（法醫(yī)學(xué)專業(yè)論文）小鼠皮膚切創(chuàng)愈合過程中mgl表達(dá)及分布的研究.pdf

目錄 一、摘要 中文論著摘要1 英文論著摘要3 二、英文縮略語6 三、論文 前言l d i d o 0 00 7翮吾 ” “”“。7 材料與方法8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果1 3 討論一2 4 結(jié)論2 6 四、本研究創(chuàng)新性的自我評(píng)價(jià)2 7 五、參考文獻(xiàn)2 8 六、附錄 綜述3 0 在學(xué)期間科研成績(jī)4 0 致謝”一4 1 個(gè)人簡(jiǎn)介4 2 中文論著摘要 小鼠皮膚切創(chuàng)愈合過程中m g i _ 表達(dá)及分布的研究 目的 皮膚損傷愈合是一個(gè)連續(xù)而又復(fù)雜的生理過程，其大致可分為三個(gè)階段：急 性滲出期、纖維增生期和組織重建期。在急性滲出期，各種類型的炎癥細(xì)胞，例 如中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，浸潤(rùn)到損傷區(qū)域參與清除損傷壞死組織、異物及入侵 的病原體等。在纖維增生期，肌纖維母細(xì)胞主要參與損傷組織的修復(fù)。許多實(shí)驗(yàn) 證實(shí)，在皮膚損傷愈合過程中有各種各樣的細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和趨化因子的參 與。研究表明內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)廣泛參與炎癥反應(yīng)。內(nèi)源性大麻素水解酶主要有 兩種，即脂肪酸酰胺水解酶( f a a h ) 和單酰基甘油脂肪酶( m g l ) 。m g l 是一 種重要的內(nèi)源性大麻素水解酶，其主要作用是水解花生四烯酸甘油酯( 2 a g ) 。 有研究證實(shí)，m g l 在嚙齒類動(dòng)物的腦組織中高度表達(dá)，并且在維持內(nèi)源性大麻素 水平方面起到重要作用。到目前為止，尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)m g l 在皮膚損傷愈合過程 中的研究。本實(shí)驗(yàn)首次研究小鼠皮膚切創(chuàng)愈合過程中不同損傷時(shí)間段m g l 的表 達(dá)和分布情況，探討m g l 在皮膚損傷愈合過程中的作用及其應(yīng)用于損傷時(shí)間推 斷的可能性。 實(shí)驗(yàn)材料與方法 健康成年雄性b a l b c 小鼠4 5 只，體質(zhì)量3 5 、, 4 0 9 ，隨機(jī)分為9 組。其中8 組為皮膚切創(chuàng)組，另1 組為對(duì)照組。腹腔注射戊巴比妥鈉，背部剪毛處理后，常 規(guī)手術(shù)消毒，在背部中央做一縱行長(zhǎng)1 5 c m 皮膚全層切口，深達(dá)筋膜。傷后每只 小鼠單獨(dú)飼養(yǎng)，防止感染，保持1 2 h 的晝夜交替生活節(jié)律。分別于傷后6 h 、1 2 h 、 1 d 、3 d 、5 d 、7 d 、1 0 d 和1 4 d 將小鼠麻醉后脫頸椎處死，取傷口處1 5 c r u x l 0 c m 皮膚組織。各組5 只小鼠的皮膚樣本均分為兩部分，一部分用于h e 染色和免疫 熒光染色，另一部分用于w e s t e r nb l o t 和r e a l t i m ep c r 檢測(cè)。對(duì)照組5 只小鼠麻 醉后背部剪毛，不做切創(chuàng)，取相同部位同等大小皮膚。應(yīng)用免疫熒光，w e s t e r nb l o t 及r e a l t i m ep c r 技術(shù)檢n d , 鼠皮膚切創(chuàng)后不同時(shí)間m g l 表達(dá)變化情況，以非切 創(chuàng)小鼠皮膚組織作對(duì)照，顯微鏡x 4 0 0 倍下，在損傷區(qū)及損傷周邊區(qū)隨機(jī)選取1 0 個(gè)視野，計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)、陽性細(xì)胞數(shù)及陽性細(xì)胞率。應(yīng)用s c i o ni m a g e 軟件測(cè)各片 段的平均光密度值，測(cè)得數(shù)據(jù)用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差( 孑j ) 表示。用s p s s l 3 0f o r w i n d o w s 進(jìn)行單因素方差分析，以p 0 0 5 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 正常小鼠皮膚的表皮、毛囊及皮脂腺均表達(dá)m g l 。皮膚切創(chuàng)后6 - - 1 2 h ，在 皮膚損傷區(qū)及其周邊區(qū)可見大量中性粒細(xì)胞表達(dá)m g l ；傷后1 - - 一5 d , m g l 陽性細(xì) 胞主要以巨噬細(xì)胞為主；傷后7 - - - 1 4 d ，m g l 主要表達(dá)在肌纖維母細(xì)胞中。m g l 陽性細(xì)胞率于5 d 達(dá)高峰。中性粒細(xì)胞表達(dá)m g l 的陽性率于1 2 h 達(dá)高峰；巨噬細(xì) 胞表達(dá)m g l 的陽性率于5 d 達(dá)高峰；肌纖維母細(xì)胞表達(dá)m g l 的陽性率于7 d 達(dá)高 峰。經(jīng)w e s t e r nb l o t 檢測(cè)顯示，對(duì)照組及各個(gè)損傷時(shí)間段小鼠皮膚都有m g l 陽性 條帶，其中5 d 為m g l 蛋白表達(dá)高峰。r e a l t i m ep c r 結(jié)果顯示，對(duì)照組及各個(gè)損 傷時(shí)間段小鼠皮膚都有m g l m r n a 表達(dá)，其中5 d 為表達(dá)高峰。 結(jié)論 1 、正常小鼠皮膚的表皮、毛囊及皮脂腺均表達(dá)m g l 。 2 、小鼠皮膚切創(chuàng)愈合過程中，中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和肌纖維母細(xì)胞均表 達(dá)m g l 。 3 、小鼠皮膚切創(chuàng)愈合過程中，m g l 在不同細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)以及m g l 蛋白和 基因的表達(dá)均具有一定的時(shí)間變化規(guī)律性，可作為推斷皮膚切創(chuàng)損傷時(shí)間的依據(jù)。 關(guān)鍵詞 損傷時(shí)間推斷；皮膚損傷；單?；视椭久?；中性粒細(xì)胞；巨噬細(xì)胞； 肌纖維母細(xì)胞； 2 英文論著摘要 as t u d yo nt h e e x p r e s s i o n a n dd i s t r i b u t i o no f m o n o a c y l g l y c e r o ll i p a s ed u r i n g t h es k i ni n c i s e d w o u n d h e a l i n gi nm i c e o b j e c t i v e s k i nw o u n dh e a l i n gi sac o m p l i c a t e db u tw e l l c o n t r o l l e ds e q u e n t i a lb i o l o g i c a l p r o c e s s ，w h i c hc a n b et e m p o r a l l yd i v i d e di n t ot h r e ep h a s e s ，t h ee a r l ya c u t ee x u d a t i v e ， f i b r o p r o l i f e r a t i v ea n dt i s s u er e m o d e l i n gp h a s e d u r i n gt h ee a r l ya c u t ee x u d a t i v ep h a s e ， v a r i o u st y p e so fi n f l a m m a t o r yc e l l ss u c ha sn e u t r o p h i l sa n dm a c r o p h a g e sa x er e c r u i t e d a tt h ew o u n ds i t e t h e s ec e l l se r a d i c a t en e c r o t i cm a t e r i a l ，f o r e i g nm a t t e ra n di n v a d i n g p a t h o g e n s s u b s e q u e n t l y ，i nt h ep r o l i f e r a t i v ep h a s e ，m y o f i b r o b l a s t sm i g r a t et o t h e w o u n da r e aa n dp r o l i f e r a t et o r e p a i rt i s s u e d e s t r u c t i o n i na l lp h a s e s ，av a r i e t yo f c y t o k i n e s ，g r o w t hf a c t o r sa n dc h e m o k i n e sa r ei n v o l v e di ns k i nw o u n dh e a l i n gp r o c e s s i ti sg e n e r a l l ya c k n o w l e d g e dt h a te n d o g e n o u sc a n n a b i n o i ds y s t e mi si n v o l v e di naw i d e s p e c t r u mo fi n f l a m m a t i o ne v e n t s t h i ss y s t e mm a i n l yi n c l u d e st w oh y d r o l a s e s ：f a t t y a c i da m i d eh y d r o l a s e ( f a a h 9a n dm o n o a c y l g l y c e r o ll i p a s e ( i o l ) m g li sn o w c o n s i d e r e da so n eo ft h em o s ti m p o r t a n te n d o c a n n a b i n o i dh y d r o l a s e s ，w h i c hi st h e p r i m a r ye n z y m em e t a b o l i z i n g2 - a r a c h i d o n o y l g l y c e r o l ( 2 一a g ) i th a sd o c u m e n t e dt h a t m g li se x p r e s s e da th i g hl e v e l si nt h er o d e n tb r a i na n dp l a ya ni m p o r t a n tr o l ei nt h e h o m e o s t a s i so fe n d o c a n n a b i n o i d s h i t h e r t o ，t h e r ei sn or e s e a r c hr e p o r t e do nm g l d u r i n g t h es k i ni n c i s e dw o u n dh e a l i n g i nt h e p r e s e n ts t u d y , w ei n v e s t i g a t e d t h e e x p r e s s i o na n dd i s t r i b u t i o no fm g l a td i f f e r e n tp o s t t r a u m a t i ci n t e r v a l sd u r i n gt h es k i n i n c i s e dw o u n dh e a l i n gi nm i c ea n da i m e da te x p l o r i n gt h ep o s s i b l er o l eo fm g li ns k i n w o u n d h e a l i n ga n di t sa p p l i c a b i l i t yt ot h ew o u n da g e e s t i m a t i o n 3 m a t e r i a l sa n dm e t h o d s at o t a lo f4 5m a l ea d u l th e a l t h yb a l b cm i c e ，e a c hw e i g h i n g3 5 4 0 9 ，w e r e d i v i d e di n t on i n eg r o u p sr a n d o m l y , o n ec o n t r o lg r o u pa n d e i g h ts k i ni n c i s i o ng r o u p s a 1 5 - c m l o n gf u l l - - t h i c k n e s si n c i s i o nd e e pt ot h ef a s c i aw a sm a d ew i t has c a l p e li nt h e s k i nl a y e ro nt h ec e n t r a ld o r s u mo fe a c hm o u s eu n d e rs t e r i l et e c h n i q u ea f t e rt h em o u s e w a sa n e s t h e t i z e db yi n t r a p e r i t o n e a li n j e c t i o nw i t hs o d i u mp e n t o b a r b i t a l a f t e ri n c i s i o n w a sm a d e ，e a c hm o u s ew a si n d i v i d u a l l yh o u s e di nac a g ea n df e dw i t hc o m m e r c i a l m o u s ec h o wa n dd i s t i l l e dw a t e rt op r e v e n tb a c t e r i a li n f e c t i o n a l lm i c ew e 他k e p tu n d e r a1 2 hl i g h t - d a r kc y c l ew i t hs p e c i f i cp a t h o g e n f r e ec o n d i t i o n sd u r i n gt h ee x p e r i m e n t s a f t e rt h ea n i m a l sw e r es a c r i f i c e db yc e r v i c a ld i s l o c a t i o na f t e ra n a e s t h e t i z a t i o na t6 h ， 1 2 h ，l d ，3 d ，5 d ，7 d ，1 0 da n d1 4 dp o s t - i n j u r y , 1 5 c m x l 0 c ms p e c i m e n sw e r et a k e nf r o m w o u n d e ds i t e s o n eh a l fo fe a c hs p e c i m e nw a su s e df o rh ea n di m m u n o f l u o r e s c e n t p r o c e d u r e ，a n da n o t h e rw a su s e df o rw e s t e r nb l o ta n dr e a l - t i m ep c r t h er e m a i n i n g5 m i c ew e r ea n e s t h e t i z e dw i t h o u ti n c i s i o na sc o n t r o l s t h el e v e lo fm g li nm o u s es k i n i n c i s e dw o u n dw a sd e t e c t e db yi m m u n o f l u o r e s c e n ts t a i n i n g ，w e s t e r nb l o ta n dr e a l - t i m e p c r ，a n dt h en o n - i n c i s e dm o u s es k i nw a su s e d 嬲c o n t r 0 1 t h en u m b e ra n dr a t i oo f m g l p o s i t i v ec e l l sw e r ec o u n t e da n da n a l y z e db ym i c r o s c o p e t h eb a n do p t i c a lv a l u e w a sa n a l y z e db ys o f t w a r eo fs c i o ni m a g e d a t aw e r ea n a l y z e db yt h eo n e - w a y a n o v au s i n gs p s sf o rw i n d o w s1 3 0 p 0 0 5w a s c o n s i d e r e d 弱s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t 1 k s u i t s m g l i m m u n o r e a c t i v i t yw a sd e t e c t e di ne p i d e r m i s ，h a i rf o l l i c l ea n ds e b a c e o u s g l a n di nn o r m a lm o u s es k i n ；m g li m m u n o s t a i n i n gw a sd e t e c t e di nn e u t r o p h i l si nt h e w o u n da n dp e r i p h e r a lr e g i o ni n a g e d6 1 2 h ；al a r g en u m b e ro fm g l - p o s i t i v e m a c r o p h a g e sw e r ei d e n t i f i e df r o ml dt o5 d ；a f t e r w a r d s ，t h em g l - p o s i t i v ec e l l sw e r e m o s t l ym y o f i b r o b l a s t s a t7 - 1 4 dp o s t - i n j u r y t h er a t i oo ft h em g l - p o s i t i v ec e l l s m a x i m i z e da t5 d t h er a t i oo f m g l - p o s i t i v en e u t r o p h i l s ，m a c r o p h a g e s o r m y o f i b r o b l a s t sw a sh i g h e s ta t1 2 h ，5 do r7 d ，r e s p e c t i v e l y t h eb a n d so fm g l e x p r e s s i o nw e r eo b s e r v e dt h r o u g h o u tt h ew o u n dh e a l i n gs t a g e sb yw e s t e r nb l o t ，a n d m a x i m i z e da t5 d a sar e s u l to fr e a l t i m ep c r ，m g l m r n ae x p r e s s i o nw a sn o t e d d u r i n ga l lt h ew o u n dh e a l i n gs t a g e s ，w h i c hw a sh i g h e s ta t5 dp o s t i n j u r y 4 c o n c l u s i o n s 1 m g li sd e t e c t e di ne p i d e r m i s ，h a i rf o l l i c l ea n ds e b a c e o u sg l a n do fc o n t r o l m o u s es k i n 2 t h e e x p r e s s i o n o fm g li so b s e r v e di n n e u t r o p h i l s ，m a c r o p h a g e s a n d m y o f i b r o b l a s t sd u r i n gs k i nw o u n dh e a l i n gi nm i c e 3 t h et i m e - d e p e n d e n te x p r e s s i o no fm g li nd i f f e r e n tc e l l sa n dm g l p r o t e i n a n dg e n em a yb eu s e df o r t h ew o u n d a g ed e t e r m i n a t i o no ft h ei n c i s e ds k i n k e y w o r d s w o u n da g ed e t e r m i n a t i o n ；s k i n w o u n d ；m g l ；n e u t r o p h i l ；m a c r o p h a g e ； m y o f i b r o b l a s t 5 英文縮略語 6 生理、病理過程【2 ，3 1 。 起初，在脂肪組織中，m g l 是一種用于催化脂肪轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x的三酸甘油脂的 酶。1 9 9 7 年，人們從小鼠脂肪組織中克隆出m g l 。2 0 0 2 年，d i n h 等人克隆出大鼠 和人腦組織中的m g l ，并證明m g l 水解花生四烯酸甘油酯( 2 - a g ) ，同時(shí)也證 實(shí)了m g l 是調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中內(nèi)源性大麻素水平非常重要的酶【4 1 。近些年來研 究證實(shí)，m g l 是一種重要的內(nèi)源性大麻素水解酶，主要作用是水解2 a g ，并可維 持內(nèi)源性大麻素內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。w a l t e r 等研究表明，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷時(shí)，損傷 的神經(jīng)組織中星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)m g l , 其不但能夠水解2 - a g 而且還能夠精確的 調(diào)節(jié)2 a g 的產(chǎn)生，起到保護(hù)損傷周圍正常神經(jīng)細(xì)胞的作用【5 1 。目前，尚未發(fā)現(xiàn)有 關(guān)m g 眩皮膚損傷愈合過程中的研究。 本研究在建立小鼠皮膚切創(chuàng)模型的基礎(chǔ)上，首次應(yīng)用免疫熒光染色技術(shù)檢測(cè) 小鼠皮膚切創(chuàng)愈合過程中m g 雌中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和肌纖維母細(xì)胞中的表達(dá) 情況及其表達(dá)的變化規(guī)律。并應(yīng)用w e s t e r nb l o t 和r e a l t i m ep c r 技術(shù)檢測(cè)正常及切 7 創(chuàng)后小鼠皮膚中m g l 蛋白和基因的表達(dá)情況以及表達(dá)的時(shí)間變化規(guī)律。探討m g l 在皮膚損傷愈合過程中的表達(dá)及其表達(dá)隨時(shí)間的變化規(guī)律，為進(jìn)一步研究應(yīng)用 m g l ( g 為推斷損傷時(shí)間的依據(jù)以及其在組織損傷中的作用機(jī)制奠定良好的基礎(chǔ)。 實(shí)驗(yàn)材料與方法 一、實(shí)驗(yàn)材料 ( 一) 主要試劑和材料 兔抗小鼠m g l 多克隆抗體( a b 2 4 7 0 1 )a b c a m 公司，英國(guó) 兔抗小鼠m p o 多克隆抗體( s o 3 3 5 9 6 ) s a n t ac r u z 公司，美國(guó) 大鼠抗小鼠f 4 8 0 單克隆抗體( s c 5 2 6 6 4 )s a n t ac r u z 公司，美國(guó) 兔抗小鼠a s m a 多克隆抗體( a b 5 6 9 4 )a b e a m 公司，英國(guó) 小鼠抗小鼠b - a c t i n 單克隆抗體( a 0 3 6 0 b m )s i g n a l c h e m 公司，加拿大 6 條帶預(yù)染蛋白m a r k e rf e r m e n t a s 公司，立陶宛 w e s t e r nb l o t i p 細(xì)胞裂解液 碧云天生物技術(shù)研究所 硝酸纖維素膜( p v d f ) 膜 m i l l i p o r e 公司，美國(guó) 乙二胺四乙酸二鈉廣州化學(xué)試劑廠 三羥甲基氨基甲烷( 1 h s )a m r e s c o 公司，美國(guó) 甘氨酸( g l y c i n e )a m r e s c o 公司，美國(guó) 過硫酸銨( a p s )a m r e s c o 公司，美國(guó) 十二烷基磺酸鈉( s d s )a m r e s c o 公司，美國(guó) t e m e da m r e s c o 公司，美國(guó) 丙烯酰胺( a c r )b b i 公司，美國(guó) e c l 發(fā)光試劑盒s a n t ac r u z 公司，美國(guó) 兔s p 檢測(cè)試劑盒( s p 9 0 0 1 )北京中杉金橋生物有限公司 3 氨丙基3 乙氧基甲硅烷( a p e s )北京中杉金橋生物有限公司 羅丹明標(biāo)記山羊抗兔i g g ( z f 0 3 1 6 )北京中杉金橋生物有限公司 f i t c 標(biāo)記山羊抗兔i g g ( z f 0 3 1 1 ) 北京中杉金橋生物有限公司 山羊抗兔i g g 辣根酶標(biāo)記( z b 2 3 0 1 ) 北京中杉金橋生物有限公司 山羊抗小鼠i g g 辣根酶標(biāo)記( z b 2 3 0 5 )北京中杉金橋生物有限公司 8 r n a i s op l u s p r i m e s c f i p t t mr tr e a g e n tk i t s y b r p r i m e s c r i p t t mr t - p c rk i t ( 二) 主要實(shí)驗(yàn)儀器 冰凍切片機(jī) 普通光學(xué)顯微鏡 熒光顯微鏡 勻漿儀 冰箱 載玻片 燒杯、量筒 調(diào)速多用振蕩器 電泳儀和轉(zhuǎn)印儀 b i o p h o t o m e t e r 分光光度計(jì) 計(jì)算機(jī)顯微圖像分析系統(tǒng) 臺(tái)式高速離心機(jī) 二、實(shí)驗(yàn)方法 ( 一) 動(dòng)物模型的制作及分組 t a k a r a 公司，日本 t a k a r a 公司，日本 t a k a r a 公司，日本 l e i c a 公司，德國(guó) o l y m p u s 公司，日本 o l y m p u s 公司，日本 i k a 公司，德國(guó) 美菱公司 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠 天津玻璃儀器廠 s o n i c sa n dm a t e r i a l s b 1 0 r a d e p p e n d o r f 公司，德國(guó) m e t a m o r p hi m a g i n gs y s t e m 上海安亭科學(xué)儀器廠 健康成年雄性b a l b e 小鼠4 5 只，體質(zhì)量3 5 - - 一4 0 9 ，隨機(jī)分為9 組。其中皮 膚切創(chuàng)分為8 個(gè)時(shí)間段組，另一組為對(duì)照組，每組均為5 只小鼠。腹腔注射戊巴 比妥鈉，背部剪毛處理后，常規(guī)手術(shù)消毒，在背部中央做一縱行長(zhǎng)1 5 c m 皮膚全 層切口，深達(dá)筋膜。傷后每只單獨(dú)飼養(yǎng)，避免細(xì)菌感染。分別于傷后6 h 、1 2 h 、 1 d 、3 d 、5 d 、7 d 、1 0 d 和1 4 d 將小鼠脫頸椎處死，取傷口處1 5 c m x l 0 c r a 皮膚組 織，對(duì)照組5 只小鼠麻醉后背部剪毛，不做切創(chuàng)，脫頸椎處死，取相同部位同等 大小皮膚。各組皮膚樣本被均分為兩部分，一部分用于h e 染色和免疫熒光染色， 另一部分用于w e s t e r nb l o t 和r e a l t i m ep c r 檢測(cè)。 ( 二) h e 染色 9 1 、冰凍切片制備 標(biāo)本經(jīng)多聚甲醛固定1 2 h ，自來水沖洗4 h ，梯度蔗糖( 1 0 、2 0 、3 0 ) 脫 水，o c t 包埋，制作5 # m 厚度連續(xù)切片，貼于經(jīng)a p e s 處理的載玻片上，待用。 2 、染色步驟 ( 1 ) 蒸餾水洗滌切片； ( 2 ) 蘇木素染色5 m i n ； ( 3 ) 在1 鹽酸酒精中分化后，自來水中返藍(lán)3 0 m i n ； ( 4 ) 1 伊紅染色l m i n ； ( 5 ) 室溫晾干，二甲苯透明，中性樹膠封片。 ( 三) 免疫熒光染色 l 、染色步驟 ( 1 ) p b s ( p h7 2 彳4 ) 洗滌切片，滴加正常山羊非免疫血清，室溫下保濕 盒內(nèi)封閉6 0 m i r a ( 2 ) 滴加用抗體稀釋液1 ：1 0 0 倍稀釋的兔抗小鼠m g l 多克隆抗體，保濕盒 內(nèi)4 0 c 孵育過夜； ( 3 ) p b s 洗滌切片5 m i n x 3 次，滴加相應(yīng)的熒光二抗，保濕盒內(nèi)孵育1 2 0 m i r a ( 4 ) p b s 洗滌切片后，抗熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡觀察； ( 5 ) 染色過程中以p b s 或非免疫血清替代一抗作為陰性對(duì)照； 2 、陽性細(xì)胞計(jì)數(shù) 顯微鏡x 4 0 0 倍下，損傷區(qū)及損傷周邊區(qū)每張切片中隨機(jī)選擇l o 個(gè)視野，計(jì) 數(shù)相鄰切片包括多形核粒細(xì)胞、單個(gè)核細(xì)胞及纖維細(xì)胞的細(xì)胞總數(shù)和陽性細(xì)胞數(shù)。 計(jì)算每個(gè)視野中陽性細(xì)胞數(shù)與細(xì)胞總數(shù)的百分比。采用s p s s l 3 0f o rw i n d o w s 軟 件，計(jì)量資料用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差( i s ) 表示，進(jìn)行單因素方差分析。 ( 四) 雙重免疫熒光染色 1 、染色步驟 ( 1 ) p b s ( p h7 2 7 4 ) 洗滌切片，滴加5 b s a ，室溫下保濕盒內(nèi)封閉6 0 m i n ； ( 2 ) 滴加用抗體稀釋液1 ：1 0 0 倍稀釋的兔抗小鼠m g l 多克隆抗體和m p o 1 0 ( 1 ：1 0 0 ) 或f 4 8 0 ( 1 ：5 0 ) 或a s m a ( 1 ：5 0 ) ，保濕盒內(nèi)4 0 c 孵育過夜； ( 3 ) p b s 洗滌切片5 m i n x 3 次，滴加相應(yīng)的熒光二抗，保濕盒內(nèi)孵育1 2 0 m i r a ( 4 ) p b s 洗滌切片后，抗熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡觀察； ( 5 ) 染色過程中以p b s 或非免疫血清替代一抗作為陰性對(duì)照； 2 、陽性細(xì)胞計(jì)數(shù) 顯微鏡x4 0 0 倍下，損傷區(qū)及損傷周邊區(qū)每張切片中隨機(jī)選擇1 0 個(gè)視野，分 別計(jì)數(shù)中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及肌纖維母細(xì)胞的細(xì)胞總數(shù)及其這三種細(xì)胞表達(dá)m g l 的細(xì)胞數(shù)。分別計(jì)算每個(gè)視野中m g l 陽性細(xì)胞數(shù)與該種細(xì)胞總數(shù)的百分比。采用 s p s s l 3 0f o rw i n d o w s 軟件，計(jì)量資料用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差( i s ) 表示，進(jìn)行單因 素方差分析。 ( 五) w e s t e r nb l o t 技術(shù)檢測(cè) 1 、蛋白樣品制備 ( 1 ) 將剪碎的皮膚組織檢材放入2 m le p 管中，加入裂解液和苯甲基磺酰氟 化物( p m s f ) ； ( 2 ) 冰上勻漿，超聲破碎； ( 3 ) 4 0 c 條件下1 2 0 0 0 r m i n ( 離心半徑9 3 5 c m ) 離心3 0 m i n ，提取上清液； ( 4 ) b c a 法【6 】進(jìn)行蛋白定量： ( 5 ) 計(jì)算每個(gè)損傷時(shí)間組含5 0 t g 總蛋白所需樣品體積，一2 0 。c 保存。 2 、實(shí)驗(yàn)步驟 ( 1 ) 灌膠：灌注1 2 分離膠，待分離膠凝固后，再灌注5 濃縮膠； ( 2 ) 蛋白變性：樣品加適量比例上樣緩沖液，混勻置于1 0 0 。c 金屬浴中加熱 5 m i n ，離心3 0 0 0 r m i n ，l m i m ( 3 ) 上樣：向泳道內(nèi)加入樣品( 含5 0 弘t g 總蛋白) 及分子量m a r k e r ； ( 4 ) 1 2 s d s p a g e 凝膠電泳，濃縮膠電壓設(shè)置為4 0 v ，時(shí)間3 0 m i n ，分離 膠電壓設(shè)置為1 0 0 v ，時(shí)間1 2 0 m i r a ( 5 ) 剝膠后把膠置于轉(zhuǎn)印緩沖液中，搖床中浸濕1 5 r a i n 后將濾紙浸入轉(zhuǎn)印緩 沖液中浸泡；將p v d f 膜放在甲醇中浸泡5 r a i n 后，放入轉(zhuǎn)印緩沖液中浸濕3 0 m i r a ( 6 ) 濕轉(zhuǎn)法，轉(zhuǎn)印電流設(shè)置為2 5 0 m a ，轉(zhuǎn)印時(shí)間2 h ； ( 7 ) t r b s 中洗膜，5 m i n x 2 次，將p v d f 膜浸入5 脫脂奶粉中，封閉2 h ， 室溫?fù)u床上進(jìn)行； ( 8 ) 加入一抗( 兔抗小鼠m g l 多克隆抗體，1 ：3 0 0 稀釋；或小鼠抗小鼠b - a c t i n 多克隆抗體，1 ：1 0 0 0 稀釋) ，塑料薄膜密封，4 。c 孵育過夜； ( 9 ) 洗膜t h 3 s 中5 m i n x 2 次，t b s 中5 m i n x l 次。然后加入二抗( 羊抗兔 i g g ，1 ：3 0 0 0 稀釋；或山羊抗小鼠i g g ，1 ：5 0 0 0 稀釋) 5 m l ，塑料薄膜密封，室溫 孵育2 h ； ( 1 0 ) 洗膜t i b s 中5 m i n x 2 次，t b s 中5 m i n x l 次，e c l 發(fā)光。 3 、判斷標(biāo)準(zhǔn) 以標(biāo)準(zhǔn)分子量m a r k e r 作指示，m g l 在3 5 k d 附近顯示陽性譜帶。利用s c i o n i m a g e 軟件分別檢測(cè)m g l 和b - a c t i n 蛋白表達(dá)的平均光密度值，二者之比作為 m g l 蛋白表達(dá)相對(duì)量。對(duì)各組的m g l 蛋白表達(dá)相對(duì)水平進(jìn)行單因素方差分析。 ( 六) r e a l t i m ep c r 技術(shù)檢測(cè) 1 、r n a 提取 ( 1 ) 將剪碎的皮膚組織( 1 0 0 m g ) 檢材放x , 2 m le p 管中，加入l m lr n a i s op l u s ， 1 2 0 0 0 x g ，4 0 c 離心5 m i n ； ( 2 ) 取上清液，加入2 0 0 d 氯仿，1 2 0 0 0 x g ，4 。c 離心1 5 m i n ； ( 3 ) 取上清液，加入等體積的異丙醇，1 2 0 0 0 x g ，4 。c 離心l o m i n ； ( 4 ) 棄上清，保留沉淀，加入l m l 的7 5 乙醇清洗沉淀； ( 5 ) 棄上清，保留沉淀，干燥，溶解于3 跏l 的d e p c 水中； ( 6 ) 測(cè)r n a 的o d 值( a 2 6 0 a 2 8 0 ) 。 2 、逆轉(zhuǎn)錄和r e a l - t i m ep c r 過程 ( 1 ) 按p r i m e s c r i p t t mr tr e a g e n t sk i t 說明，配制2 0 a 反應(yīng)體系，置p c r 儀 中，3 7 0 c 孵育1 5 m i n ，將m r n a 逆轉(zhuǎn)錄成c d n a ； ( 2 ) 反應(yīng)所需特異性引物見表1 。應(yīng)用a p p l i e db i o s y s t e m s7 5 0 0r e a l t i m e p c r s y s t e m 進(jìn)行擴(kuò)增。2 0 p l 反應(yīng)體系組成如下：6 跏ld h 2 0 ，l o a ls y b r p r e m i x 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 一、小鼠皮膚切創(chuàng)的宏觀所見 小鼠皮膚切創(chuàng)后創(chuàng)口哆開伴明顯出血及滲液。傷后6 h ，創(chuàng)口稍干燥。傷后1 2 h ， 可見創(chuàng)口已少量結(jié)痂( 照片l a ) 。傷后l d ，創(chuàng)口已無滲血、滲液，創(chuàng)口皮膚干燥， 可見完整痂皮。傷后3 d ，創(chuàng)緣皮膚收縮、平整，紅腫消退( 照片l b ) 。傷后5 7 d ，痂皮與創(chuàng)緣皮膚分離，部分已剝脫，創(chuàng)口表面由增生的上皮覆蓋，可見皮下 紅色肉芽組織( 照片l c ) 。傷后l o d ，創(chuàng)口已呈線形愈合，無滲出，并明顯短縮。 傷后1 4 d ，創(chuàng)口已完全愈合，僅留線狀瘢痕，部分小鼠創(chuàng)口皮膚稍隆起，質(zhì)地較 韌( 照片l d ) 。 二、小鼠皮膚切創(chuàng)的病理組織學(xué)改變 傷后6 h ，可見創(chuàng)緣有部分上皮胞漿均質(zhì)化，胞核消失，真皮內(nèi)多核粒細(xì)胞浸 潤(rùn)增多。傷后1 2 h ，見皮下組織內(nèi)有大量滲出的多核粒細(xì)胞及單個(gè)核細(xì)胞( 照片 2 a 、2 b ) 。傷后1 d ，可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，以單個(gè)核細(xì)胞為主。傷后3 d ，創(chuàng)口 結(jié)痂，肉芽組織形成，多形核粒細(xì)胞明顯減少，梭形成纖維細(xì)胞開始增生( 照片 2 c 、2 d ) 。傷后5 d ，可見單個(gè)核細(xì)胞和大量的梭形成纖維細(xì)胞，肉芽組織向創(chuàng)腔內(nèi) 機(jī)化。傷后7 d ，肉芽組織內(nèi)可見大量梭形成纖維細(xì)胞和新生毛細(xì)血管( 照片3 a 、 1 3 3 b ) 。傷后1 0 1 4 d ，創(chuàng)口基本愈合，損傷區(qū)及損傷周邊區(qū)內(nèi)的單個(gè)核細(xì)胞逐漸減 少，間質(zhì)增多，肉芽組織向瘢痕組織轉(zhuǎn)變，表皮完全覆蓋創(chuàng)口( 照片3 c 、3 d ) 。 三、m g l 免疫熒光染色 對(duì)照組小鼠皮膚的表皮、毛囊、皮脂腺均有m g l 的表達(dá)( 照片4 a ) 。以p b s 代替一抗，無m g l 表達(dá)。皮膚切創(chuàng)傷后6 - - 1 2 h ，m g l 主要在多形核粒細(xì)胞中表 達(dá)( 照片4 b ) 。隨著損傷時(shí)間的延長(zhǎng)，陽性多形核粒細(xì)胞逐漸消失。傷后l 5 d ， 大量單個(gè)核細(xì)胞和成纖維樣細(xì)胞顯示m g l 的陽性反應(yīng)( 照片4 c ) 。傷后7 - - 1 4 d ， 創(chuàng)口基本愈合，損傷區(qū)及損傷周邊區(qū)m g l 陽性染色主要以成纖維細(xì)胞為主( 照 片4 d ) 。傷后1 4 d 仍然可見一些陽性的成纖維樣細(xì)胞和少量的單核細(xì)胞。小鼠皮 膚切創(chuàng)后各時(shí)間段的m g l 陽性細(xì)胞百分率參見圖1 ，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析參見表2 。 四、雙重免疫熒光染色 皮膚切創(chuàng)傷后6 1 2 h ，m g l 在中性粒細(xì)胞中呈現(xiàn)陽性反應(yīng)( 照片5 ) 。傷后 l 5 d ，大量巨噬細(xì)胞顯示m g l 的陽性反應(yīng)( 照片6 ) 。傷后7 1 4 d ，創(chuàng)口基本 愈合，損傷區(qū)及損傷周邊區(qū)m g l 陽性染色主要以肌纖維母細(xì)胞為主( 照片7 ) 。 中性粒細(xì)胞表達(dá)m g l 從6 h 開始增高，到1 2 h 達(dá)高峰，3 d 開始逐漸減少；巨噬細(xì) 胞表達(dá)m g l 5 d 達(dá)高峰；肌纖維母細(xì)胞從3 d 開始出現(xiàn)，其表達(dá)m g l 7 d 達(dá)高峰。 小鼠皮膚切創(chuàng)后不同細(xì)胞不同時(shí)間段表達(dá)m g l 陽性細(xì)胞百分率參見圖2 。 五、w e s t e r nb i o t 檢測(cè)分析 以6 - a c t i n 為內(nèi)參( 分子量約為4 2 k d ) ，m g l 在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組均有陽性條帶， 位于3 5 k d ，各實(shí)驗(yàn)組的m g l 蛋白的表達(dá)強(qiáng)度呈現(xiàn)一定的時(shí)間規(guī)律性，從6 h 開始 增高，于5 d 達(dá)到高峰，隨后開始降低( 照片8 ) 。m g l 蛋白相對(duì)表達(dá)水平( 孑j ) 參見圖3 ，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果參見表3 。 六、r e ai - tim ep c r 檢測(cè)分析 以6 - a c t i n 為內(nèi)參，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組均有m g l 基因表達(dá)，且b a c t i n 和m g l 基因的融解曲線呈單峰，融解溫度分別為8 7 0 c 和8 6 0 c ( 圖4 ) 。采用c t 法 比較，各實(shí)驗(yàn)組的m g l 基因的表達(dá)強(qiáng)度呈現(xiàn)一定的時(shí)間規(guī)律，即5 d 為表達(dá)的高 峰期。m g l 基因相對(duì)表達(dá)水平( 孑s ) 參見圖5 ，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果參見表4 。 1 4 表1 ，m g l 和b - a c t i n 特異性引物序列和產(chǎn)物長(zhǎng)度 損傷時(shí)間細(xì)胞總數(shù)陽性細(xì)胞率( ) c o n t r o l 3 0 6 3 1 ”9 1 7 + _ 0 7 5 ” 6 h 5 9 7 3 6 3 0 7 9 2 1 8 1 2 h 9 9 9 5 3 。4 2 2 7 + _ 1 8 1 。 1 d8 5 4 + 4 7 3 2 1 6 _ + 2 2 7 。 3 d8 4 9 6 64 0 2 1 1 3 6 5 d9 0 i 1 5 55 4 7 2 1 6 4 7 d1 1 6 7 7 5 51 9 2 2 0 2 。 1 0 d1 3 2 3 7 2 3 1 5 8 2 1 2 1 4 d 1 0 9 5 4 7 1 9 9 3 _ + 1 0 5 幸宰與對(duì)照組比較，p 0 0 1 ；書與相鄰上組比較，p 0 0 5 。 表3 ，小鼠皮膚切創(chuàng)后各時(shí)間段m g l 蛋白表達(dá)相對(duì)水平( n = 5 ，i - i - s ) 損傷時(shí)間蛋白表達(dá)相對(duì)水平 c o n t r o l0 7 4 _ + 0 0 3 ” 6 h 2 0 0 + _ 0 1 1 1 2 h 2 1 3 + _ 0 1 2 1 d 2 0 7 o 1 1 3 d 1 9 9 0 0 7 5 d 2 4 5 _ + 0 1 4 7 d1 7 5 0 0 8 1 0 d1 6 8 _ + 0 0 6 1 4 d1 0 0 _ + 0 0 2 幸宰與對(duì)照組比較，p o 0 1 ；拳與相鄰上組比較，p 0 0 5 。 1 5 表4 ，小鼠皮膚切創(chuàng)后各時(shí)間段m g l 基因表達(dá)相對(duì)水平( n = 5 ，i s ) 事與對(duì)照組比較，尸 0 0 1 ；宰與相鄰上組比較，p o 0 5 。 j 、 邑 得 霉 舞 趔 盛 6 0 4 0 2 0 o 1 母 、_ ， 褥 熏 掣約 醫(yī) o i i n i j t i c o n t r o l6 h1 2 hl d3 d5 d7 d1 0 d1 4 d 損傷時(shí)間 圖1 ，小鼠皮膚切創(chuàng)后各時(shí)間段m g l 的陽性細(xì)胞率 口中性粒細(xì)胞 口巨噬細(xì)胞 肌纖維母細(xì)胞 c o n t r o l6 h1 2 h