l 】利用根據(jù)i s s r 指紋圖譜能夠鑒定不同產(chǎn)地的冬蟲夏草，而且 i s s r 分析表明青海省的冬蟲夏草可分成產(chǎn)于環(huán)青海湖地區(qū)和其他地區(qū)兩大類， 其他地區(qū)一大類又可分成青海省南部、中部和東部產(chǎn)區(qū)3 個平行分支。青海省的 冬蟲夏草在分布上表現(xiàn)出明顯的地域性。i s s r 分子標記對于冬蟲夏草的鑒定和 親緣關系檢測是非常有效的手段。 。 1 1 4 4 擴增片段長度多態(tài)性 擴增片段長度多態(tài)性( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m sa f l p ) 是 1 9 9 2 年由荷蘭k e y g e n e 4 2 】公司科學家z a b e a u 和v o s 4 3 1 發(fā)明的一種d n a 分子標記 新技術。其基本原理是基因組d n a 經(jīng)限制性內切酶雙酶切后，形成分子量大小 不等的隨機限制性片段，將特定的接頭( a d a p t e r ) 連接在這些d n a 片段的兩端， 形成一個帶接頭的特異片段，通過接頭序列和p c r 引物3 末端的識別后，特異 性片段經(jīng)變性、退火和延伸周期性循環(huán)而擴增，最終通過聚丙烯酰胺電泳分子篩 作用，將這些特異的限制性片段分離開來。其具有r f l p 的可靠性，又具有r a p d 的靈敏性，是分子標記技術重大突破，目前被認為是一種十分理想的、有效的分 子標記術 4 4 1 。 不過遺憾的是現(xiàn)在利用a f l p 技術對冬蟲夏草的遺傳多樣性及其鑒定的研 究較少，沒有得到什么理想的結果。 1 1 4 5 隨機擴增多態(tài)性d n a ( r a p d ) 技術 隨機擴增多態(tài)性技術( r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n ar a p d ) 耳 i 隨機擴 青海省師范大學碩士學位論文 增多態(tài)性d n a ，是1 9 9 0 年由w i l l i a m s 3 0 】和w e l s h 4 5 1 領導的兩個研究小組幾乎同 時獨立發(fā)展起來的。它是建立在p c r 基礎之上，使用一系列具有1 0 個堿基的單 鏈隨機引物，對整個基因組d n a 進行p c r 擴增以檢測多態(tài)性。由于不同引物擴 增出的d n a 片段不同，因此存在著大量的r a p d 標記。r a p d 的原理如圖1 1 所示。r a p d 分析和r f i p 分析相比，具有實驗程序比較簡便，省時省力，不需 要r f l p 分析的預備性工作。現(xiàn)在p a p d 技術多用于鑒定及親緣關系和遺傳多樣 性的研究。 c 了 口 1 口 = 模版d n 口i 9 4 攝氏度變性 隨機引物 3 7 攝氏度遺火 - 7 2 攝氏度延伸 i 模版變性退火 第二次循環(huán) - _ - _ _ - _ - - _ _ _ _ 。- 1 r - - i 一：- - - - - - - - - 一 - - - - _ - _ _ - 1 _ _ 一 經(jīng)過多次循環(huán)d m 擴增為2 的n 玟方條 圖1 1r a p d p c r 的原理簡圖 f i 9 1 1 ：1 1 把p r i n c i p l eo f r a p d 說明：當d n a 模板分子在2 0 0 - 2 0 0 0b p 有- - 4 , 段反向對稱的d n a 序列時。那么通過某一引物與其配對進 而合成斷健斷健又可做為模板合成另一段額鏈。其過程是：加熱到9 0 - 9 4 l m i n 。解開雙鏈；降溫 到3 7 - 4 0 約l m i n ，引物與模板結合；加熱到7 21 2 ( 約l m i n ) o l 物延長，合成新鏈從而完成一個循環(huán) 接著進行第二、三個循環(huán)。從而完成d n a 擴增 r a p d 技術的特點 ： ( 1 ) r a p d 標記數(shù)量多。因為r a p d 分析所用引物的數(shù)量很多，它可以覆蓋 基因組中所有位點。 ( 2 ) 所需模板d n a 量少，且質量不是很嚴格，而且r a p d 分析組織、器官及 發(fā)育時期的限制。 | | “， ( 3 ) 所用引物廣泛性強，不受物種限制。一套引物可以用于不同生物基因組 分析。 ( 4 ) r a p d 分析方便、快捷，無需克隆制備、同位素標記、s o u t h e r n 雜交等復 8 ililil 10毒 青海省部分地區(qū)冬蟲夏草遺傳多樣性r a p d 分析 雜性工作，可以減少對工作人員的危害。 ( 5 ) r a p d 是一種基于序列的多態(tài)性?？梢栽跊]有任何分子生物學基礎的情況 下對某一物種進行指紋圖譜的構建、遺傳多樣性研究。 ( 6 ) r a p d 標記是顯性的，因此不能區(qū)分一個位點擴增的片段是純合還是雜合 的。 1 1 4 6r f l p 、r a p d 、i s s r 、a f l p 四種分子標記技術的特點對比 隨著分子生物學和相關實驗技術的不斷發(fā)展，目前應用于遺傳多樣性的分子 標記技術種類繁多且各具特點，除上述四種以外還有以下相關分子標記技術：可 變數(shù)目串聯(lián)序列( v a r i a b l en u m b e ro f t a n d e mr e p e a t ，v n t r ) 、d n a 擴增指紋分 析( d n aa m p l i f i c a t i o nf i n g e r p r i n t i n g ，d a d 、特定順序擴增區(qū)法( s e q u e n c e c h a r a c t e r i z e da m p l i f i e dr