畢業(yè)論文答辯-從林蛙皮中提取膠原蛋白的方法比較.ppt

從林蛙皮中提取膠原蛋白的方法比較,學(xué)院：化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院專業(yè)：食品科學(xué)與工程姓名：指導(dǎo)老師：,目錄,圖1林蛙,一.研究意義,中國(guó)林蛙，屬于兩棲類珍稀動(dòng)物，林蛙以其獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與藥用價(jià)值日益受到人們的重視。林蛙富含多種氨基酸、激素、微量元素和維生素等營(yíng)養(yǎng)成分，在藥用、滋補(bǔ)和美容等方面都具有非常高的利用價(jià)值。,我國(guó)林蛙資源十分豐富，近年來(lái)關(guān)于中國(guó)林蛙的相關(guān)研究也越來(lái)越多，但人們過(guò)于粗放式的大量采集蛤士蟆油的同時(shí)，將林蛙其他的寶貴資源作為廢棄物丟棄十分可惜，既污染環(huán)境，又無(wú)法充分發(fā)揮林蛙的藥用和保健價(jià)值。林蛙皮是摘取林蛙油后作為飼料或廢棄物的物質(zhì)，富含多種生物活性物質(zhì)，具有很高的綜合利用價(jià)值。從林蛙皮中提取膠原蛋白方法比較的研究必將拓寬中國(guó)林蛙開發(fā)和利用的新途徑，不僅能豐富我國(guó)的藥用資源，還將為帶動(dòng)林蛙產(chǎn)業(yè)的工業(yè)化生產(chǎn)帶來(lái)貢獻(xiàn)和影響。,二.研究?jī)?nèi)容,本試驗(yàn)研究的三個(gè)階段,膠原蛋白的方法從林蛙皮中提取,三.實(shí)驗(yàn)部分,1.膠原蛋白的提取工藝方法,2.對(duì)二甲氨基苯甲醛法測(cè)定林蛙皮中膠原蛋白的含量,相關(guān)試劑0.75%氯化亞錫溶液氯胺T試劑對(duì)二甲氨基苯甲醛試劑羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液A，500g/ml：準(zhǔn)確稱取羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品50.0mg，用少量水溶解于100ml容量瓶中，加入一滴3mol/L硫酸，定容至刻度。羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液B，10g/ml：吸取5ml羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液A于250容量瓶中，用蒸餾水稀釋定容至刻度。羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作液：吸取2ml羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液A及40ml羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液B于100ml容量瓶中，用蒸餾水稀釋定容至刻度。,羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制,表1羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制,取具塞試管24支，三支一組編號(hào)從0至7（每組三支為平行樣），第0組作為對(duì)照組。按照表1所示加入相應(yīng)試劑后，搖勻后迅速將試管移至60的水浴鍋中，保溫20min，再用流動(dòng)的自來(lái)水冷卻試管至少3min，室溫下放置30min，最后用紫外可見分光光度計(jì)在560nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立線性回歸方程。,膠原蛋白提取的含量測(cè)定,式中：W樣品中膠原蛋白含量，mg/g；A標(biāo)準(zhǔn)曲線上相應(yīng)的羥脯氨酸濃度，g/ml；11.1換算系數(shù)；m稱取樣品質(zhì)量。,公式計(jì)算,根據(jù)公式可知，測(cè)定樣品中膠原蛋白含量在稱取等量樣品且稀釋倍數(shù)相同的情況下與羥脯氨酸含量成正比。,3.結(jié)論與討論,圖2對(duì)二甲氨基苯甲醛法測(cè)定膠原蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線,羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制,膠原蛋白提取試驗(yàn)結(jié)果比較與討論,表2五種方法提取膠原蛋白所得浸提液中羥脯氨酸含量,由于樣品中膠原蛋白含量在稱取等量樣品且稀釋倍數(shù)相同的情況下與羥脯氨酸含量成正比，因此羥脯氨酸含量最高的一組即為膠原蛋白含量最高的一組，該方法即為最佳提取方法。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果對(duì)五種方法浸提膠原膠原蛋白的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，通過(guò)分析表明在同樣提取條件下酸法提取羥脯氨酸含量最高，即酸法為從林蛙皮中提取膠原蛋白的最優(yōu)方法。,4.最佳提取方法的工藝優(yōu)化,單因素試驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，選取檸檬酸、鹽酸、冰醋酸分別為提取劑，在相同條件下，用檸檬酸提取所得浸提液中羥脯氨酸含量最高，故本實(shí)驗(yàn)采用檸檬酸作為浸提溶劑。,1.提取溶劑的選擇,圖3提取溶劑對(duì)膠原提取的影響,2.液料比對(duì)膠原提取的影響,圖4液料比對(duì)膠原提取的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)液料比超過(guò)201時(shí)浸提液中羥脯氨酸含量在逐漸降低?？赡苁谴藭r(shí)檸檬酸溶液對(duì)膠原的溶解已經(jīng)趨于飽和，過(guò)多的檸檬酸用量不能有效增加提取率，反而因?yàn)闄幟仕嵊昧康脑龆嘟档土四z原蛋白在溶劑中的濃度，使浸提液羥脯氨酸含量有所下降。,3.檸檬酸溶液濃度對(duì)膠原提取的影響,圖5檸檬酸濃度對(duì)膠原提取的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著檸檬酸溶液濃度的提高，浸提液中羥脯氨酸含量逐漸升高，原因可能是隨著提取劑濃度的增加，膠原蛋白的溶解度增加；但當(dāng)檸檬酸濃度超過(guò)0.1mol/L時(shí)，浸提液中羥脯氨酸含量逐漸降低，可能是此時(shí)檸檬酸溶液對(duì)膠原的溶解已經(jīng)趨于飽和，過(guò)高的檸檬酸濃度不能有效增加提取率，反而降低了膠原蛋白在溶劑中的濃度。,4.提取時(shí)間對(duì)膠原提取的影響,圖6提取時(shí)間對(duì)膠原提取的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著浸提時(shí)間的增加，浸提液中羥脯氨酸含量逐漸增加。但當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)48h以后，浸提液出現(xiàn)變味酸敗，蛙皮上有部分被霉菌感染，因此60h及72h兩組試驗(yàn)均被直接否定。,5.提取溫度對(duì)膠原提取的影響,圖7提取溫度對(duì)膠原提取的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在37之前，浸提液中羥脯氨酸含量隨溫度上升而增高，但當(dāng)溫度超過(guò)37時(shí)，羥脯氨酸含量反而下降，這可能與膠原蛋白的溶解度有關(guān)?？赡苁堑蜏貢r(shí)提高溫度使分子動(dòng)能增加，提高了溶質(zhì)擴(kuò)散的速率，導(dǎo)致膠原溶解度的增加；但當(dāng)溫度高于37時(shí)，由于反應(yīng)是放熱反應(yīng)，溶解度隨溫度升高而減少。,正交試驗(yàn),在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取四個(gè)主要影響因素：液料比、檸檬酸濃度、提取時(shí)間、提取溫度，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，因素水平見表3，以浸提液中羥脯氨酸含量為指標(biāo)，確定最佳提取工藝。,表3正交試驗(yàn)表,表4正交試驗(yàn)結(jié)果表,四.實(shí)驗(yàn)結(jié)論,本研究對(duì)從林蛙皮中膠原蛋白的提取方法進(jìn)行了比較，分別利用熱水法、酸法、堿法、酶法及鹽法對(duì)林蛙皮中膠原蛋白進(jìn)行了提取，通過(guò)使用等量林蛙皮，等量浸提液，并取等量部分浸提液利用對(duì)二甲氨基苯甲醛法對(duì)浸提液中膠原含量進(jìn)行了測(cè)定，經(jīng)試驗(yàn)表明酸法為最佳提取方法。在得出酸法為最佳提取方法后，對(duì)試驗(yàn)工藝進(jìn)行優(yōu)化，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，經(jīng)正交試驗(yàn)確定了酸法提取的最佳工藝條件：檸檬酸濃度0.1mol/L，提取溫度37，提取時(shí)間48h，液料比為20:1。,本文是在導(dǎo)師邱芳萍老師悉心指導(dǎo)和大力支持下完成的。邱老師以其嚴(yán)謹(jǐn)求實(shí)的科學(xué)態(tài)度、實(shí)事求是的科研作風(fēng)深深地感染和激勵(lì)著我，她淵博的知識(shí)、開闊的視野和敏銳的思維給了我深深的啟迪，令我終生受用。其次，感謝王志兵老師在論文試驗(yàn)和撰寫過(guò)程中給出寶貴的意見和建議。王老師不僅是我求學(xué)路上的良師，更是我生活中的益友，在此對(duì)王老師四年來(lái)的幫助表示深深的感謝。再次，在整個(gè)試驗(yàn)的設(shè)計(jì)和實(shí)施過(guò)程中，